藏藥徳孜陽新醇提物對胃癌細胞SGC-7901遷移的影響※

易 云,江亞惠,楊生璽,拉青才讓,2,趙延禮*

(1.青海大學醫學部,西寧 810001;2.青海省海南藏族自治州藏醫院,共和 813000)

本課題組前期研究發現德孜陽新(DZYX)醇提物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用,本研究通過將DZYX醇提物作用于人胃癌細胞SGC-7901來驗證其對胃癌細胞遷移的影響,并進一步探究DZYX抗胃癌的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 細胞株

人胃癌細胞株SGC-7901購于武漢普諾賽公司;SGC-7901細胞株來源于胃腺癌患者的淋巴結轉移灶,具有高轉移、高侵襲性。

1.1.2 主要實驗試劑

DZYX由青海省海南州藏醫院提供。高糖DMEM培養基和胎牛血清購自美國Corning公司;CCK-8試劑盒(批號C6102030)購自上海翊圣生物科技有限公司;Actin-Tracker Green(微絲綠色熒光探針)試劑盒購自上海碧云天公司;β-actin、p-mTOR、P-AKT 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;MMP-2抗體購自澳大利亞Affinity公司。

1.1.3 儀器設備

倒置顯微鏡及Ti2-E型熒光顯微鏡購自日本Nikon公司;多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司;RTCA DP實時無標記細胞功能分析儀購自美國Agilent公司;PowerPac Universal型電泳儀、Mini PROTEAN Tetra Cell型電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DZYX提取與配制

研磨DZYX丸劑,稱取60 g DZYX粉末浸泡于95%乙醇中過夜;次日回流提取3次,將提取物過濾后進行旋轉蒸發濃縮,干燥得到DZYX醇提物。稱取DZYX醇提物6 g溶于10 mL DMSO中配制成濃度為600 mg/mL的DZYX醇提物母液;經0.22 μm濾膜過濾后分裝,置-20℃ 冰箱儲存。

1.2.2 實驗分組

實驗設置對照組(含1‰ DMSO)、陽性對照順鉑組(10 μg/mL DDP)和DZYX組。DZYX組采用完全培養基稀釋并過濾DZYX醇提物,配制成濃度為200、400、600 μg/mL的液體。

1.2.3 CCK-8實驗

以CCK-8法觀察不同濃度的DZYX醇提物對SGC-7901細胞增殖的影響:取處于對數生長期的SGC-7901細胞,按照每孔5×103個細胞均勻鋪于96孔板中,待細胞完全貼壁后按照分組設計更換為不同濃度的含藥培養基,分別培養24、48 h后,每孔加10 μL的CCK-8溶液,避光孵育1 h,用酶標儀測量450 nm處的吸光度值(每組設置6個復孔)。

細胞活力=[OD(加藥組)-OD(空白組)]/[OD(對照組)-OD(空白組)]×100%

1.2.4 細胞動態遷移曲線(RTCA)檢測

取CIM Plate 16孔板,下室加入165 μL含血清培養基,上室加30 μL無血清培養基,平衡1 h后置于RTCA Station上測基線;收集對數生長期的SGC-7901細胞,用無血清培養基配制細胞濃度為8×105個/mL的懸液;取出板子,每孔按實驗分組加入50 μL無血清含藥培養基,再加入50 μL細胞懸液,輕輕拍打混勻;在超凈臺內靜置30 min后上機檢測RTCA。

1.2.5 Wound healing實驗

取SGC-7901細胞鋪滿六孔板,利用100 μL槍頭在細胞培養皿中劃出3道豎線,用PBS清洗3次,對照組加入含DMSO的無血清培養基,實驗組加入含DZYX醇提物(濃度為400 μg/mL)的無血清培養基繼續培養,0、24、48 h時在倒置顯微鏡下拍照觀察。

細胞遷移率=細胞遷移面積/細胞劃痕面積。

1.2.6 Transwell實驗

收集對數生長期SGC-7901細胞。在Transwell小室內接種無血清的含不同濃度藥物的細胞懸液200 μL,細胞密度為1×106個/mL,將Transwell小室放入培養板中,Transwell下室為含10%胎牛血清的DMEM培養基(600 μL),置培養箱繼續培養24 h,取出Transwell小室,用PBS洗滌3次,以棉簽擦拭小室聚碳酸酯膜表面細胞,用4%多聚甲醛固定10 min、0.1%結晶紫染液染色15 min,用PBS洗滌3次小室至透明,干燥后置顯微鏡下觀察并隨機選取3個視野計算遷移細胞個數。

