ANKRD13A在肝癌組織中的表達及對其生物學行為的影響

生 禹 吳書楨 葛思佳 陳 婧 劉肇修 黃 偉 陸翠華

原發性肝癌是我國第4位常見的惡性腫瘤及第2位的腫瘤致死病因,包括肝細胞癌、肝內膽管癌和混合型肝細胞癌-膽管癌3種病理學類型,其中肝細胞癌(簡稱肝癌)占75%～85%[1,2]。我國每年新發的肝癌數量占全球肝癌發病數的一半以上,由于肝癌早期診斷較為困難,絕大多數患者發現時已處于肝癌進展期甚至已經有其他臟器的受累,這進一步導致肝癌的預后不佳[3,4]。因此,深入研究肝癌發生、發展的機制,尋找有效的預防和治療的措施,是當前肝癌研究的熱點和關鍵點。

ANKRD13家族包括ANKRD13A、13B和13D,該蛋白家族分子結構中含有多個高度保守的泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motif,UIM)。研究表明,ANKRD13A可通過其UIM結構域與一些內吞蛋白相互作用,從而阻止后者內化,在miR-204介導下ANKRD13A可抑制晶狀體上皮細胞的遷移[5～7]。ANKRD13A與卵巢癌患者的預后有著顯著的相關性,但是ANKRD13A在肝癌發生、發展過程中的作用及分子機制鮮見報道[8]。本研究旨在探討ANKRD13A在肝癌組織中的表達情況以及對肝癌細胞生物學行為的影響以及可能的分子機制,以期為肝癌的臨床診斷及治療提供新思路。

材料與方法

1.一般資料:選取南通大學附屬醫院2012年1月～2021年5月收集的肝癌組織和相對應的癌旁組織(n=20)。由南通大學附屬醫院研制了含有106例肝癌樣本的人體組織芯片。所有樣本均來自于手術切除,所有組織術后均經病理確認。本研究通過筆者醫院醫學倫理學委員會審查(倫理學審批號:2015-045),所有患者均知情同意。

2.細胞培養及傳代:人肝癌細胞株SMMC- 7721來源于中國科學院細胞庫(上海),將肝癌細胞按要求放入含10%-胎牛血清的培養基(DMEM)中培養,置入恒溫培養箱,每2天換液1次,待細胞融合至70%～80%時進行細胞傳代,取對數期的細胞用于后續試驗。

3.細胞轉染:過表達質粒和對照質粒購自武漢淼靈生物科技有限公司。根據試劑說明書用Lipofectamine 2000將質粒轉染到目標細胞系中,48h后棄除轉染液使用正常培養基培養,并用嘌呤霉素篩選轉染過表達ANKRD13A質粒和空載質粒的SMMC-7721細胞10～14天,成功構建含目標質粒的穩轉細胞系。

4.免疫組織化學染色(IHC):組織固定后包埋,制作連續切片(厚4μm),然后用二甲苯脫蠟,抗原修復,接著加入ANKRD13A一抗抗體,置入4℃冰箱過夜,加入二抗,室溫烘烤30min后PBS洗滌3次,二氨基聯苯胺顯色10min,蘇木精復染,顯微鏡拍照。根據陽性染色強度和腫瘤細胞染色比例進行評分(0分: 0～5%,1分: 6%～30%,2分: 31%～70%, 3分:>71%)。Thomas綜合計分法計算結果:0～7 分為陰性表達(-),8～12 分為陽性表達(+)。

5.Western blot法檢測:收取各組細胞,肝癌和癌旁組織分別加入等比例的RIPA 裂解液,提取總蛋白,調整好上樣量,SDS-PAGE電泳分離后轉印至PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶封閉2h后,加入ANKRD13A、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK、p-MEK一抗置入4℃冰箱敷育過夜,后取出用PBS清洗,加入IgG二抗室溫敷育2h,繼續用PBS清洗,應用顯影液避光顯影, 凝膠成像系統曝光拍照,并通過ImageJ軟件進行量化。

