二十二碳六烯酸拮抗動脈粥樣硬化預防腦卒中的機制

宋 婷 莊文欣 孫秀寧 王炎強

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性、進行性的炎性狀態,以血管炎和內皮下脂質沉積為特征,是缺血性腦卒中的主要致病因素。動脈粥樣硬化的特點是大量的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)被巨噬細胞(macrophage,Mφ)吸收轉化為泡沫細胞,形成脂肪條紋,血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)遷入內膜吞噬脂質并形成纖維斑塊。當斑塊破裂時,形成血凝塊,阻塞血管,減少血流。內皮功能障礙、炎癥、血管平滑肌細胞增殖等細胞反應可引起血管壁的慢性病理重塑,促進動脈粥樣硬化和血栓事件,導致腦血管疾病[1]。

ω-3 PUFAs與ω-6 PUFAs競爭替代膜磷脂中花生四烯酸,從而減少二十烷酸的產生,產生抗炎作用。研究證明補充ω-3 PUFAs可以降低頸內動脈粥樣硬化和顱內動脈粥樣硬化的風險,降低AS相關性血栓卒中發生[2～4]。DHA是ω-3 PUFAs的亞型之一,通過相關分子和信號通路作用于血管內皮細胞(endothelial cell,EC)、Mφ和VSMC,緩解炎性反應、激活細胞自噬、抗VSMC轉分化等,來改善內皮功能障礙,對降低頸動脈及顱內動脈粥樣硬化風險、預防缺血性腦卒中發揮作用[5, 6]。

一、DHA改善內皮細胞功能障礙

1.DHA介導白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)對ECs剪切應力的作用:IL-1的主要作用是調節白細胞的遷移和積聚,也會促進內皮功能障礙,這是AS發病的一個主要過程,所以IL-1在AS發生、發展機制中發揮關鍵作用。血流流經血管時形成流體剪切應力,ECs可對該剪切應力的微小變化做出反應,造成形態受損和功能障礙。血管AS形成的難易程度取決于血管的解剖位置和血流動力學模式。在直血管中,層狀剪切應力(laminar shear stress,LSS)對ECs有保護作用,此處不易形成動脈斑塊;在分叉或彎曲血管,振蕩剪切應力(oscillatory shear stress,OSS)升高類二十烷酸代謝產物如PGD2、PDE2等導致血管炎癥,引起血管內皮障礙。Mabruka等[7]研究發現DHA改善內皮功能的機制之一是介導IL-1作用降低OSS,可能通過以下機制作用:減少IL-1誘導的IL-8、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、分泌因子等生物趨化劑;通過黏度的變化改變血管系統中的血流模式,降低OSS、下調血壓,減輕血流對血管壁的沖擊所致內皮損傷;促炎性細胞因子IL-1β主要由AS斑塊中巨噬細胞激活釋放,它增加了輔助型T細胞的激活,Th17誘導免疫反應,促進斑塊形成,而DHA抑制IL-1激活,使局部的IL-1β表達降低,從而防止AS斑塊形成。

2.DHA抗氧化應激作用:機體氧化產生的自由基其產生和吸收之間不平衡導致自由基過量,損害內皮細胞,這是AS的誘發因素。氧化損傷發生在AS的不同階段,早期損傷由于過度暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)而損害內皮細胞。參與AS血栓形成的ROS的主要來源是NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和脂氧合酶等促氧化系統[8]。