1.2.7 細胞骨架染色

消化收集SGC-7901細胞并將細胞濃度調整為2×104個/mL;于六孔板孔中央滴加20 μL完全培養基,用鑷子將蓋玻片放入孔中央,使其完全吸附于六孔板;每張玻片上滴加500 μL細胞懸液,置培養箱培養5 h,細胞貼壁后,貼緊側壁緩慢加入2 mL完全培養基,孵育過夜后更換含藥培養基(對照組含1‰ DMSO,實驗組含濃度為400 μg/mL的DZYX醇提物),置培養箱培養24 h后棄含藥培養基,用PBS洗滌3次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛,于室溫固定15 min,用預冷PBS洗滌;每孔加入1 mL TritionX-100,于室溫孵育10 min,用含0.1% TritionX-100的PBS洗滌3次,在載玻片上滴加200 μL Actin-Tracker Green稀釋液(1:100),于室溫孵育30 min;每孔加入200 μL DAPI染液,于室溫孵育5 min,用PBS洗滌3次,吸盡蓋玻片多余液體,最后滴加抗熒光淬滅劑,置共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.8 SGC-7901細胞中的MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平檢測

用濃度為400 μg/mL的DZYX醇提物處理SGC-7901細胞 24 h,裂解提取蛋白質。SDS-PAGE實驗完成后,將蛋白樣品轉移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶于常溫封閉1 h。用PBST洗膜3次,孵一抗后置冰箱(4℃)過夜,用PBST洗膜3次后孵二抗,再次用PBST洗膜3次后加發光液顯影,用Image J軟件分析。以β-Actin為內參,計算MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達水平。

目標蛋白的相對表達量(IOD)=目標蛋白的灰度值/β-Actin灰度值。

1.2.9 轉錄組學分析

從對照組SGC-7901細胞和用600 μg/mL DZYX醇提物處理24 h的SGC-7901細胞中提取RNA(每組重復3次)。使用分子生物學設備對RNA樣品的純度、濃度和完整性進行檢查,以保證樣品合格。富集mRNA后,構建cDNA文庫,然后在Illumina Novaseq系統上進行批量RNA測序和轉錄組分析,此過程委托Biomarker Technologies公司(中國北京)進行。采用DESeq2樣本進行差異分析,設定︱log2FC︱≥2、FDR<0.01,對6個樣品進行差異基因篩選并繪制火山圖對結果進行可視化分析。將FPKM作為基因表達水平的衡量標準進行差異性基因表達分析,然后對差異表達基因進行了GO富集分析和KEGG通路富集分析。利用GeneCards數據庫收集上皮間質轉化(EMT)相關基因,與藥物作用后的差異表達基因進行交集分析,同時對藥物作用后出現差異表達的主要遷移相關基因進行基因表達量分析,進一步探討DZYX醇提物對胃癌細胞遷移的抑制作用及機制。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 CCK-8實驗

與對照組比較,不同濃度DZYX醇提物分別作用SGC-7901細胞24、48 h可抑制胃癌SGC-7901細胞活性,且呈濃度依賴性,差異有統計學意義(P<0.01)。(表1)

表1 DZYX 醇提物對SGC-7901細胞活性的影響

2.2 RTCA實驗

監測胃癌SGC-7901細胞動態遷移數量發現,在不同濃度DZYX醇提物處理下,胃癌細胞的遷移數量降低,且隨DZYX醇提物濃度的增加,遷移的細胞數量明顯下降,具有濃度依賴性,差異有統計學意義(P<0.01)。提示DZYX醇提物具有抑制胃癌SGC-7901細胞遷移作用,根據RTCA實驗結果,選取濃度為400 μg/mL的DZYX醇提物做后續實驗。(圖1,表2)

圖1 DZYX醇提物對SGC-7901細胞遷移的影響

表2 RTCA實時遷移曲線定量分析結果

2.3 Wound healing實驗

Wound healing實驗結果顯示,相較于對照組,DZYX醇提物作用于胃癌SGC-7901細胞24 h和48 h后,傷口愈合趨勢減弱,劃痕愈合率降低,差異有統計學意義(P<0.01),表明DZYX醇提物能降低劃痕愈合率,抑制胃癌細胞遷移。(圖2,表3)

*Yuan Peng is President of China Institutes of Contemporary International Relations.

