體液因子及其相關miRNA 與慢性阻塞性肺疾病合并外周骨骼肌功能障礙的關系

那媛媛，劉朝暉，趙祝香，徐慧，梁志科，汪新龍

數據顯示，截至2015年，我國40歲以上人群慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）發病率已達14%；2019年全球確診COPD患者例數較1990年增加了85%［1］。隨著病情進展，COPD患者體質量及肌肉耐力不斷下降，運動能力不斷變差，從而引起一系列級聯反應；而外周骨骼肌功能障礙（peripheral skeletal muscle dysfunction，PSMD）作為COPD最常見的一種合并癥，是預測COPD患者預后的一個關鍵指標，且COPD患者一旦發生PSMD，其預后不良［2］。目前評估COPD患者合并PSMD的方法主要為CT檢查和MRI檢查，其可以直觀地測量患者的肌肉面積和觀察肌肉形態，且診斷準確性高，但CT檢查具有輻射性，對幼兒和妊娠期婦女危害較大；而MRI檢查費用高昂，且具有檢查時間長、檢查條件嚴苛的特點，不適用于危重癥患者［3］。因而尋找有效且方便無創的COPD合并PSMD的診療手段是非常有必要和有意義的。

研究發現，COPD患者肌肉中的蛋白質合成和降解均受到相關體液因子包括肌細胞增強因子2（myocyte enhacer factor 2，MEF2）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）4和血清應答因子（serum response factor，SRF）等的調控［4-7］。miRNA是一種長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，其依靠內源性基因編碼，主要生物學功能是調控基因的轉錄；在人類基因組中，共有1 700多種miRNA，且越來越多的miRNA被確定在人類的肌肉形成、發育和肌肉萎縮的損傷修復中起關鍵作用［8］，這為miRNA成為治療COPD合并PSMD的新靶點提供了依據。本研究旨在分析體液因子（MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF）及其相關miRNA與COPD合并PSMD的關系，以期為尋找更多COPD合并PSMD的治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2021年12月至2022年9月。

1.2 實驗動物 健康雄性C57BL/6小鼠11只（廣東省醫學實驗動物中心提供），8～10周齡，體質量為20～25 g。將小鼠飼養于12 h光照/12 h黑暗、溫度控制在26 ℃、溫差不高于3 ℃、濕度為40%～70%的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別的環境中，自由飲水和攝食，適應性飼養1周后開始動物實驗。本實驗經廣州醫科大學動物倫理委員會審批通過（倫理批號：2022102）。

1.3 主要實驗試劑和儀器 紅梅牌香煙（烤煙型，焦油量：1 3 m g）購自云南紅塔集團有限公司，MEF2A抗體（批號：AF6381）購自美國Affinity公司，IGF-1抗體（批號：BS6817）、HDAC4抗體（批號：BS6486）、SRF抗體（批號：BS9121）購自Bioworld Technology公司，HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：GB23303）、HRP標記的驢抗山羊IgG二抗（批號：GB23304）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號：GB23301）、HRP標記的山羊抗大鼠IgG二抗（批號：GB23302）、有機玻璃染毒箱（120 cm×80 cm×80 cm）購自湖南省凱達生物科技有限公司，DSI Buxco PFT動物肺功能檢測系統購自美國DSI公司，ECL化學發光液購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及干預方法 將11只健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組（n=6）與模型組（n=5）。對照組小鼠自由進食和飲水，不做任何處理。模型組小鼠采用煙熏法構建COPD合并PSMD模型，具體方法如下：將小鼠置于有機玻璃染毒箱內，點燃10支紅梅牌香煙進行煙熏，30 min/次，2次/d，兩次間隔時間至少為4 h，連續干預6個月。

1.4.2 觀察小鼠大體情況 實驗期間，觀察小鼠的呼吸（有無咳嗽、氣急、喘鳴等）、毛發（光澤度及脫落情況）、飲水和進食情況、活潑度以及對外界刺激的反應情況。分別測量兩組小鼠干預0、1、2、3、4、5、6個月時的體質量。

1.4.3 檢測小鼠肺功能指標 干預6個月后，采用1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射以麻醉小鼠，采用DSI Buxco PFT動物肺功能檢測系統檢測肺功能指標，包括50毫秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 50 millisecond，FEV50）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、每分通氣量（minute ventilation，MV）、氣道阻力（airway resistance，AR）、動態肺順應性（dynamic lung compliance，Cdyn）、吸氣峰流量（peak inspiratory flow，PIF）、呼氣峰流量（peak expiratory flow，PEF）。

