升降潤腸方對功能性便秘模型大鼠胃腸動力及結腸黏膜水通道蛋白3、水通道蛋白9的影響

申慧貞 趙騫 閆慧敏 楊燕 王昕泰 劉暢

功能性便秘(functional constipation,FC)是兒科門診常見的消化系統疾病,長期便秘可引起食欲減退、口苦口臭、腹脹腹痛等胃腸功能紊亂,病程越長,干預越晚,治療效果越差[1]。升降潤腸方由北京兒童醫院已故名醫王鵬飛治療便秘經驗方加減而成[2],本課題組前期臨床研究發現該方治療兒童FC療效顯著[3],但其作用機制尚不清楚。FC與胃腸蠕動減慢、結腸內水液過度吸收和(或)分泌減少而表現為糞便干結而致大便排出困難密切相關。水通道蛋白(aquaporin,AQP)在人和動物胃腸道水液代謝中發揮著重要作用[4],其中水通道蛋白3(AQP3)、水通道蛋白9(AQP9)存在于結腸粘膜,并可調控結腸水液代謝[5-6]。本實驗擬通過觀察升降潤腸方對FC模型大鼠胃腸動力及結腸黏膜AQP3、AQP9表達的影響,探討其治療FC的可能作用機制,為升降潤腸方治療兒童FC提供科學依據,從而更好的應用于兒科臨床。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及環境

48只SPF級6～8周齡SD大鼠,雌、雄各24只,體質量180～200 g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,動物合格證號:110322210100863418。大鼠飼養于恒溫22℃,濕度40%～50%,12小時光照/黑夜交替的SPF級實驗室,均自由攝食,并定時清潔、更換飼料,所有實驗操作遵循實驗動物倫理委員會規定。該實驗通過實驗動物倫理委員會批準(倫理號MDKN-2021-051)。

1.2 藥物

鹽酸小檗堿片(源葉生物,國藥準字:S30593,5 g/片);升降潤腸方,組成:茯苓10 g、 橘紅10 g、鉤藤10 g、伏龍肝10 g、炙甘草6 g、桃仁10 g、當歸10 g,由首都醫科大學附屬北京兒童醫院藥房提供,并由院內制劑室水煎煮制備成含生藥1.15 g/mL的藥液,4℃冰箱保存備用;乳果糖口服溶液(湖南科倫制藥有限公司,國藥準字:H20093523,0.667 g/mL)。

1.3 主要試劑及儀器

兔抗鼠AQP3多克隆抗體(Abcam,貨號:ab125219)、雞抗鼠AQP9多克隆抗體(Abcam,貨號:ab15129);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo,貨號:Cat No.23225);TRNzol總RNA提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司];AQP3、AQP9、GAPDH引物均在北京Invitrogen公司合成。

低溫臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司,型號:TGL-16),熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,型號:ABI7500),曝光儀(上海易孛特,型號:eBlot)。

1.4 動物分組及模型制備

48只大鼠正常喂養和觀察1周后稱重,采用隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、乳果糖組、升降潤腸方組,每組12只,雌、雄各半。參照吳迪等[7]的造模方法并略作改進:各組大鼠禁食不禁水12小時后,空白組每日1次予生理鹽水0.2 mL/(10 g·d)灌胃,其余組每日1次予鹽酸小檗堿5 mg/(10 g·d),加生理鹽水2 mL配制成的混懸液灌胃,連續灌胃21天進行造模,期間不限食水。當大鼠出現6小時內排便粒數減少、大便粒形小且干硬時為造模成功。

1.5 干預方法

空白組、模型組均予生理鹽水1 mL/次,2次/天,灌胃;根據動物藥物劑量換算公式:大鼠劑量(mg/kg)=成人劑量(mg/kg)×折算系數(6.25),按成人體質量60 kg計算,乳果糖組,予乳果糖口服溶液1mL/(次·天)[乳果糖日服劑量30 mL換算成SD大鼠3.1 mL/(kg·d)],第2次灌胃予生理鹽水1 mL/次;升降潤腸方組予中藥液1 mL/次,2次/天灌胃[升降潤腸方日服劑量66 g生藥換算成SD大鼠6.9 g/(kg·d)];四組均連續灌胃14天。

1.6 標本采集

末次給藥后每組隨機抓取大鼠雌、雄各3只,禁食不禁水12小時,將活性炭按0.1 mL/10 mg的比例進行灌胃30分鐘后,脫頸處死大鼠,做胃排空率、碳墨推進率、結腸糞粒數測定;余大鼠禁食不禁水12小時后,用3%戊巴比妥鈉麻醉后剖腹取近端結腸組織30 mm左右平分3段沖洗,1段放入4%甲醛中固定備用以待免疫組化,另2段置于-80℃超低溫冰箱保存備用以待實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及蛋白印跡(Western blot,WB)。

