雌激素受體相關的乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移差異表達基因的生物信息學分析

蔣艷萍 秦 健 汪 璐 彭亞琴

乳腺癌是女性發(fā)生率最高的腫瘤,其發(fā)生率可達女性腫瘤總發(fā)生率的1/3[1]。近年來,由于社會大眾對疾病的警惕性提高,疾病早期診斷技術和治療技術的持續(xù)改進,乳腺癌的病死率已較20世紀末大大降低,且逐漸趨于平穩(wěn)[1]。乳腺癌早期被認為是一種可以治愈的疾病,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者的5年總生存率就會顯著下降[2]。骨組織是乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移最常見的部位,乳腺癌晚期骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率可高達65%～75%[3]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移通常伴有嚴重的并發(fā)癥,將引起患者骨痛、骨折及高鈣血癥等骨相關事件,嚴重影響患者的生活能力和質(zhì)量。骨轉(zhuǎn)移發(fā)生與否與乳腺癌的預后密切有關,約有超過70%的乳腺癌患者死于骨轉(zhuǎn)移[4]。因此尋找乳腺癌骨轉(zhuǎn)移特異性的預測、治療靶標,對于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的早期診斷、預防及治療均有重要的意義。

本研究通過生物信息學方法探討乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移的相關基因和生物學信號通路,利用Gene Expression Omnibus (GEO)公共數(shù)據(jù)庫,篩選雌激素受體相關的乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移差異表達基因,并對其進行功能富集分析,并分析骨代謝相關基因的表達與雌激素受體表達和乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移的相關性,以進一步了解乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制,以期為尋找乳腺癌骨轉(zhuǎn)移早期診斷指標提供線索和依據(jù),促進乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子診斷、治療技術發(fā)展。

資料與方法

1.資料來源:在美國國立生物技術信息中心的GEO DataSets數(shù)據(jù)庫中以“breast cancer”和“bone metastasis”作為關鍵詞搜索,設置研究類型為“expression profiling by array”,設置種屬類型為“homo sapiens”。根據(jù)臨床信息及樣本量,選擇獲得具有雌激素受體表達臨床分型及骨復發(fā)轉(zhuǎn)移臨床信息,且含有286個乳腺癌樣本的乳腺癌數(shù)據(jù)集GSE2034[5]。根據(jù)GSE2034的臨床信息,該數(shù)據(jù)集共含107例乳腺癌復發(fā)樣本,其中ER臨床分子分型為陽性的80例,陰性的27例。

2.差異表達基因分析:利用R軟件GEOquery和limma軟件包下載GSE2034數(shù)據(jù)集并進行分析,對芯片數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2均一化,并對差異表達分析結果進行FDR(false discovery rate)矯正。校正后的P值,即Padj.<0.05,表達水平相差的倍數(shù)>2為差異表達基因。

3.目的表達的獲得及相關性分析:本研究根據(jù)GSE2034芯片平臺信息,獲得ESR1(estrogen receptor 1)、SFRP1、TNFAIP3和NEK1相應的探針信息。在GSE2034數(shù)據(jù)集中,ESR1的探針有217163_at、217190_x_at、205225_at、211233_x_at、211234_x_at、211235_s_at、215551_at和215552_s_at;SFRP1的探針有202035_s_at、202036_s_at和202037_s_at;TNFAIP3的探針有202643_s_at和202644_s_at;NEK1的探針有211086_x_at、213328_at和213331_s_at。對每個基因?qū)娜刻结槍谋磉_量值取平均值,代表該基因的表達水平進行復發(fā)骨轉(zhuǎn)移相關性、基因表達相關性分析。

4.基因富集分析(gene sets enrichment analysis,GSEA):采用 GSEA軟件對 GSE2034復發(fā)樣本進行了分析,按照ER的臨床分型分成ER陽性和ER陰性兩組,并在Molecular Signatures Database (MSigDB) 上下載基因集C5[6]:ontology gene sets作為參照基因集,此基因集共含15473種基因集,包括生物學過程、細胞組成成分和分子功能相關的基因集等。按default weighted enrichment statistics方法進行富集分析,隨機組合重復次數(shù)設置為1000次,FDR<25%且標準化的P<0.05的基因集定義為顯著富集的基因集。

結 果

1.雌激素受體的表達狀態(tài)與乳腺癌骨復發(fā)轉(zhuǎn)移有關:乳腺癌數(shù)據(jù)集GSE2034,是共含有286例乳腺癌患者的腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù),并含有雌激素受體(estrogen receptor,ER)表達的臨床分型、是否有復發(fā)以及是否為復發(fā)骨轉(zhuǎn)移等臨床信息。利用GSE2034數(shù)據(jù)集臨床信息,對乳腺癌樣本的ER臨床分型以及雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)的表達水平與復發(fā)骨轉(zhuǎn)移是否有關進行了χ2檢驗,結果顯示臨床分子分型為ER陽性的乳腺癌患者發(fā)生復發(fā)骨轉(zhuǎn)移的比例顯著高于ER陰性乳腺癌患者(P=0.0224)。此外,利用測序平臺的探針信息,筆者還對ESR1進行了分析,按其是否高于平均值分為高、低兩組,并對ESR1的表達水平與復發(fā)骨轉(zhuǎn)移進行了分析驗證,χ2檢驗的結果再次提示ESR1表達較高的乳腺癌患者發(fā)生復發(fā)骨轉(zhuǎn)移的比例顯著高于ESR1表達較低的患者(P=0.035,表1)。

