PCSK9介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路致小鼠肝臟脂肪變性的機(jī)制研究

余小林 房彬彬 劉 芬 李文玲 陳邦黨 高曉明 楊毅寧

前蛋白轉(zhuǎn)換酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)在維持膽固醇穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[1,2]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示,PCSK9的生物學(xué)作用遠(yuǎn)不僅限于低密度脂蛋白受體的動(dòng)態(tài)平衡,其獨(dú)立于低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)的機(jī)制也涉及其中,尤其與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥關(guān)系密切[3～5]。然而,肝臟作為PCSK9主要的產(chǎn)生地,PCSK9升高對(duì)肝臟本身有無(wú)不良的病理生理學(xué)作用,目前相關(guān)研究仍有爭(zhēng)議[6～8]。本研究通過(guò)探討PCSK9在小鼠肝臟對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝及炎性細(xì)胞因子的可能作用及機(jī)制,以期為非酒精性脂肪性肝病的治療提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

1.動(dòng)物分組及飼養(yǎng):本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):IACUC-20200318-92)。雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自上海南方模式動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(滬)2019-0002],8～10周齡,體質(zhì)量為18～20g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物轉(zhuǎn)入新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物模式中心,自由進(jìn)食、水,12h晝夜燈光開閉。采用隨機(jī)數(shù)字表法將36只小鼠平均分為空白組、GFP組和PCSK9組。于小鼠周齡10～12周,體質(zhì)量為20～25g時(shí),以AAV8.2為載體構(gòu)建GFP和人源PCSK9經(jīng)鼠尾靜脈轉(zhuǎn)染至小鼠肝臟穩(wěn)定表達(dá)。高脂飼料購(gòu)自北京科奧生物(脂肪20%,膽固醇1.25%,膽酸鈉0.5%),經(jīng)尾靜脈轉(zhuǎn)染2×1011vg/只 AAV8.2-GFP 12只作為GFP組,12只小鼠轉(zhuǎn)染2×1011vg/只 AAV8.2-hPCSK9 作為PCSK9組[9]。同期普食飼養(yǎng)12只小鼠作為空白組。構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病模型。飼養(yǎng)至24周,經(jīng)模型小鼠肝臟病理HE染色并光鏡下觀察肝臟氣球樣變性及肝臟油紅O染色判定模型構(gòu)建是否成功。

2.ELISA法檢測(cè)血清PCSK9、IL-1β水平:建模至24周后,提前禁食12h,戊巴比妥麻醉生效后,經(jīng)下腔靜脈采血,離心取血漿凍存至-80℃冰箱待測(cè),檢測(cè)小鼠PCSK9(批號(hào):P289194)及人源PCSK9(批號(hào):P211478)ELISA試劑盒,購(gòu)自美國(guó)R&D公司。IL-1β ELISA試劑盒(批號(hào):E0563m),購(gòu)自武漢伊艾博科技有限公司。血脂4項(xiàng)檢測(cè)(批號(hào):202110630)購(gòu)自南京生物建成研究所。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(批號(hào):140221002),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(批號(hào):140121005),購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

3.流式細(xì)胞術(shù):小鼠淋巴細(xì)胞分離液Percoll購(gòu)自美國(guó)GE公司;流式細(xì)胞抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司:NK1.1-PE cy7,CD3-FITC,CD4-Brilliant Violet 605,CD8a-APC cy7,TNF-α-PerCP/cyanine5.5,INF-β-APC,IL-2-PE/Dazzle 594, IL-4-PE, GrB-Brilliant Violet421。建模24周后,每組隨機(jī)選取6只小鼠,40% Precool梯度離心分離收集肝臟淋巴細(xì)胞。每只小鼠分別取1×106/ml肝臟單核細(xì)胞,加入含稀釋后的1640 EPMI培養(yǎng)基及細(xì)胞刺激劑,37℃孵育箱孵育4h。離心棄上清,加入CD16/32封閉30min。然后經(jīng)流式抗體外標(biāo)、固定、破膜、離心穿孔、內(nèi)標(biāo),上機(jī)檢測(cè)。