6.實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測: 將TRIzol試劑1ml分離加入已稱量好的肝癌組織和癌旁組織(100mg)靜置10min,再加入氯仿200μl,振蕩混勻后,12000r/min離心15min,取上清液加入等體積的異丙醇,混勻后再次離心去下層沉淀,用乙醇洗滌后,加入DEPC溶解,分光光度計測量RNA濃度。將1μg的RNA反轉錄為cDNA,進行PCR擴增。ANKRD13A上游引物:5′-TGCACCTCCTAGTCTGGAAAA-3′,下游引物:5′-AGATGCAATAATGTTCGACCTCG-3′。ETS上游引物:5′-GTGGCCAGGAGATGGGGAAA-3′,下游引物:5′-CATGGCGTGCAGCTCTTCAG-3′。c-Myc上游引物:5′-CGTCTCCACACATCAGCACAA-3′,下游引物:5′-CACTGTCCAACTT GACCCCTCTTG-3′。Elk-1上游引物:5′-TCCCTGCTTCCTACGCATACA-3′,下游引物:5′-GCTGCCACTGGATGGAAACT-3′。內參18S上游引物:5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′,下游引物:5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′。反應條件:95℃ 5min, 95℃ 10s, 60℃ 30s, 40 個循環。每個樣本重復 3 次,計算平均值,所有步驟均符合MIQE規則。

7.CCK-8實驗:將各組別的細胞以 5000 個/孔接種于 96 孔板中,分別培養 0、24、48、72h,在對應的時間點向每孔中分別加入 10μl CCK-8試劑,置入恒溫培養箱避光孵育2h后,取出培養板放置于酶標儀檢測450nm處的吸光度(A)值。

8.Transwell實驗:在各組別的細胞分別計數兩萬個重懸于200μl無血清的培養基(DMEM)中,加入到預選準備的小室上室中,將含 10%胎牛血清的600μl培養基添加到下室,置入恒溫培養箱敷育48h后,取出小室使用多聚甲醛固定,結晶紫染色,后于顯微鏡下計數遷移到濾膜下的腫瘤細胞。

9.劃痕愈合實驗:將各組別的細胞接種于6孔板中,置入恒溫培養箱培養,后取出6孔板棄出培養基,用200μl的槍頭垂直于6孔板作直線劃痕,分別于劃痕后0h和24h拍攝所劃區域細胞遷移圖像,記錄分析比較各組之間的差異。

結 果

1.ANKRD13A在肝癌組織中低表達:與對應的癌旁組織比較,ANKRD13A在肝癌組織中的表達水平顯著降低(圖1中A～C)。進一步根據ANKRD13A在肝癌組織芯片中的染色情況,將患者分為高表達組(n=27)和低表達組(n=72),分析ANKRD13A蛋白的表達水平與患者臨床病理參數之間的相關性。統計分析顯示,ANKRD13A蛋白的表達水平與患者的BCLC分期(P=0.001)以及是否存在肝硬化(P=0.003)顯著相關,而與患者的年齡、性別、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)以及有無遠處轉移等臨床病理參數無顯著相關(表1)。同時,在CPTAC數據庫中分析發現,與癌旁組織比較,ANKRD13A蛋白在肝癌組織中的表達水平顯著降低(P<0.001),差異有統計學意義(圖1D)。以上結果提示,在肝癌的發生、發展過程中,ANKRD13A蛋白可能發揮了重要的抑制作用。

圖1 ANKRD13A在肝癌組織中低表達A.Western blot法檢測ANKRD13A蛋白在3例肝癌組織和癌旁組織中的表達差異;B.RT-qPCR檢測ANKRD13A mRNA在30例肝癌組織和癌旁組織中表達差異;C.ICH檢測ANKRD13A蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達情況;D.ANKRD13A蛋白在CPTAC數據庫中的表達情況。GAPDH為內參