表1 雌激素受體表達狀態(tài)與乳腺癌骨復發(fā)轉(zhuǎn)移的統(tǒng)計學分析(n)

2.ER有關的乳腺癌骨復發(fā)轉(zhuǎn)移相關差異表達基因的分析:利用R軟件limma軟件包,分別根據(jù)GSE2034數(shù)據(jù)集中復發(fā)樣本的ER臨床分子分型信息和復發(fā)骨轉(zhuǎn)移情況(骨復發(fā)轉(zhuǎn)移與非骨復發(fā)對比)的差異表達基因進行了分析。經(jīng)Benjamini &Hochberg矯正后,其表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且表達水平的倍數(shù)差異>2的基因中,高表達于骨復發(fā)轉(zhuǎn)移樣本的基因共有30個(60%),也同時顯著高表達于ER陽性的復發(fā)樣本中。ER陽性復發(fā)樣本較ER陰性復發(fā)樣本高表達、骨復發(fā)轉(zhuǎn)移較非骨復發(fā)樣本差異表達基因的韋恩圖詳見圖1。同時顯著高或低表達于ER+復發(fā)樣本和骨復發(fā)轉(zhuǎn)移樣本的基因列表詳見表2。

圖1 復發(fā)乳腺癌ER表達狀態(tài)與骨復發(fā)轉(zhuǎn)移情況差異表達基因韋恩圖

表2 ER+復發(fā)樣本和骨復發(fā)轉(zhuǎn)移樣本的共有差異表達基因

3.GSEA分析:為了進一步探討雌激素受體與乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移的相關性及其可能的分子機制,筆者利用GSEA軟件對GSE2034數(shù)據(jù)集ER不同臨床分子分型的樣本進行了基因富集分析,以全面了解與乳腺癌復發(fā)樣本中與ER表達狀態(tài)相關的骨組織代謝相關的功能基因集。結果顯示,ER陰性乳腺癌復發(fā)樣本顯著富集了骨重構負調(diào)節(jié)(negative regulation of bone remodeling)和骨吸收調(diào)控(regulation of bone resorption)相關的功能數(shù)據(jù)集;而ER陽性乳腺癌復發(fā)樣本顯著富集了脛骨發(fā)育不全(HP_Aplasia_Hypoplasia_of_the_Tibia)和四肢骨骼發(fā)育不全(aplasia involving bones of the extremities)相關的功能數(shù)據(jù)集(圖2和表3)。

圖2 GSEA分析顯示骨組織代謝有關的功能基因集

表3 骨組織代謝相關的功能基因集的GSEA分析結果

4.差異表達基因表達相關性:為了進一步探討ER相關的乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移的差異表達基因的表達特征,筆者對上述GSEA富集的骨發(fā)育、代謝相關通路中顯著富集基因的表達水平與乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移情況及與ESR1表達水平的相關性進行了分析。其中SFRP1和TNFAIP3均顯著富基于Negative_Regulation_of_Bone_Remodeling數(shù)據(jù)集,且其在骨復發(fā)組的表達水平顯著低于非骨復發(fā)組,其表達水平與ESR1的表達水平呈負相關;NEK1顯著富集于Hp_Aplasia_Hypoplasia_of_the_Tibia數(shù)據(jù)集,且其在骨復發(fā)樣本的表達水平顯著高于非骨復發(fā)組,且其表達水平與ESR1的表達水平呈正相關(圖3)。

圖3 SFRP1、TNFAIP3和NEK1基因相對表達水平與乳腺癌骨復發(fā)轉(zhuǎn)移及ESR1表達水平的關聯(lián)A.SFRP1與骨復發(fā)轉(zhuǎn)移相關性;B.TNFAIP3與骨復發(fā)轉(zhuǎn)移相關性;C.NEK1與骨復發(fā)轉(zhuǎn)移相關性;D.SFRP1與ESR1表達水平的相關性;E.TNFAIP3與ESR1表達水平的相關性;F.NEK1與ESR1表達水平的相關性

討 論

乳腺癌是全球范圍最常見的腫瘤之一,也是女性致死率第2高的癌癥[7]。近年來,隨著人們對乳腺癌認識的逐漸加深,早期診療技術的發(fā)展,促進了乳腺癌的診斷初篩和分子分型及治療,乳腺癌的病死率呈緩慢下降趨勢[1]。相較于乳腺癌本身,遠處轉(zhuǎn)移尤其是骨轉(zhuǎn)移是其更為重要的致死原因。因而尋找有助于預測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移和判斷其預后的分子標志物,對于乳腺癌的診斷和治療極具意義。