圖2 SGC-7901細胞遷移圖(×100)

表3 SGC-7901細胞遷移率

2.4 Transwell實驗

為進一步驗證DZYX醇提物抑制胃癌細胞遷移的能力,DZYX醇提物作用胃癌SGC-7901細胞24 h后的Transwell實驗結果顯示,DZYX醇提物作用胃癌SGC-7901細胞穿越Transwell小室的細胞數目遠低于正常對照組,細胞遷移率降低,差異有統計學意義(P<0.01)。(圖3,表4)

圖3 SGC-7901細胞遷移圖(×40)

表4 SGC-7901細胞遷移數目

2.5 細胞骨架染色實驗

腫瘤細胞的遷移運動離不開細胞骨架,鬼筆環肽熒光染料能與細胞骨架中的F-actin蛋白特異性結合。置激光共聚焦顯微鏡下觀察發現,與對照組相比,經DZYX醇提物處理后,SGC-7901細胞內F-actin聚合纖維絲的數量顯著減少,細胞表面的絲狀偽足減少甚至消失,細胞骨架斷裂成團,表明DZYX醇提物能夠抑制微絲的生成,促使細胞骨架斷裂,導致胃癌細胞失去黏附收縮能力,從而抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移。(圖4)

圖4 經鬼筆環肽染色的細胞骨架(×400)

2.6 蛋白表達測定實驗

與對照組比較,DZYX醇提物能夠誘導SGC-7901細胞中的MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平下降,差異均具有統計學意義(P<0.05),提示DZYX醇提物可能通過下調MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平抑制胃癌細胞遷移。(圖5,表5)

圖5 DZYX對細胞遷移和PI3K/AKT信號通路相關蛋白的影響

表5 p-AKT、p-mTOR及MMP-2蛋白含量

2.7 轉錄組學分析

通過轉錄組學分析,并與Control組比較,在經600 μg/mL DZYX醇提物處理24 h的SGC-7901細胞中發現了2 338個差異基因,其中下調基因1 472個、上調基因866個。(圖6)

圖6 差異表達基因火山圖

在GeneCards數據庫中檢索到與EMT相關的基因4 869個,將其與篩選出的差異基因進行韋恩分析后,2個集合共有交集基因587個,表明DZYX醇提物對EMT過程有一定影響,存在潛在靶點(圖7)。

圖7 DZYX醇提物與EMT相關基因韋恩圖

從差異基因中可直接篩選到部分與遷移相關的MMPs家族基因MMP-1、MMP-11、MMP-13、MMP-24及EMP-1基因,經GEPIA網站驗證,上述MMP基因在胃癌中均高表達,基因表達量熱圖顯示DZYX醇提物可直接降低MMP-11、MMP-13、MMP-24的表達并上調EMP-1,提示了其對胃癌細胞遷移的抑制作用。(圖8)

圖8 遷移相關基因表達量熱圖

將差異基因經GO功能富集分析發現,在細胞組分上主要影響細胞膜(integral component of membrane membrane)、整合素(integrin complex)及層粘連蛋白(laminin complex laminin-2 complex)等;在生物學過程中主要富集在信號轉導、細胞通訊及細胞凋亡調控等過程(圖9)。

KEGG信號通路富集分析發現,差異基因顯著富集的通路有腫瘤相關通路(Pathways in cancer)、PI3K-AKT信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細胞因子-受體相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、RAS信號通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)及焦點粘附通路(Focal adhesion)。(圖10)

A:KEGG氣泡圖;B:Focal adhesion基因表達量聚類熱圖;C:Focal adhesion蛋白互作圖

3 討論

有效抑制腫瘤細胞轉移對于提高患者生存期具有重要意義。近年來,中藏藥治療腫瘤轉移逐漸受到關注,其中許多方劑已被闡明具有良好的抗轉移效果。解毒三根湯廣泛應用于結腸癌的治療,此藥通過下調Hippo信號通路中的TAP、TAZ基因表達逆轉上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),抑制結腸癌SW480細胞的侵襲和轉移[1,2]。研究表明,中藥補肺湯能夠抑制肺癌A549細胞的轉移和侵襲,其作用機制可能與抑制EMT相關蛋白的表達以及激活Smad信號通路有關[3]。中藥T33作用于乳腺癌MDA-MB231、MCF-7細胞后,可顯著抑制乳腺癌細胞遷移,并呈濃度依賴性[4]。本研究利用Transwell、Wound healing以及RTCA等多種實驗方法驗證DZYX醇提物對胃癌SGC-7901細胞遷移的影響。轉錄組學結果表明,DZYX醇提物與EMT相關基因存在潛在靶點,能夠抑制SGC-7901細胞的遷移并影響胃癌細胞的侵襲。