1.4.4 小鼠胸大肌標本的收集 完成肺功能指標檢測后采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，在小鼠胸骨左側第3、4肋間沿胸大肌邊緣做一長為1 cm左右的切口，鈍性分離皮下組織達深筋膜淺面，向兩側適當分離皮瓣，銳性打開深筋膜，暴露胸大肌后將其剪下。將一部分胸大肌組織立即放入液氮內凍存，另一部分胸大肌組織置于4%甲醛溶液中保存。

1.4.5 HE染色檢測小鼠胸大肌組織肌纖維數量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積 取4%甲醛溶液中的小鼠胸大肌組織，進行脫水、石蠟包埋、切片處理，之后進行HE染色，采用中性樹膠封固，使用CaseViewer 2.2軟件掃描切片并截取3張400倍視野的截圖，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計數3個視野中肌纖維數量、肌纖維總面積，并計算橫切肌纖維平均面積（橫切肌纖維平均面積=肌纖維總面積/肌纖維數量）。

1.4.6 Western blot法檢測小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達水平 取50 mg液氮內凍存的小鼠胸大肌組織，解凍，用冷卻過的PBS沖洗干凈，然后裝入勻漿管內，添加已經被蛋白酶抑制劑裂解過的裂解液進行勻漿，再將勻漿管放入冰上裂解0.5 h，震蕩數次，直至組織完全被裂解；在4 ℃條件下將裂解組織以12 000 r/min的速率離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，分離出實驗所需要的小鼠胸大肌總蛋白溶液，采用100 ℃金屬浴加熱5 min以變性，進行SDS-PAGE，終止電泳后進行轉膜（轉膜條件為300 mA恒流轉膜0.5 h），快速涮洗轉印完的膜，室溫下封閉30 min，加入MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF抗體進行孵育，用TBST清洗3次、5 min/次，加入二抗（1∶5 000稀釋）后室溫下孵育30 min，用TBST清洗3次、5 min/次，在暗室中加入ECL化學發光液進行充分反應，然后進行壓片、顯影、曝光，從而分析目標蛋白表達水平。

1.4.7 預測Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA使用R語言multiMiR軟件包預測Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA；選取預測出的最相關的1%的miRNA，并使用Cytoscape 3.8.2軟件繪制mRNA-miRNA網絡圖；選擇Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf 4個基因中有交集的miRNA進行下一步實驗。

1.4.8 qPCR法檢測小鼠mmu-miR-466I-3p、mmumiR-705表達水平 取小鼠胸大肌組織50 mg，提取總RNA，并進行反轉錄，采用qPCR法檢測mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達水平。PCR條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環，72 ℃30 s。mmu-miR-466l-3p的上游引物為：5'-ACACT CCAGCTGGGATACACACACACATAC-3'，下游引物為：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT TGAGTAGTGTGT-3'；mmu-miR-705的上游引物為：5'-ACACTCCAGCTGGGGGTGGGAGGTGGGG-3'，下游引物為：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA ATTCAGTTGAGTGCCCACC-3'；內參U6的上游引物為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠大體情況 干預前，兩組小鼠均比較健康，飲水與進食正常，活潑好動，毛發有光澤，沒有咳嗽或打噴嚏等癥狀。干預過程中，模型組小鼠逐漸出現食欲不振，毛發逐漸失去光澤且顏色發黃，精神萎靡，活動量明顯減少，部分小鼠出現了打噴嚏癥狀；且煙熏時小鼠喜歡扎堆，倦怠蜷縮，出汗明顯，腹部脹大，呼吸急促，出現點頭運動甚至張口呼吸。干預0、1個月時，對照組和模型組小鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；干預2、3、4、5、6個月時，模型組小鼠體質量低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 對照組和模型組小鼠不同時間點體質量比較（±s，g）Table 1 Comparison of body mass between control group and model group at different time points

表1 對照組和模型組小鼠不同時間點體質量比較（±s，g）Table 1 Comparison of body mass between control group and model group at different time points

組別只數干預0個月干預1個月干預2個月干預3個月干預4個月干預5個月干預6個月對照組623.8±0.525.5±1.730.1±1.831.2±1.832.2±1.532.2±1.432.7±1.0模型組523.7±1.024.1±1.425.4±1.625.9±1.525.9±1.525.5±1.126.0±1.6 t值0.2011.3764.1264.8936.3747.7047.715 P值0.8480.2020.0030.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 肺功能指標 模型組小鼠FEV50/FVC低于對照組，MV、Cdyn小于對照組，AR大于對照組，PIF、PEF慢于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 對照組和模型組小鼠肺功能指標比較（±s）Table 2 Comparison of lung function indexes between control group and model group

