NR1D1介導低氧誘導的PASMCs異常增殖和遷移*

白焰平， 王明亮， 甘雪晴， 孫雄山， 趙嘉琪， 陳杰

NR1D1介導低氧誘導的PASMCs異常增殖和遷移*

白焰平1， 王明亮2， 甘雪晴2， 孫雄山2， 趙嘉琪3△， 陳杰4△

（1西部戰區總醫院燒傷科，四川 成都 610083；2西部戰區總醫院心血管內科，四川 成都 610083；3西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；4西部戰區總醫院心臟外科，四川 成都 610083）

探討核受體亞家族1 D組成員1（NR1D1）在肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）增殖和遷移中的作用及機制。使用過表達腺病毒（Ad-Nr1d1）外源性轉染PASMCs，然后通過Western blot實驗分析各組NR1D1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（mTORC1）的下游經典蛋白S6和4EBP1的磷酸化改變，使用Ki-67免疫熒光染色分析細胞增殖能力改變，使用Transwell實驗分析細胞遷移能力改變。通過胰島素恢復降低的mTORC1活性后，進一步分析各組細胞增殖、遷移能力變化是否被逆轉。體外Ad-Nr1d1轉染PASMCs后，NR1D1表達明顯上調，低氧所致的PASMCs增殖、遷移和S6、4EBP1磷酸化都明顯受到抑制。而利用胰島素恢復降低的mTORC1活性后，過表達對PASMCs增殖和遷移的抑制作用明顯減弱。NR1D1可通過降低mTORC1活性抑制低氧所致PASMCs異常增殖和遷移。

NR1D1蛋白；肺動脈平滑肌細胞；細胞增殖；細胞遷移

動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension， PAH）的主要病理機制是肺血管重構和肺動脈異常收縮，最終導致右心衰竭甚至猝死［1-2］。在PAH各種致病因素中，關鍵因素是缺氧和低氧［3］，該因素會刺激肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells， PASMCs）異常遷移和增殖，最終導致血管腔狹窄甚至徹底閉塞，造成PAH［4］。盡管目前有藥物能延緩PAH進展過程，但PAH臨床預后差、死亡率高等問題仍未解決。因此，探索新的調控PASMCs增殖和遷移失衡的機制迫在眉睫。

核受體亞家族1 D組成員1（nuclear receptor subfamily 1 group D member 1， NR1D1）與晝夜節律生物鐘有關，其調控作用涉及自噬和腫瘤等方面［5-6］。此外，研究發現NR1D1可以通過調節巨噬細胞分化從而增強血管壁巨噬細胞的抗炎功能，影響動脈粥樣硬化進展［7］。而動脈粥樣硬化與血管重構有著相似的病理機制，尤其是血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移在兩種病理過程中都發揮著重要作用，提示NR1D1可能也參與調控肺血管重構。另有研究表明NR1D1在部分腫瘤細胞中還有抗增殖特性［6］。但NR1D1是否影響PASMCs增殖和遷移尚不得知。

本文利用低氧構建PASMCs異常增殖和遷移的體外模型，探索NR1D1在PASMCs異常增殖和遷移中的作用及相關分子機制，為探索新的藥物和靶點提供理論依據。

材料和方法

1　實驗動物和材料

將36只8～10周齡的C57BL/6J小鼠飼養在室溫下、12 h晝夜交替的動物房中，并供應有足夠的水和食物。所有的動物操作實驗均符合西部戰區總醫院動物倫理委員會的標準（批準編號：2022EC2-ky042）。

過表達腺病毒（adenovirus carrying， Ad-Nr1d1）和對照空載體腺病毒（control adenovirus，Ad-Con）購自中國上海吉凱基因醫學科技股份有限公司；10%胎牛血清購自Invitrogen；DMEM細胞培養基購自HyClone；4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride， DAPI）和增殖相關抗原Ki-67抗體購自中國上海碧云天生物技術公司；Transwell試劑盒購自Merck；NR1D1、p-4EBP1Thr37/46、4EBP1、p-S6Ser235/236、S6和GAPDH抗體購自CST。