表1 ANKRD13A蛋白的表達水平與患者臨床病理參數之間的相關性

2.過表達ANKRD13A可顯著抑制肝癌細胞在體外的增殖和遷移活力:為了進一步探究ANKRD13A對肝癌細胞生物學行為的影響,本研究構建了穩定過表達ANKRD13A或對照質粒的SMMC-7721細胞系(圖2A)。通過CCK-8細胞增殖實驗發現,在SMMC-7721細胞中過表達ANKRD13A可顯著抑制細胞的體外增殖活力(圖2B)。同時,通過細胞劃痕愈合實驗和Transwell遷移實驗發現,過表達ANKRD13A也可顯著抑制肝癌細胞的體外遷移能力(圖2中C～F)。以上結果表明,在體外細胞模型中,過表達ANKRD13A可顯著抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力。

圖2 過表達ANKRD13A可抑制肝癌細胞在體外的增殖和遷移能力A.Western blot法驗證成功構建穩定過表達ANKRD13A和對照質粒的SMMC-7721細胞系;B.CCK-8細胞增殖實驗探究過表達ANKRD13A后對SMMC-7721細胞增殖活性的影響;C、D.細胞劃痕實驗探究過表達ANKRD13A后對SMMC-7721細胞遷移速度的影響;E、F.Transwell細胞遷移實驗探究過表達ANKRD13A后對SMMC-7721細胞遷移能力的影響。GAPDH為內參,*P<0.01,**P<0.001

3.過表達ANKRD13A 可抑制肝癌細胞在裸鼠體內的生長:為了進一步驗證ANKRD13A 對肝癌細胞增殖能力的影響,將過表達ANKRD13A 或對照組的SMMC-7721細胞注射到裸鼠皮下(圖3A),每周測量裸鼠皮下腫瘤的體積,4周后處死裸鼠并取出腫瘤組織進行稱量,結果顯示,過表達ANKRD13A組裸鼠皮下腫瘤的生長速度以及腫瘤重量和體積均較對照組顯著降低(圖3中B、C)。將取出的腫瘤組織進一步進行增殖細胞相關的核抗原ki-67染色,結果發現,與對照組比較,過表達ANKRD13A組腫瘤細胞的ki-67染色減弱(圖3D)。以上結果表明,過表達ANKRD13A可顯著抑制腫瘤細胞在小鼠體內的增殖。

圖3 過表達ANKRD13A可顯著抑制肝癌細胞在裸鼠體內的生長能力A.左圖為裸鼠皮下成瘤的大體圖像;左側為對照組,右側為過表達ANKRD13A組;右圖為裸鼠腫瘤的大體圖像:上一排為對照組,下一排為過表達ANKRD13A組;B.腫瘤重量;C.腫瘤體積;D.兩組裸鼠皮下腫瘤切片的ki-67染色。*P<0.05

4.ANKRD13A可能通過抑制MEK磷酸化發揮其生物學效應:細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的一條信號通路,包括ERK1和ERK2兩個重要成員。ERK1/2受上游特異性刺激分子MEK1/2的雙磷酸化而激活,磷酸化的ERK1/2形成二聚體,從細胞質移位到細胞核,進而磷酸化一系列下游轉錄因子,例如c-Myc、stat、SAP-1等,從而調控細胞周期和生存等過程[9]。本研究中,為了初步探究ANKRD13A調節肝癌細胞生物學行為的可能分子機制,筆者利用Western blot法檢測了ERK1/2信號通路相關蛋白的活化水平,結果發現,過表達ANKRD13A可抑制肝癌細胞中ERK1/2的磷酸化水平,并且可顯著抑制其上游MEK1/2蛋白的磷酸化水平(圖4A)。同時,通過RT-qPCR實驗發現,ERK1/2信號通路的下游轉錄因子c-Myc、Elk-1、ETS的表達水平也顯著降低(圖4B)。既往研究表明,在腫瘤相關疾病中,MEK信號通路參與調控腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移能力。例如,MEK抑制劑曲美替尼能夠降低甲狀腺癌的增殖能力,并且對非小細胞肺癌有一定的治療效果[10]。本研究發現,過表達ANKRD13A可顯著抑制肝癌細胞中MEK1/2的磷酸化水平,從而影響其下游的ERK1/2的磷酸化以及細胞核中轉錄因子的表達,但是有關ANKRD13A抑制MEK1/2磷酸化的分子機制有待于進一步探究。