腫瘤細胞轉移是一個多步驟、多階段的復雜過程。在此過程中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)起到了關鍵作用,MMPs通過降解細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中的各種蛋白質組分破壞ECM的完整性,導致腫瘤細胞向遠處轉移[5]。研究[6]發現,胃癌組織中的MMP-2和MMP-9表達率高達58.3%和50.0%。許多中藥可以通過抑制MMPs的表達影響腫瘤細胞的轉移。研究[7]發現,中藥胃腸安可降低人胃癌細胞MKN45的侵襲和遷移能力,其機制可能與下調MMP2、MMP-9蛋白水平直接相關。中藥隱丹參酮通過下調結腸癌CT26細胞中的MMP-2、MMP-9蛋白表達水平抑制結腸癌細胞的遷移、侵襲[8]。本研究在蛋白水平檢測經DZYX醇提物處理后的人胃癌細胞SGC-7901中的MMP-2的表達情況,結果顯示,細胞中的MMP-2蛋白表達水平顯著降低,表明DZYX醇提物能抑制胃癌細胞中MMP-2的表達,可能是其抑制SGC-7901細胞遷移的機制之一。轉錄組學結果顯示,DZYX醇提物同時能降低MMP-11、MMP-13、MMP-24基因的表達,提示其對胃癌細胞遷移的抑制作用與抑制MMPs的表達有關。

細胞骨架由微絲、微管和中間纖維三個部分組成,起到維持細胞結構和形狀,協調細胞運動、細胞分裂和細胞內運輸等作用,其中微絲由大量肌動蛋白組成,肌動蛋白以單體(G-肌動蛋白)或聚合形式(F-肌動蛋白)組成存在于細胞中[9]。研究[10]表明,重塑細胞骨架具有抑制腫瘤細胞遷移的作用,小扁豆凝集素通過降低肝癌細胞中肌動蛋白的含量使細胞骨架變得松散,重排細胞骨架可抑制肝癌細胞的遷移。研究[11]發現,脂蟾毒配基明顯下調卵巢癌細胞中肌球蛋白Ⅱ表達水平,通過抑制肌動蛋白細胞骨架聚合、下調PI3K/AKT信號通路,降低卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。以上研究均證明減少細胞骨架中肌動蛋白含量、重排細胞骨架能夠影響腫瘤細胞的遷移能力。本研究利用鬼筆環肽標記細胞骨架中的F-肌動蛋白,觀察胃癌細胞中微絲的分布,結果發現,對照組胃癌細胞中微絲豐富,排列緊密,細胞與細胞之間相互聯系,而DZYX醇提物處理組細胞中微絲含量顯著減少,細胞骨架斷裂成團,提示DZYX醇提物可抑制微絲聚合,重塑細胞骨架可影響胃癌細胞的遷移能力。同時轉錄組學中的GO功能注釋及KEGG通路結果顯示,DZYX醇提物能影響胃癌細胞的整合素及層粘連蛋白,且主要富集于焦點粘附通路,提示其可能為DZYX醇提物抑制胃癌細胞轉移的機制。

PI3K/AKT信號通路與細胞遷移密切相關,研究證明該信號通路參與了細胞遷移過程。中藥烏梅丸能夠抑制胰腺癌SW1990細胞遷移,同時降低細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的表達水平,其發揮作用機制可能與PI3K/AKT信號通路的抑制有關[12]。研究[13]表明,槲皮素通過下調PI3K/AKT中AKT的磷酸化表達水平抑制口腔癌Tca-8113細胞的遷移和侵襲。研究[14]發現,海芋乙醇提取物以劑量依賴性方式抑制黑色素瘤細胞(B16-F10、A375、A2058)的增殖、遷移和侵襲,其抗腫瘤作用與下調PTEN/PI3K/AKT信號通路的表達有關。此外,還有研究[15]表明,中藥四逆散能夠通過抑制NF-kappaB和AP-1上游的PI3K/AKT的激活,抑制乙型肝炎X蛋白誘導的人肝癌細胞的遷移和侵襲。因此,我們檢測了PI3K/AKT通路下游中的兩個關鍵性蛋白AKT和m-TOR發現,經DZYX醇提物處理后的胃癌SGC-7901細胞中的兩種蛋白的磷酸化水平顯著降低,提示DZYX醇提物能夠抑制SGC-7901細胞遷移可能與抑制PI3K/AKT信號通路激活有關。

綜上所述,本研究證實DZYX醇提物能夠抑制胃癌細胞株SGC-7901的遷移能力,其機制可能主要與下調MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平相關,同時可能通過整合素-焦點粘附機制抑制SGC-7901的侵襲能力。