2　方法

2.1細胞分組及處理提取C57BL/6J小鼠的肺動脈組織培養獲得PASMCs，分為常氧+Ad-Con組、常氧+Ad-Nr1d1組、低氧+Ad-Con組、低氧+Ad-Nr1d1組、低氧+Ad-Nr1d1+生理鹽水組和低氧+Ad-Nr1d1+胰島素組，每組復孔4個，按以上分組培養細胞，常氧培養條件為21%氧氣，低氧培養條件為3%氧氣，待細胞生長至50%左右時，與Ad-Con或Ad-Nr1d1共培養48 h。胰島素組使用5 mg/L濃度處理24 h，其溶劑對照組用等量生理鹽水處理相同時間。

2.2Western blot實驗蛋白裂解液法提取細胞總蛋白，利用凝膠電泳法分離不同分子量蛋白，膜電轉法將蛋白從凝膠轉移到膜， 5%胎牛血清封閉含蛋白的膜1 h。然后使用相應抗體4 ℃過夜孵育。Ⅰ抗處理完畢后充分洗膜，接著用Ⅱ抗常溫孵育1 h。最后，用化學發光液將條帶進行顯色曝光，最后用ImageJ定量分析蛋白條帶。

2.3免疫熒光染色實驗按以上分組的細胞懸液倒入6孔板，孔底部放一玻片，細胞培養處理后待細胞固定在玻片，倒掉殘余培養液，倒入PBS緩沖液至孔里，輕輕搖晃幾次倒掉，連續3次清洗后，滴加0.1% Triton X-100穿孔處理15 min，清洗后在室溫下血清封閉0.5 h。使用Ki-67 Ⅰ抗（1∶500）在濕箱4 ℃過夜孵育，相應的Ⅱ抗在室溫下再避光孵育1 h。之后以DAPI染料復染細胞核5 min，熒光顯微鏡下拍照，計算Ki-67陽性細胞比率。

2.4Transwell分析將以上分組處理的PASMCs細胞懸液置于Transwell培養板的上層小室中，將小室放到24孔板的孔中，孔內為無血清培養基，接下來在常氧和低氧環境下分別持續培養12 h。之后，把小室內側一面的細胞完全擦除干凈，而細胞遷移到外膜的一面使用4%多聚甲醛進行固定，無菌PBS緩沖液沖洗后，將含遷移細胞的膜剪下，平放于玻璃片，使用1%結晶紫染液染色20 min，無菌水輕輕沖洗掉剩余的染液，顯微鏡下觀察檢測遷移細胞數目比例。

3　統計學處理

用SPSS 22.0軟件進行數據分析，用Graphpad Prism 6作圖，以均數±標準差（mean±SD）表示計量數據，兩組之間的差異用獨立樣本檢驗進行比較，三組以上的組間差異用方差分析進行比較，以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　Ad-Nr1d1體外轉染PASMCs后NR1D1蛋白表達水平變化

利用Ad-Nr1d1轉染PASMCs實現體外過表達NR1D1。Western blot結果顯示，與轉染Ad-Con組相比，轉染Ad-Nr1d1后，NR1D1表達明顯升高（0.01），見圖1。

Figure 1.　Protein expression of NR1D1 in different groups. Mean±SD. n=4. ▲▲P<0.01 vs Ad-Con group.

2　Nr1d1過表達對低氧誘導的PASMCs增殖的調控作用

通過Western blot實驗發現低氧條件下，NR1D1表達明顯下降（0.01），見圖2A。通過Ki-67免疫熒光染色評估PASMCs增殖能力變化，結果顯示，與常氧組相比，低氧組Ki-67陽性細胞比率明顯升高（0.01）；而在低氧環境中培養的PASMCs中，與轉染Ad-Con相比，轉染Ad-Nr1d1后，Ki-67陽性細胞比率顯著下降（0.01），見圖2B。這表明NR1D1對低氧誘導的PASMCs過度增殖有抑制作用。

Figure 2.　Protein expression of NR1D1 （A） and immunofluorescence staining for Ki-67 in different groups （B； ×400）. Mean±SD. n=4. △△P<0.01 vs normoxic group；**P<0.01 vs normoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group.