(2)eNOS引起的氧化應激:NO多在NOS催化下產生,由ECs分泌,可調節血管張力、結構在局部改變血管彈性。內皮細胞的損傷導致血管擴張因子的合成減少,反之,收縮因子的產生增加,導致血管張力增加,甚至引起明顯的血管收縮[10]。Tannaz等[11]先以飽和脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid,PAL)誘導AS模型,再用40mmol/L DHA孵育來研究DHA對AS的作用機制,結果表明PAL對ECs有毒性作用,而DHA可改善PAL引起的ECs活力下降,提高存活量。Saeede等[12]進一步發現暴露于40mmol/L DHA后,可提高人臍靜脈內皮細胞的活力,下調血清正五聚體蛋白3(pentraxin3,PTX3)、eNOS表達,NO水平增加,纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、血小板源性生長因子β(platelet derived growth factor β,PDGFβ)和纖維蛋白原α1(fibrinogen α1,FGA1)的表達降低。其中,PTX3在Mφ、ECs、VSMCs中均有表達,隨炎性狀態而增加,反過來與Ox-LDL作用加劇AS[13, 14]。PAI-1可能增強凝血功能,增加血栓形成的風險。PDGFβ參與VSMC遷移、血小板聚集。FGA1可改變血管內皮通透性,易導致動脈斑塊的發生,纖維蛋白原與白蛋白比值(fibrinogen to albumin ratio, FAR)可以較好地預測頸動脈斑塊的不穩定性[15]。炎性反應、凝血異常、血壓過高和血小板功能是影響AS進展的因素,DHA通過調控這些因素的基因以延緩AS改變。另外,Abriz等[16]研究認為糖尿病易發生AS可能由于胰島素干擾NO的釋放,研究了小鼠PAL誘導的AS模型中單用或聯用胰島素、DHA,結果顯示胰島素、DHA處理組可減少炎性細胞因子產生、促進NO的生成和生物利用度,改變ECs經PAL處理后的動態生長和功能障礙活性。

(3)MPO引起的氧化應激:MPO在炎性條件下從中性粒細胞和單核細胞中釋放,并在細胞外液中促進氧化應激。MPO可氧化LDL形成Mox-LDLs,引起ECs促炎效應,激活巨噬細胞形成泡沫細胞,促進動脈斑塊形成過程。DHA及其衍生物保護素DX(protectin DX,PDX)通過抑制NOX的激活和減少MPO的釋放,阻止了一系列級聯反應;Mox-LDLs對DHA合成溶解素D1(resolvin D1,RVD1)中起重要作用,RVD1可以在納克/毫升(ng/ml)水平上促進炎癥緩解[17]。

3.DHA介導Ang-2/Tie-2凋亡通路:血管緊張素-1/酪氨酸激酶受體-2(angizopoietin-1/tyrosine kinase receptor-2,Ang-1/Tie-2)通路參與ECs活化、遷移、增殖和分化過程。Ang-1主要來源于血管平滑肌細胞、血管周細胞,誘導Tie-2受體的自磷酸化,激活與細胞存活相關的磷酸肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase b, PI3K/Akt)信號通路,增加相關蛋白的表達、穩定內皮細胞縫隙連接[18]。Ang-2存在于人腦微血管內皮細胞的Weibel-Palade體中,在缺氧或炎癥刺激時,Ang-2釋放與Ang-1競爭Tie-2受體的結合,導致Tie-2自磷酸化減少、激活受損。Ang-2水平受DHA抑制,作用機制可能與環氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、PGE2和PGI2水平有關。DHA與其受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)結合后,PPARγ會從細胞質內轉位到細胞核,通過調控COX-2負性調節Ang-2和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的轉錄。Yu等[19]研究表明DHA減少Ang-2(Ang-1/Ang-2比值升高)和VEGF的合成,進而調控Ang-1/ Tie-2通路,減少動脈ECs凋亡數量,穩定人腦微血管內皮細胞之間的連接。

4.DHA調控細胞焦亡通路:細胞焦亡是一種炎癥調控性細胞死亡,腦卒中、感染等刺激炎性胱天蛋白酶(caspase)活化,導致Gasdermin(GSDM)蛋白家族激活形成質膜孔道,經過一系列反應最終破裂釋放炎性細胞因子IL-1β、IL-18、高遷移率族蛋白B1等。