1.7 指標檢測

1.7.1 胃腸動力測定 將計算好的活性炭灌胃30分鐘后脫頸處死大鼠,取胃稱重,用生理鹽水沖洗胃內容物后再次稱重,胃排空率=[1-(胃全重-胃凈重)/胃全重]×100%;剪取腸管測量小腸總長度,從幽門至活性炭前沿的距離視為腸管內推進距離,碳墨推進率=(腸管內推進距離/小腸全長)×100%;并記錄整個結腸內糞便存留的粒數。

1.7.2 免疫組化染色 取備用的結腸組織,采用S-P法進行免疫組化染色,通過Motic3000顯微鏡在400倍下觀察切片,陽性結果為棕色或者棕黃色。采用Image-pro Plus圖像分析系統,計算平均光密度值并觀察AQP3、AQP9在結腸黏膜中的分布及表達情況。

1.7.3 qRT-PCR檢測 取備用結腸組織,采用TRNzol總RNA提取試劑進行RNA提取,進行RNA濃度、純度檢測,以A260/A280比值范圍1.8～2.1為較高純度RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄,以此為模板進行PCR擴增,引物見表1,每個樣本檢測3個復孔。原始檢測數據采用2-△△ct相對定量公式計算。

表1 引物序列

1.7.4 WB檢測 取結腸組織,RIPA裂解液抽提蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,計算調整蛋白濃度,上樣、電泳、轉膜、封閉、一抗和二抗孵育、漂洗后將其顯色、曝光、顯影;β-actin選作內參,Image J軟件進行灰度值分析。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠胃腸動力比較

與空白組相比,模型組的胃排空率、碳墨推進率降低、存留糞粒數增多,差異均有統計學意義(P<0.05),提示便秘模型復制成功。與模型組相比,乳果糖組的胃排空率差異無統計學意義(P>0.05),升降潤腸方組的胃排空率增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,兩組的碳墨推進率均增加、存留糞粒數均減少,差異有統計學意義(P<0.05)。與乳果糖組相比,升降潤腸方組的胃排空率增加(P<0.05),但兩組的碳墨推進率、存留糞粒數差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 各組大鼠胃排空率比較鼠只=6)

表3 各組大鼠腸道炭墨推進率及存留糞粒數比較

2.2 各組大鼠結腸組織中AQP3、AQP9的分布及表達情況比較

2.2.1 免疫組化檢測 AQP3陽性細胞主要位于結腸黏膜表層柱狀上皮,且均為吸收細胞胞漿著色,杯狀細胞未見到陽性著色(圖1)。AQP9陽性細胞主要位于結腸黏膜表層柱狀上皮,且均為杯狀細胞胞漿著色,吸收細胞未見到陽性著色(圖2)。與空白組相比,模型組AQP3的平均光密度值升高,AQP9的平均光密度值降低(P<0.05)。與模型組相比,乳果糖組AQP3的平均光密度值均降低(P<0.05),AQP9的平均光密度值升高,但差異無統計學意義(P>0.05);與模型組相比,升降潤腸方組AQP3的平均光密度值降低(P<0.05),AQP9的平均光密度值升高(P<0.05)。與乳果糖組相比,升降潤腸方組AQP3的平均光密度值降低,但差異無統計學意義(P>0.05),AQP9的平均光密度值升高 (P<0.05)。見表4。

注:A:空白組;B:模型組;C:乳果糖組;D:升降潤腸方組。

注:A:空白組;B:模型組;C:乳果糖組;D:升降潤腸方組。

表4 各組大鼠近端結腸黏膜組織AQP3、AQP9平均光密度值比較

2.2.2 qRT-PCR、WB檢測 與空白組相比,模型組AQP3 mRNA及蛋白表達上升,AQP9 mRNA及蛋白表達下降(P<0.05)。與模型組相比,乳果糖組AQP3 mRNA及蛋白表達下降(P<0.05),AQP9 mRNA及蛋白表達升高,但差異無統計學意義(P>0.05);與模型組相比,升降潤腸方組AQP3 mRNA及蛋白表達下降(P<0.05),AQP9 mRNA及蛋白表達上升(P<0.05)。與乳果糖組相比,升降潤腸方組AQP3 mRNA及蛋白表達降低,但差異無統計學意義(P>0.05),AQP9 mRNA及蛋白表達上升(P<0.05)。見表5、6及圖3。