3　Nr1d1過表達對低氧誘導的PASMCs遷移的調控作用

通過Transwell實驗分析NR1D1對低氧所致PASMCs異常遷移的影響。結果顯示，與常氧組相比，低氧組穿膜細胞百分比明顯升高（0.01）；而在低氧環境培養的PASMCs中，與轉染Ad-Con相比，轉染Ad-Nr1d1后，穿膜細胞百分比顯著下降（0.01），見圖3。以上表明，NR1D1能夠抑制低氧誘導的PASMCs過度遷移。

Figure 3.　Transwell assay of PASMCs in different groups （×100）. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs normoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group.

4　過表達Nr1d1對mTORC1下游效應分子蛋白水平的調控作用

當PASMCs受到外界刺激（如缺氧）時，細胞中mTORC1被激活，進而磷酸化下游效應蛋白S6和4EBP1，促進PASMCs的增殖和遷移［8］。研究結果顯示，與常氧組相比，低氧組PASMCs S6和4EBP1的磷酸化水平顯著增強（0.01）；而在低氧環境中培養的PASMCs中，與轉染Ad-Con相比，轉染Ad-Nr1d1后，S6和4EBP1的磷酸化水平明顯降低（<0.01）。說明NR1D1對PASMCs增殖和遷移的調控可能與mTORC1活性改變有關，見圖4。

Figure 4.　Protein expression of mTORC1-associated proteins in different groups. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs normoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group.

5　恢復mTORC1活性對NR1D1調控PASMCs增殖的影響

為探索mTORC1活性降低是否參與過表達抑制低氧所致PASMCs異常增殖的過程，我們用胰島素恢復PASMCs中被過表達降低的mTORC1活性。結果顯示，與低氧+Ad-Nr1d1+生理鹽水組相比，低氧+Ad-Nr1d1+胰島素組中S6和4EBP1磷酸化水平明顯回升（<0.01），見圖5。此外Ki-67陽性細胞比率也顯著增高（<0.01），見圖6。說明NR1D1通過降低mTORC1活性抑制低氧誘導的PASMCs過度增殖。

Figure 5.　Protein expression of mTORC1-associated proteins in different groups. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Nr1d1 group.

Figure 6.　Immunofluorescence staining for Ki-67 in different groups （×400）. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Nr1d1 group.

6　恢復mTORC1活性對NR1D1調控PASMCs遷移的影響

為探索mTORC1活性降低是否參與過表達抑制低氧所致PASMCs異常遷移的過程，我們使用胰島素恢復PASMCs中被過表達降低的mTORC1活性。結果顯示，與低氧+Ad-Nr1d1+生理鹽水組相比，低氧+Ad-Nr1d1+胰島素組中穿膜細胞比例顯著回升（<0.01），見圖7。這說明NR1D1通過降低mTORC1活性抑制低氧引起的PASMCs遷移。

Figure 7.　Transwell assay of PASMCs in different groups （×100）. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Nr1d1 group.

討論

PAH致死率高，不僅發病機制復雜，病因也多種多樣。在缺氧、低氧誘導下，肺血管重構的發病過程包括肺血管內皮功能紊亂、異常分泌細胞因子和生長因子，打破生理條件下PASMCs增殖與凋亡的動態平衡過程，最終引起PAH［4］。因此，PASMCs作為肺動脈壁的主要結構成分細胞，其增殖和遷移失衡是PAH的關鍵核心事件，目前有多種分子機制參與調控該過程，如內皮素1、缺氧誘導因子1等各種細胞因子［9］。

本研究揭示了NR1D1是低氧所致PASMCs異常增殖和遷移的新的調控因子，首先，我們利用腺病毒外源性過表達NR1D1后，低氧引起的PASMCs異常過度增殖和遷移被抑制；其次，過表達NR1D1抑制低氧誘導的mTORC1活化；最后，恢復mTORC1活性后，過表達NR1D1對低氧所致PASMCs異常增殖和遷移的抑制作用消失。以上結果顯示，NR1D1有可能成為預防和治療PAH的新靶點。