雌激素受體的表達水平與乳腺癌骨復發(fā)轉(zhuǎn)移有關。70%以上乳腺癌為雌激素受體陽性(ER+),即管腔型(luminal-like subtype)乳腺癌,其骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率是基底型(basal-like subtype)乳腺癌的2.5倍[8]。降低雌激素水平,或通過ER阻滯劑、ER調(diào)節(jié)劑等阻斷雌激素作用的內(nèi)分泌療法可以顯著降低乳腺癌復發(fā)[8]。根據(jù)數(shù)據(jù)集GSE2034的臨床資料,本研究首先對ER的臨床分子分型和芯片平臺中ESR1全部探針的表達情況與復發(fā)骨轉(zhuǎn)移進行了關聯(lián)分析。兩種分析結果均提示,ER表達水平較高的乳腺癌患者發(fā)生骨復發(fā)轉(zhuǎn)移的比例顯著高于ER表達水平較低的患者。與許多其他研究一致,本研究的這一結果進一步證實ER可能促進乳腺癌骨轉(zhuǎn)移,其表達水平的高低對乳腺癌患者是否發(fā)生骨復發(fā)轉(zhuǎn)移具有一定的提示作用。

GSEA可在基因組織水平根據(jù)數(shù)據(jù)分組,探尋其相關的生物功能、信號通路,展示相關基因在各組中的表達情況及其統(tǒng)計學意義,已被各種生物醫(yī)學大數(shù)據(jù)分析廣為應用[6]。筆者利用GSEA軟件,根據(jù)ER的臨床分子分型對乳腺癌復發(fā)樣本進行了分析,結果顯示有4條與骨組織代謝、骨發(fā)育相關的基因功能集被顯著富集。GSEA結果提示ER的臨床分型與乳腺癌細胞中骨組織代謝相關基因的表達有關。

乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移過程是乳腺癌細胞與骨微環(huán)境相互作用的一個復雜的演變過程。經(jīng)典的“種子與土壤”和“惡性循環(huán)”理論,形象地解釋了乳腺癌與骨微環(huán)境之間如何相互適應、相互影響并共同完成乳腺癌在骨組織的定植、生長,形成骨轉(zhuǎn)移,并造成骨損傷的過程[9]。在這一過程中,除了人體骨組織微環(huán)境這個富含各種生長因子的“肥沃的土壤”外,乳腺癌細胞所合成并釋放的成骨分化、破骨分化相關的蛋白,可促進腫瘤細胞對骨穩(wěn)態(tài)的破壞,并最終導致骨損傷[10]。這些由乳腺癌細胞表達的骨相關蛋白對于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移具有一定的指示作用。

為了尋找雌激素受體表達有關的乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移相關的基因,筆者對GSEA富集的數(shù)據(jù)集中顯著富集的基因的表達水平進行分析。其中SFRP1、TNFAIP3和NEK1均在骨復發(fā)和非骨復發(fā)乳腺癌樣本中差異表達,且其表達水平與雌激素受體的表達水平顯著相關。其中SFRP1和TNFAIP3顯著低表達于骨復發(fā)轉(zhuǎn)移組,且其表達水平與雌激素受體表達水平呈負相關;NEK1顯著高表達于骨復發(fā)轉(zhuǎn)移組,且其表達水平與雌激素受體表達水平呈正相關。SFRP1(secreted frizzled-related protein 1)是Wnt信號通路的負向調(diào)控因子,在成骨細胞和骨髓間充質(zhì)肝細胞分化的過程中發(fā)揮重要的負向調(diào)控作用[11, 12]。TNFAIP3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3,A20)是NF-κB信號通路的負向調(diào)控因子,可通過負向調(diào)控該通路信號轉(zhuǎn)導抑制破骨細胞生成[13]。NEK1(NIMA-related kinases 1)是一種磷酸激酶,參與了初級纖毛的形成,其表達缺陷與骨組織發(fā)育障礙有關[14, 15]。GSE2034數(shù)據(jù)集的分析結果提示,SFRP1、TNFAIP3和NEK1是與雌激素受體表達水平相關的,可能參與了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移復發(fā)的基因,可作為預測、治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子標志物。

尋找具有預測、診斷、治療價值的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子標志蛋白任重而道遠。本研究利用公用數(shù)據(jù)庫及多種生物信息學分析手段,對雌激素受體表達情況相關的乳腺癌復發(fā)骨轉(zhuǎn)移有關的生物學功能和基因進行了分析。乳腺癌具有高度異質(zhì)性,本研究分析所得的結果仍需大量的臨床樣本及生物實驗進行綜合驗證,旨在更準確地了解乳腺癌骨轉(zhuǎn)移機制,并為預測和治療乳腺癌提供科學依據(jù)。