4.Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá):按照蛋白提取試劑說(shuō)明書,提取RAW264.7細(xì)胞總蛋白,經(jīng)BCA定量后,凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用牛血清白蛋白封閉膜1h,然后分別用一抗孵育:ABCA1 (1∶1000)、 CD36 (1∶1000)、 LDLR (1∶500)、 P50 (1∶300)、 p65 (1∶500)、 GAPDH(1∶5000),以上抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。p-p65 (1∶1000)、 TLR4(1∶1000)、 IκBα(1∶1000)、 p IκBα(1∶1000)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。4℃孵育過(guò)夜。次日,利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫下孵育1h,最后用ECL試劑盒顯色。Image J軟件分析各條帶灰度值,上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

5.肝臟病理切片及染色:取小鼠肝臟組織,4%多聚甲醛固定、OCT包埋。肝臟冷凍切片ORO(8μm),石蠟切片(4μm)用于HE和SRS。免疫組化: CD68購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(ab125212),稀釋倍數(shù)(1∶300),取肝組織病理切片(4μm)按標(biāo)準(zhǔn)免疫組化流程試驗(yàn)并顯色。在光鏡下觀察肝臟組織切片。使用Image J軟件計(jì)算肝臟氣球樣變性、ORO及SRS陽(yáng)性百分比及單位面積內(nèi)CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

結(jié) 果

1.血脂及肝功能檢測(cè):比較模型小鼠建模后(24周)時(shí)各組間血脂水平及肝功能,過(guò)表達(dá)人源PCSK9后,造成模型小鼠顯著血脂紊亂,與GFP組比較,表現(xiàn)為PCSK9組呈現(xiàn)顯著的高膽固醇、高低密度脂蛋白水平(P<0.001)以及高密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低(P<0.05),而甘油三酯在GFP組與PCSK9均顯著高于空白組(P<0.01),但GFP組與PCSK9組組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1中A～D)。與GFP組比較,PCSK9組血漿天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶顯著升高(P<0.05,圖1中 E、F)。

圖1 各組小鼠24周血漿中血脂4項(xiàng)及肝功能比較A、B、C、D依次為各組間血漿總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白水平比較;E、F依次為各組間天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平比較

2.ELISA分析:轉(zhuǎn)染hPCSK9后,PCSK9組小鼠總PCSK9水平顯著升高748.0±77.4pg/ml, GFP組113.5±18.8pg/ml(P<0.05), 空白組54.8±8.7pg/ml(P<0.001)。空白組測(cè)得IL-1β(7.92±0.89pg/ml),與GFP組(11.37±1.08pg/ml)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而PCSK9組IL-1β顯著增高 24.05±2.95pg/ml(P<0.05,圖2)。

圖2 ELISA法檢測(cè)小鼠24周血漿中總PCSK9及IL-1β水平A.PCSK9水平為鼠源+人源PCSK9血漿水平之和(n=8); B.各組IL-1β血漿水平(n=12)

3.肝臟組織病理學(xué)染色:小鼠肝臟組織HE染色顯示,空白組HE染色未發(fā)現(xiàn)氣球樣變性。PCSK9組肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣空泡化變大、增多百分比明顯高于GFP組(28.12%±4.07% vs 9.45%±1.83%,P=0.002)。與空白組(3.82%±0.77%)、GFP組(14.25%±1.63%)比較,PCSK9組(29.64%±1.67%)肝組織ORO染色百分比顯示脂質(zhì)蓄積明顯增高(P均<0.001)。與空白組、GFP組比較,SRS染色顯示PCSK9組非匯管區(qū)膠原纖維百分比顯著增多(0.88%±0.09%、1.75%±0.20%、4.58%±0.31%,P均<0.05,圖3)。

圖3 小鼠肝臟組織病理及染色A.小鼠肝臟組織病理切片(石蠟切片:蘇木精-伊紅、SRS染色4μm;冷凍切片:ORO染色8μm);黑色箭頭所指為氣球樣變,藍(lán)色箭頭所指為脂滴,紫色箭頭所指為非匯管區(qū)纖維化;B.GFP組與PCSK9組氣球樣變性百分比(空白組無(wú)氣球樣變性);C.3組間SRS染色百分比;D.3組間ORO染色百分比(n=6)