注:A:空白組;B:模型組;C:乳果糖組;D:升降潤腸方組。

表5 各組大鼠近端結腸黏膜組織AQP3、AQP9 mRNA水平比較

表6 各組大鼠近端結腸黏膜組織AQP3、AQP9蛋白表達水平

4 討論

既往認為小兒便秘以飲食積滯、燥熱內結證最為常見[8-9],治療多以消食導滯、清熱潤腸通便為主。閆慧敏教授根據小兒“脾常不足、肝常有余、肺常不足”的生理特點及“絡病理論”[10],從脾虛腸燥論治,創立了升降潤腸方,該方運脾生津、潤腸通便、調暢氣機,思路新穎。在實際應用中根據患兒脾虛、腸燥、氣滯程度不同,往往酌情加用白術、火麻仁、炒苦杏仁、生地黃、白芍、枳實、厚樸等,經前期臨床研究證實療效顯著。

慢傳輸型便秘是兒童功能性便秘的常見類型,是由各種原因引起的結腸運動功能遲緩、傳輸糞便能力下降而導致的便秘[11],其發病機制與腸神經系統病變、神經遞質分泌異常、Cajal間質細胞異常、平滑肌功能障礙、精神心理問題、腸道菌群失調等相關[12]。本實驗結果顯示模型組大鼠的胃排空率及碳墨推進率低于空白組,結腸糞粒存留粒數高于空白組(P<0.05),提示該模型為慢傳輸型便秘模型。與模型組相比,升降潤腸方可以促進FC模型大鼠胃腸動力(P<0.05),且在促進胃動力方面優于乳果糖(P<0.05)。說明升降潤腸方可促進慢傳輸型FC模型大鼠的胃腸動力,從而縮短糞便在結腸的存留時間,減少水分吸收,以緩解便秘。

功能性便秘的發生與腸道水液代謝障礙有關[13],對人體而言,結腸上皮細胞每天需要逆滲透壓濃度梯度吸收1.5～2 L的水來保證大便成型,然而,在某些生理和病理條件下,結腸上皮細胞也能分泌水分和電解質,AQPs在胃腸上皮細胞水液的轉運中發揮重要作用,其功能的發揮與它所在的位置之間似乎有密切的關系[14]。AQP3是一種在食道、結腸近端和遠端表達豐富的水通道蛋白,其精確定位在基底外側膜的單層柱狀上皮細胞[15]。在嗎啡誘導的便秘模型大鼠中,結腸黏膜AQP3的表達水平升高,促進水分由腸腔側到血管側的吸收,并導致便秘[16];利用HgCl2和CuSO4抑制大鼠AQP3的功能,則可導致嚴重腹瀉[17];以上說明AQP3在調節腸道水液平衡方面起著關鍵作用。早期研究證實AQP9主要存在于人類和大鼠的肝臟,并可允許各種各樣的水和中性溶質通過[18];近年袁維堂等[6]發現AQP9存在于人類結腸,且便秘患者降結腸黏膜AQP9蛋白表達低于非便秘者;趙兵等[19]證實便秘大鼠結腸中AQP9表達水平明顯降低,經治療后AQP9表達水平顯著提高,推測AQP9減少可能影響腸道黏液分泌,導致糞便含水量不足,形成干結糞便,從而引起便秘。本研究免疫組化示AQP3、AQP9分別主要存在結腸黏膜上皮層的吸收細胞、杯狀細胞;吸收細胞參與水分的吸收而致糞便含水量降低;杯狀細胞參與結腸黏液分泌、潤滑腸道促進糞便排出,與既往研究一致[20]。本研究結果示模型組結腸黏膜AQP3 mRNA及蛋白表達水平高于空白組,AQP9低于空白組(P<0.05),說明二者參與了大鼠FC的發生。而與模型組相比,升降潤腸方組結腸黏膜AQP3水平下降,AQP9上升(P<0.05),這從分子機制證實了升降潤腸方具有生津、潤腸通便的作用。研究同時表明,升降潤腸方組結腸黏膜AQP9水平高于乳果糖組(P<0.05),但AQP3水平較乳果糖組無明顯差異(P>0.05)。

本研究仍有一定的局限,僅檢測了升降潤腸方對胃腸動力及AQP3、AQP9的影響,仍需進一步探究神經遞質、腸道菌群等對胃腸動力的影響及VIP-cAMP-PKA、NF-κB等信號通路對AQP3、AQP9具體調控機制,以更深層次明確升降潤腸方治療便秘的生物學機制。

綜上所述,升降潤腸方可促進FC模型大鼠胃排空率、碳墨推進率,減少糞粒存留,同時能調控結腸黏膜AQP3、AQP9的表達,其在促進胃排空率及上調AQP9的表達方面優于乳果糖。故升降潤腸方治療兒童FC的作用機制與其能促進胃腸動力,下調近端結腸黏膜AQP3及上調近端結腸黏膜AQP9的表達相關。