表2 對照組和模型組小鼠肺功能指標比較（±s）Table 2 Comparison of lung function indexes between control group and model group

注：FEV50=50毫秒用力呼氣容積，FVC=用力肺活量，MV=每分通氣量，AR=氣道阻力，Cdyn=動態肺順應性，PIF=吸氣峰流量，PEF=呼氣峰流量；1 cm H2O=0.098 kPa

組別只數5022）PEF（ml/s）對照組60.46±0.1027.98±2.130.65±0.140.05±0.021.04±0.0421.97±1.04模型組50.33±0.0523.62±0.741.13±0.070.03±0.010.96±0.0414.51±3.92 t值2.8534.332-6.8512.7823.3914.140 P值0.0240.002＜0.0010.0340.0080.011

2.3 小鼠胸大肌組織肌纖維數量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積 模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數量少于對照組，肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積小于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖1。

表3 對照組和模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積比較（±s）Table 3 Comparison of the number of muscle fibers，the total area of muscle fibers and the average area of cross-cut muscle fibers in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

表3 對照組和模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積比較（±s）Table 3 Comparison of the number of muscle fibers，the total area of muscle fibers and the average area of cross-cut muscle fibers in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

組別只數 肌纖維數量（根）肌纖維總面積（mm2）橫切肌纖維平均面積（mm2/根）對照組661.4±12.00.08±0.010.002 2±0.000 8模型組548.8±19.60.07±0.010.001 5±0.000 5 t值-2.281-4.561-3.124 P值0.029＜0.0010.004

2.4 小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達水平 對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、HDAC4、SRF表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；模型組小鼠胸大肌組織中IGF-1表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of expression levels of MEF2A，IGF-1，HDAC4 and SRF in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

表4 對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of expression levels of MEF2A，IGF-1，HDAC4 and SRF in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

注：MEF2=肌細胞增強因子2，IGF-1=胰島素樣生長因子1，HDAC4=組蛋白去乙酰化酶4，SRF=血清應答因子

組別只數MEF2AIGF-1HDAC4SRF對照組60.84±0.33 0.62±0.21 0.65±0.27 0.35±0.26模型組51.03±0.44 0.91±0.17 0.84±0.08 0.52±0.15 t值-0.823-2.272-1.554-1.261 P值0.4310.0340.1560.240

2.5 Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA 沒有預測到任何關于Igf-1基因的miRNA，而可預測到較多關于Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA。選取最相關的1%的miRNA，結果顯示，Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA數目分別為7、33、16個，Mef2a、Srf基因共同受mmu-miR-466l-3p調控，Mef2a、Hdac4基因共同受mmu-miR-705調控。

2.6 小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達水平 對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達水平比較（±s）Table 5 Comparison of the expression levels of mmu-miR-466I-3p and mmu-miR-705 in mice between control group and model group

表5 對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達水平比較（±s）Table 5 Comparison of the expression levels of mmu-miR-466I-3p and mmu-miR-705 in mice between control group and model group

組別只數mmu-miR-466I-3p mmu-miR-705對照組61.17±0.702.79±2.46模型組51.47±0.683.88±2.03 t值-0.732-0.793 P值0.4950.451

3 討論

目前全球COPD發病率和死亡率均在逐年攀升，隨著年齡增長，患者活動受限，蛋白質分解增加，導致營養不良，同時大量使用類固醇類藥物等會引起PSMD；且COPD合并PSMD的病因復雜，慢性心功能不全、慢性腎功能不全、惡性腫瘤、結核、代謝性疾病（如糖尿病、甲狀腺功能亢進）等均可導致PSMD［8］。COPD合并PSMD的機制與肌肉蛋白質合成減少和分解增多導致機體蛋白質平衡被打破有關［9］。而在許多疾病中，肌肉蛋白質合成和降解均受到相關體液因子包括MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF等的調控［10］。此外，包括miRNA調控在內的表觀遺傳事件已成為COPD合并PSMD的研究熱點。研究顯示，骨骼肌中大量表達的miRNA可以作為診斷COPD合并PSMD的分子標志物［11-12］。本研究旨在分析MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF及其相關miRNA與COPD合并PSMD的關系。