高同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)是動脈粥樣硬化的獨立危險因素,能抑制ECs生長,導致內皮損傷后的修復受損、血管重塑,并能協同內毒素LPS誘導焦亡[20]。NOD樣受體3(nod-like receptor3,NLRP3)通過連接蛋白與caspase-1結合,激活依賴于caspase-1活化的炎性小體,誘導細胞凋亡。HCY協同LPS導致血管炎癥和AS的主要機制可能是增加NLRP3的含量。另外,HCY誘導的細胞內氧化梯度的變化可導致線粒體功能障礙以及內皮功能障礙,因為細胞色素C釋放和caspase-1激活,ECs中Bax/Bcl-2比率增加,導致caspase-9/3級聯激活和EC凋亡[21]。相反,對中老年高脂血癥的臨床研究表明,血漿HCY水平和血漿DHA磷脂水平之間存在負相關。為驗證兩者之間的關系及作用機制,Huang等[22]測定了用DHA處理后的HepG2細胞的HCY合成代謝酶的表達水平,結果表明DHA能上調代謝酶胱硫氨酸-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)和亞甲基四氫葉酸還原酶(5-methyltetrahydrofolate reductase,MTHFR)、下調合成酶甲硫氨酸腺苷轉移酶(methionine adenosyltransferase,MAT)的mRNA表達,從而降低HCY濃度,阻止HCY誘導的細胞焦亡[14]。

5.DHA 調節AS信號通路的其他機制:信號通路可觸發級聯反應致ECs損傷、功能障礙,進一步引起AS,而DHA可通過調節形成AS過程中的信號通路來減少內皮細胞死亡、促進內皮受損修復。DHA降低促炎性基因(如IL-1R1、IL-2、IL-4、TNF-α等)和黏附分子[如CD44、選擇素E、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adheson molecule-1,VCAM-1)、細胞內黏附分子-1(inter cellular adhesion molecule-1,ICAM-1)等]表達水平,控制炎性反應,減少白細胞與ECs相互黏附作用,ECs增殖增加[23]。DHA減少促凋亡基因(BAX、BID)的表達,激活抗凋亡基因(Bcl-2、CCL2、CFLAR),從而減少ECs的凋亡缺陷。細胞外基質的降解、斑塊的不穩定性與基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)有關,DHA可能通過降低ECs中MMP1、MMP3水平來防止細胞外基質降解并維持ECs之間的連接。另外,DHA提高vwf和kdr/VEGFR-2的轉錄,可能參與血管生成。

二、DHA調控巨噬細胞作用

1．DHA介導TLR/NF-κB抗炎信號通路:動脈粥樣硬化斑塊內的大量巨噬細胞來源于血管內Mφ,它們可以通過細胞內的模式識別受體(如炎性小體) 和細胞膜上的模式識別受體如Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)被激活。DHA介導多種信號途徑,調節關鍵的動脈粥樣硬化基因,抑制促炎因子的激活,減少炎性反應。

TLR4/核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路具有重要促炎作用,因此可能對AS的形成和進展也有重要影響,其中TLR4在ECs、Mφ和VSMCs中均有表達。當脂多糖結合TLR4時,脂多糖結合蛋白(TLR4/CD14/LBP)復合體參與髓樣分化因子88(myeloid differentiation fator,MYD88)啟動下游信號級聯(信號傳遞通路為MYD88→IRAK1/IRAK4復合物→TRAF6→TAK1/TAB2復合物)來磷酸化炎癥轉錄因子NF-κB的抑制單位IB,從而觸發NF-κB并激活編碼促炎因子的基因,控制多種細胞因子的表達。DHA可通過與G蛋白偶聯受體-120結合,抑制轉化生長因子-β激活激酶1(TGF-β activated kinase-1,TAK1)對IκB激酶(inhibitor of IκB kinase,IKK)的磷酸化,從而抑制NF-κB的下游,減少促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、MCP-1、IL-6和IL-1β的產生[24]。

TLR2/4-絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)是誘導動脈炎癥的另一信號級聯通路。TLR2/4激活MYD88/TIRAP復合物,導致激活的級聯效應(通過MYD88→IRAK1/IRAK4→TRAF6→TAK1/TAB2復合物),而TAK1磷酸化激活ERK、MEK、JNK和p38。這些活化的MAPK可結合和刺激其他激酶靶點,轉移到細胞核內作用于激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)調控促炎因子的轉錄和表達。此外,NF-κB也參與TLR2/4-MAPK的下游信號通路。