4.免疫組化研究: CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析顯示,空白組與GFP組比較,CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(33±2個(gè) vs 49±7個(gè),P>0.05),CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在PCSK9組顯著增多(49±7個(gè) vs 99±10個(gè),P<0.001,圖4)。

5.流式細(xì)胞術(shù):小鼠肝臟淋巴細(xì)胞各亞群及炎性細(xì)胞因子劃門方案,以CD4+為例(圖5)。CD3+、CD4+、CD8+亞群在GFP組與PCSK9組間百分比比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而在NK細(xì)胞亞群中組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03,表1);在CD4+、CD8+細(xì)胞群中,IL-2及TNF-α炎性細(xì)胞因子百分比,PCSK9組顯著高于GFP組(P<0.05,表2),但I(xiàn)L-2在NK亞群中,PCSK9組顯著低于GFP組(P<0.05),提示在NK細(xì)胞群中,過(guò)表達(dá)PCSK9可能誘發(fā)了機(jī)體自然殺傷細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。而抗炎性細(xì)胞因子IL-4在各細(xì)胞群中比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),INF-γ及GrB也在各亞群中組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。

表1 GFP組與PCSK9組肝臟淋巴細(xì)胞亞群比較

表2 GFP組與PCSK9組肝臟淋巴細(xì)胞亞群炎性細(xì)胞因子百分比比較

6.Western blot法檢測(cè):PCSK9通過(guò)溶酶體顯著降解LDLR蛋白水平,上調(diào)TLR4蛋白水平,并促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1上調(diào)介導(dǎo)膽固醇代謝,同時(shí)PCSK9上調(diào)清道夫受體CD36蛋白水平誘導(dǎo)單核-吞噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬。PCSK9介導(dǎo)TLR4蛋白激活p-IκBα,繼而從上游激活NF-κB途徑信號(hào)通路,導(dǎo)致p-p65蛋白顯著增加(圖6)。以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

圖6 PCSK9對(duì)膽固醇流出蛋白、清道夫受體蛋白、NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響A.Western blot法檢測(cè)膽固醇流出蛋白、LDLR蛋白、清道夫受體蛋白、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白根據(jù)各蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(依據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量);B～J.各目的蛋白統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖

討 論

PCSK9作為調(diào)控膽固醇脂質(zhì)代謝的重要靶標(biāo),長(zhǎng)期以來(lái),大量研究集中在血脂代謝、動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制等方面,較少研究關(guān)注PCSK9通過(guò)旁分泌參與肝臟代謝機(jī)制。Oleaga等[10]研究顯示,單次注射PCSK9抑制劑可增加血漿PCSK9水平至少12h,通過(guò)肝臟特殊的免疫回路反射性升高PCSK9水平,這種現(xiàn)象是否對(duì)肝臟本體造成不良影響,目前尚無(wú)明確的結(jié)論。Ruscica等[11]對(duì)非酒精性脂肪肝人群研究顯示,循環(huán)PCSK9水平與肝臟脂肪蓄積相關(guān)。高脂飲食本身會(huì)引起小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪變性[12]。通過(guò)肝臟大體病理學(xué)及油紅O、HE染色,GFP組小鼠自身也有肝脂肪變性,但在同等高脂飼料條件下,PCSK9組小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積、氣球樣變性及纖維化程度明顯增多、增大,肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)紊亂在PCSK9組顯著增強(qiáng),可能機(jī)制之一為PCSK9誘導(dǎo)血脂代謝紊亂,本研究中,過(guò)表達(dá)PCSK9造成顯著脂質(zhì)代謝紊亂,主要表現(xiàn)為總膽固醇、低密度脂蛋白升高及高密度脂蛋白膽固醇降低,并且在PCSK9組中血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均顯著升高。

Th1和Th2作為機(jī)體活化的T淋巴細(xì)胞,Th1細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子,以促進(jìn)炎性反應(yīng)為主,介導(dǎo)細(xì)胞免疫;而Th2分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子,與體液免疫反應(yīng)有關(guān),以抑制炎性反應(yīng)為主,Th1向Th2細(xì)胞的偏移被認(rèn)為與免疫抑制相關(guān),Sun等[13]研究顯示,肝臟炎癥在肝臟脂肪變性向非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,不同亞群炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)是NAFLD的標(biāo)志,高脂飲食驅(qū)使M1型巨噬細(xì)胞分泌TNF-α誘發(fā)炎癥。