作為機體生物鐘的一員，NR1D1也被叫做Rev-erbα，在糖脂代謝、腫瘤和自噬調控中發揮重要作用［5-6］。NR1D1的高表達水平與多種血管事件演變相關，如動脈粥樣硬化病變的減輕［7］和促進血管修復過程［10］。而NR1D1和與這些血管事件有著相似病理機制的PAH有無調控作用既往尚無文獻報道。研究發現NR1D1在多類細胞中發揮抗增殖、抗遷移特性，如肺癌細胞、角質細胞和膠質瘤細胞等等［11-13］。我們當前研究也發現NR1D1可以抑制缺氧引起的PASMCs過度增殖和遷移，這也是NR1D1可能發揮抗PAH的機制之一。

既往研究發現NR1D1可在心肌細胞和肌小管中調控mTORC1活性［14-15］。mTOR是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過形成mTORC1和mTORC2兩種復合體發揮生物學特性。當細胞受到外界刺激，如低氧等，mTORC1激活從而調控細胞生長、增殖等過程［16］。此外，mTORC1的活化也與低氧所致的PASMCs過度增殖和遷移有關［8］。而NR1D1能否在PASMCs中影響mTORC1尚未知。我們在研究中發現低氧可誘導PASMCs中mTORC1下游效應分子S6和4EBP1磷酸化增強，即mTORC1激活，而過表達NR1D1明顯削弱了mTORC1活化的強度。進一步研究發現，通過胰島素恢復降低的mTORC1活性之后，NR1D1對低氧所致PASMCs增殖、遷移的抑制作用明顯減弱。因此，我們認為NR1D1通過降低mTORC1活性從而抑制PASMCs增殖和遷移。

綜上所述，本研究證實了NR1D1可以抑制低氧誘導的PASMCs過度增殖和遷移，其機制與mTORC1活性降低有關。我們的研究結果為探索抗肺動脈高壓藥物新靶點的研發提供了參考和理論依據。但對于NR1D1調控PASMCs具體機制的研究不夠深入，需要進一步完善補充。

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NR1D1 mediates abnormal proliferation and migration of PASMCs induced by hypoxia

BAI Yanping1， WANG Mingliang2， GAN Xueqing2， SUN Xiongshan2， ZHAO Jiaqi3△， CHEN Jie4△

（1，，610083，；2，，610083，；3，，646000，；4，，610083，）

To investigate the role and mechanism of nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 （NR1D1） in the proliferation and migration of pulmonary arterial smooth muscle cells （PASMCs）.NR1D1 was exogenously overexpressed in PASMCs through adenovirus carrying（Ad-Nr1d1） transfection. Western blot was performed to assess the protein expression of NR1D1 and the phosphorylation of classical mammaliant target of rapamycin complex 1 （mTORC1） downstream factors， S6 and 4E-binding protein 1 （4EBP1）. Immunofluorescence staining for Ki-67 and Transwell assay were performed to assess cell proliferation and migration， respectively. After mTORC1 activity was restored by insulin， the proliferation and migration of PASMCs were further assessed in each group.Transfection of PASMCs with Ad-Nr1d1 significantly increased the protein expression of NR1D1. Overexpression of NR1D1 attenuated the proliferation and migration of hypoxia-challenged PASMCs. In addition， it suppressed the phosphorylation of S6 and 4EBP1 in hypoxia-challenged PASMCs. Insulin-induced restoration of mTORC1 activity attenuated the Ad-Nr1d1-mediated inhibition of cell proliferation and migration.NR1D1 suppresses the proliferation and migration of hypoxia-challenged PASMCs by reducing mTORC1 activity.

NR1D1 protein； pulmonary arterial smooth mucle cells； cell proliferation； cell migration

R363； R543.2； R364.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.009

1000-4718（2023）09-1605-06

2023-02-27

2023-08-23

國家自然科學基金資助項目（No. 82100419）

趙嘉琪 Tel： 17716138078； E-mail： zjq950121@163.com；陳杰 Tel： 17760378037； E-mail： chenjie181213@sina.com

（責任編輯：宋延君，余小慧）