2.DHA激活巨噬細胞自噬作用:缺血性腦卒中時,神經細胞的缺血和缺氧會引發自噬,自噬也會清除受損的細胞器,并利用分解的原料和能量幫助大腦短期克服缺血造成的能量不足。在人類及老鼠的AS斑塊中均發現自噬標志物微管相關蛋白1的輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)和銜接蛋白螯合體1(sequestosome-1,SQSTM1/p62),LC3-Ⅱ參與了自噬小體的形成,而SQSTM1/p62輸送底物至自噬體降解[25]。Wang等[26]在FO飲食(10%熱量的棕櫚油+10%熱量的魚油)喂養的骨髓特異自噬相關基因Atg5缺失的ILD-/-小鼠中,發現骨髓自噬基因缺乏顯著抑制FO誘導的AS保護,如中性脂質積累、壞死核心形成、CD68+及CD3+細胞染色,促炎基因C-X-C基序趨化因子配體10(c-x-c motif chemokine ligand 10,CXCL10)分泌增加。DHA可能通過SQSTM1/p62途徑激活Mφ自噬,激活了紅細胞衍生核因子2樣蛋白2(nuclear factor, erythroid 2 like 2, NFE2L2/NRF2),NFE2L2的表達與抗炎型Mφ形成相關,同時抑制了CXCL10的活化。因此,Mφ的自噬可能通過以下機制保護AS:自噬增強Mφ的胞質作用,促進細胞生存;Mφ將脂滴運送到溶酶體,在那里被水解為游離膽固醇,促進泡沫細胞ABCA-1依賴性膽固醇外流,降低泡沫細胞的形成速度;自噬減少線粒體ROS的產生和釋放,防止線粒體功能紊亂;Mφ分為促炎表型(M1)和抗炎表型(M2),自噬可激活M2型和抑制M1型激活抗炎;自噬參與抑制NLRP3炎性小體,減少細胞凋亡。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性對自噬體的形成和成熟至關重要,DHA可抑制因腦缺血高表達的mTOR,提高自噬水平,從而保護腦組織。孫而藝等[27]建立了SD大鼠永久性局灶腦梗死模型,證明DHA負性調控mTOR信號通路,激活細胞自噬,從而減輕缺血半暗帶區的腦組織損傷。

三、DHA對抗血管平滑肌細胞表型轉換

收縮型VSMC可在AS過程中轉化為合成型。VSMC遷移至動脈病變部位后,能合成和分泌細胞外基質蛋白,交聯形成纖維蛋白,這是AS發生的基礎之一。DHA可對抗VSMC表型轉換,該調控作用可能通過參與不穩定斑塊的形成的蛋白激酶α2介導。此外,TNF-α可能參與VSMC表型轉化和血管重塑,VSMC轉化為合成型,增殖性合成和纖維化交聯增加,形成新內膜。而TNF-α誘導的COX-2也在VSMC表型轉化中起重要作用,COX-2調節血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)和PGD2的產生,并調節收縮性VSMC向合成表型的去分化,這是由PGD2調節ERK信號通路實現的。前面DHA抗炎作用中已經提及,DHA可通過調節相關信號通路基因抑制TNF-α的表達,故能對抗VSMC的表型轉換,從而抗AS、預防腦卒中。

綜上所述,DHA不僅對缺血性腦卒中有神經保護作用,而且通過其代謝物和衍生物的直接和間接作用,減少受損動脈中的炎性反應、氧化應激、細胞凋亡、細胞焦亡和自噬,從而有效防治缺血性腦卒中。因動脈粥樣硬化是多因素、多環節的病變過程,其形成機制是相互聯系的,如氧化應激能激活內皮細胞缺陷自噬,自噬能抑制焦亡通路中炎性小體的激活,炎性小體與炎性反應和細胞焦亡都密切相關,其作用通路之間的聯系、抗AS作用的治療靶點及DHA的給藥時間、最佳劑量濃度等仍需進一步探索。