本研究中肝臟組織免疫組化研究顯示,與GFP組比較,過(guò)表達(dá)PCSK9導(dǎo)致CD68陽(yáng)性細(xì)胞在肝臟組織中更顯著的浸潤(rùn),提示NAFLD與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)研究進(jìn)一步明確了在CD4+及CD8+亞群中,致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-2在PCSK9組顯著高于GFP組,進(jìn)一步揭示了過(guò)表達(dá)PCSK9造成肝臟自身炎性細(xì)胞因子浸潤(rùn),加速了高脂飲食狀態(tài)下肝細(xì)胞脂肪變性的病理進(jìn)程。然而在NK亞群中,PCSK9組IL-2百分比低于GFP組,分析可能為NK細(xì)胞被IL-2刺激增殖后的過(guò)渡免疫應(yīng)答效應(yīng),以此通過(guò)局部競(jìng)爭(zhēng)IL-2來(lái)抑制CD8+T淋巴細(xì)胞增殖,從而限制肝臟免疫病理的進(jìn)一步惡化[14]。TNF-α在免疫調(diào)節(jié)中啟到雙刃劍作用,一方面,適宜水平的TNF-α可介導(dǎo)正常免疫低于細(xì)菌感染、促進(jìn)組織修復(fù);另一方面,過(guò)高的TNF-α水平導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、誘發(fā)炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴,而IL-4作為初始的Ⅰ型免疫反應(yīng)后,介導(dǎo)肝臟巨噬細(xì)胞活化和增殖以應(yīng)對(duì)組織損傷的修復(fù)[15～17]。本研究顯示,與GFP組比較,PCSK9組中CD4亞群中IL-4水平呈升高趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,推測(cè)過(guò)表達(dá)PCSK9弱化了Ⅰ型免疫介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化,導(dǎo)致IL-4沒(méi)有顯著升高來(lái)應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性、肝脂質(zhì)的蓄積。

為了排除飲食不均一性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可能影響,筆者在RAW264.7細(xì)胞系中,進(jìn)一步對(duì)可能的潛在機(jī)制進(jìn)行了深入探討。PCSK9介導(dǎo)膽固醇流出蛋白(ABCA1)加速膽固醇代謝紊亂,通過(guò)溶酶體途徑結(jié)合細(xì)胞膜表面的LDLR受體,跨膜至細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解,導(dǎo)致LDLR受體顯著降低[18,19]。進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂,激活了循環(huán)系統(tǒng)中單核細(xì)胞,并反向募集至肝臟本體,肝臟代謝失衡后脂肪在肝臟蓄積,巨噬細(xì)胞(CD68)浸潤(rùn),由此上調(diào)了清道夫受體CD36誘導(dǎo)單核-吞噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬。Toll樣受體是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子,PCSK9在上游顯著增加了TLR4蛋白水平,繼而激活磷酸化IKB(,上調(diào)NF-κB磷酸化p65蛋白,導(dǎo)致下游炎性細(xì)胞反應(yīng)[20,21]。本研究中NF-κB下游系列炎性反應(yīng)由流式細(xì)胞術(shù)及ELISA研究證實(shí),肝臟單核細(xì)胞內(nèi)致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IL-2顯著升高,而抗炎性細(xì)胞因子IL-4被抑制。

綜上所述,PCSK9誘發(fā)脂質(zhì)代謝失衡并介導(dǎo)清道夫受體CD36表達(dá)增加、激活TLR4-IκBα-NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致下游促炎性細(xì)胞因子顯著增加加速了小鼠肝臟脂肪代謝失衡及肝臟脂肪變性。

本研究存在一定的局限性,應(yīng)用PCSK9抑制劑或單克隆抗體能否逆轉(zhuǎn)肝臟自身炎性細(xì)胞因子浸潤(rùn),在今后的研究中可在PCSK9基因敲除模型中進(jìn)一步予以驗(yàn)證。