圖4 在肝癌細胞中ANKRD13A可能通過抑制MEK1/2磷酸化發揮其生物學效應A.Western blot法檢測p-MEK1/2、MRK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2的表達水平;B.RT-qPCR檢測ERK1/2下游轉錄因子c-Myc、Elk-1、ETS等的表達水平變化。GAPDH為內參,*P<0.001

討 論

肝癌是一種高度惡性腫瘤,其發病機制一直是臨床研究的重點和熱點[11]。肝癌的高度侵襲性與肝癌細胞的增殖和遷移能力密切相關[12]。因此尋找一個早期的診斷指標和新的治療靶點尤為重要。

ANKRD13A是表皮生長因子受體相互作用蛋白,其可通過自身分子結構域C端的3個錨蛋白重復序列與相關細胞膜上配體激活的泛素化EGF受體部分結合來調節細胞表面物質的內吞反應,從而進一步介導相關蛋白質之間的相互作用[13]。同時ANKRD13A可以誘導束狀肌動蛋白的分解,微管的徑向分布和脂肪酸分布以及細胞黏附性的增加,其在細胞骨架和脂肪組織中起著關鍵作用[7]。腫瘤細胞的形成與細胞遷移和增殖有著密不可分的關系,而ANKRD13A在一定程度上可以調控相關細胞的遷移。研究發現,ANKRD13A參與了急性白血病的發生、發展,其在該類腫瘤的形成過程中發揮重要作用[14]。但ANKRD13A在肝癌中的發生機制尚不明確,因此本文對ANKRD13A的相關分子機制進行研究。

Ras-MEK通路是癌細胞生物學中特征最為明顯的激酶級聯反應之一,它是由生長因子中的致癌激酶的激活突變觸發的,在幾種癌癥的發生、發展和維持中發揮著核心作用,包括黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、結腸直腸癌和乳腺癌。既往還有研究報道,該通路在肝癌中特異性上調,并且通過細胞表面受體和細胞質信號產生的增殖信號傳遞到細胞核,從而驅動癌細胞增殖和進展[15]。

本研究發現,過表達ANKRD13A可顯著降低MEK1/2的磷酸化水平,并且抑制其下游轉錄因子的表達水平。因此,筆者猜測在肝癌細胞中,ANKRD13A可能通過抑制MEK1/2的磷酸化,進而抑制細胞的增殖與遷移能力。本研究通過比較30例肝癌患者的癌組織和癌旁組織中ANKRD13A的mRNA水平,發現ANKRD13A在癌旁組織中的表達水平顯著高于癌組織。并且發現在癌組織中,其蛋白水平也顯著降低。進一步研究發現,過表達ANKRD13A可顯著抑制肝癌細胞的增殖與遷移能力。以上結果提示,ANKER13A在肝癌的發生、發展過程中具有重要的抑制作用。然而本實驗存在一定的不足,僅初步發現ANKRD13A可以調控MEK1/2的磷酸化,并影響其下游分子,但是否存在與之相互作用分子共同調節該通道的具體機制仍值得深入探討。

綜上所述,本研究表明,ANKRD13A可能通過抑制MEK1/2的磷酸化,進而抑制肝癌細胞的增殖與遷移能力,在肝癌的發生、發展過程中發揮了重要的抑制作用。本研究有望為肝癌發病機制的研究及肝癌治療靶點的研發提供新思路。