研究顯示，COPD合并PSMD患者不僅表現為氣促、咳嗽、呼吸困難等，還會出現肺功能異常，同時也會出現軀體總質量下降、骨骼肌萎縮，在分子層面上表現為骨骼肌相關蛋白質合成減少、降解增加［13］。本研究結果顯示，干預過程中，模型組小鼠逐漸出現食欲不振，毛發逐漸失去光澤且顏色發黃，精神萎靡，活動量明顯減少，部分小鼠出現了打噴嚏癥狀；且煙熏時小鼠喜歡扎堆，倦怠蜷縮，出汗明顯，腹部脹大，呼吸急促，出現點頭運動甚至張口呼吸；干預2、3、4、5、6個月時，模型組小鼠體質量小于對照組；模型組小鼠FEV50/FVC低于對照組，MV、Cdyn小于對照組，AR大于對照組，PIF、PEF慢于對照組；模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數量少于對照組，肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積小于對照組；提示COPD合并PSMD模型構建成功。

COPD合并PSMD患者的主要表現是機體骨骼肌發生器質性和功能性改變。MEF2屬于有絲分裂阻滯缺陷蛋白（mitotic arrest deficient，MAD）家族成員，是一種轉錄因子，其主要作用是調控肌肉發育過程［14］。IGF-1主要來源于肝細胞，其不僅可以調控肝細胞的功能，還可以調控一些其他組織如骨骼肌、心肌、腦的功能［10］。HDAC是細胞內重要的一種蛋白，其可以調控基因的轉錄，即協同組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）使蛋白乙酰化和去乙酰化達到動態平衡，從而維持基因轉錄的穩定性［15］。在有脊椎動物中，HDAC分為四種亞型，即HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4，目前研究最多的亞型是HDAC4，其主要作用是調控機體內的葡萄糖代謝和脂類代謝，抑制葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT 4）和肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）基因轉錄，從而抑制骨骼肌、心臟及大腦等的功能［16］。研究顯示，HDAC4可抑制卵泡抑素的表達，而卵泡抑素有拮抗肌肉細胞生成的作用，可導致肌肉質量的損失［17］。SRF是MAD轉錄因子家族一員，其在生物體的生長發育和信號傳導中發揮著重要作用，如調控骨骼肌細胞、心肌細胞或平滑肌細胞中的基因轉錄［18］。本研究結果顯示，模型組小鼠胸大肌組織中IGF-1表達水平高于對照組，提示COPD合并PSMD可能與IGF-1表達水平升高有關，分析原因為：COPD合并PSMD時，機體為了代償，會產生更多的IGF-1來修復肌肉損傷［16］。但本研究結果還顯示，對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、HDAC4、SRF表達水平比較，差異無統計學意義，分析原因可能與本研究樣本量較小或者實驗重復次數不足有關，尚需要大樣本量的研究進一步證實。

目前關于COPD合并PSMD相關miRNA的研究大多集中在少數幾個miRNA，如miR-1、miR-133、miR-206等，在龐大的miRNA家族里，應該可以挖掘出更多可以作為COPD合并PSMD診斷和治療靶點的miRNA［19］。本研究選擇MEF2A、SRF、HDAC4和IGF-1 4個肌肉萎縮相關分子進行溯源，即檢索Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA，結果顯示，沒有預測到任何關于Igf-1基因的miRNA，而可預測到較多關于Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA；選取最相關的1%的miRNA，結果顯示，Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA數目分別為7、33、16個，Mef2a、Srf基因共同受mmu-miR-466l-3p調控，Mef2a、Hdac4基因共同受mmu-miR-705調控。進一步比較對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達水平，但差異無統計學意義，提示mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705與COPD合并PSMD可能無關，也可能與multiMiR軟件包內所收集數據有限有關。

綜上所述，IGF-1與COPD合并PSMD可能有關，而MEF2A、SRF、HDAC4與COPD合并PSMD可能無關，且調控Mef2a、Hdac4、Srf基因的mmu-miR-466I-3、mmu-miR-705與COPD合并PSMD可能無關。但本研究尚存在一定局限性：（1）樣本量較小，未來可以考慮增加樣本量以減少隨機誤差；（2）雖然人和小鼠的基因有很大的同源性，但COPD合并PSMD患者與COPD合并PSMD模型小鼠依然存在很大區別，除了物種不同，前者還常受到外界環境、醫療干預等的影響。

作者貢獻：那媛媛、劉朝暉進行文章的構思與設計；那媛媛進行研究的實施與可行性分析、數據收集、統計學處理，撰寫論文；趙祝香進行數據整理；徐慧、梁志科、汪新龍進行結果的分析與解釋；劉朝暉對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。