液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量

廣東省珠海市斗門區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 孟軒 梁可昌

硝基呋喃類藥物是通過影響細菌體內(nèi)的氧化還原酶體系，干擾細菌正常代謝的一類廣譜抗生素，曾普遍應(yīng)用于水產(chǎn)、畜牧業(yè)養(yǎng)殖等行業(yè)中疾病的預(yù)防和治療。后續(xù)學(xué)者陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該類藥物對對人體具有致畸胎作用，可能誘發(fā)癌癥等重大疾病。為此，2019 年12 月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第250 號公告中將其歸類為食品動物中禁止使用的藥物。

硝基呋喃類常用的有4種：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林。硝基呋喃類藥物進入魚體后的代謝產(chǎn)物分別為：3-氨基-2-惡唑烷基酮（AOZ）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）、氨基脲（SEM），由于這些代謝產(chǎn)物與蛋白質(zhì)結(jié)合而相當穩(wěn)定，所以目前主要通過檢測代謝物的殘留量，反映硝基呋喃類藥物的殘留狀況。

目前檢測獸藥殘留常見的方法主要有：高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、常規(guī)理化檢測法、酶聯(lián)免疫法、毛細管電泳法等。本研究基于《國家標準GB31656.13-2021 食品安全國家標準水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，結(jié)合實驗室設(shè)備及當?shù)貦z測需求，建立了準確、高效、快速的硝基呋喃代謝殘留量檢測方法。

一、材料與方法

1.主要儀器和試劑。

（1）主要儀器。Agilent1290/G6470B 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司）；KQ-500DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；ZZDCH-16 水浴氮吹儀（廣州瑞森生物科技有限公司）；THZ 臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；3-18K 冷凍離心機（SIGMA）；SQP型號電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；IKAVORTEX3s025 渦旋器。

（2）材料與試劑。

①試驗樣品：皖魚（直接采樣于魚塘）。

②試劑：甲醇（色譜純、德國默克）；乙酸乙酯（色譜純、德國默克）；5 摩爾/升乙酸銨（switzerland）；甲酸（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；二甲基亞砜（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；2-硝基苯甲醛（上海麥克林）；無水磷酸氫二鉀（分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（優(yōu)級純，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）；4 種硝基呋喃代謝物標準品（AMOZ、AOZ、AHD.HCL、SEM.HCL）以及4 種硝基呋喃代謝物同位素內(nèi)標：AHD-13C3、AMOZ-D5；SEM.HCL-13C,15N2、、AOZ-D4 均 購 于德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

2.儀器條件。

（1）色譜條件。流動相A 為甲醇，流動相B為5 毫摩爾/升乙酸銨+0.1%甲酸水溶液，色譜柱為InfinityLabPoroshell120EC-C18(3.0×100mm2.7-Micron），柱溫：40℃；流速：0.4 毫升/分鐘；進樣量：5 微升，梯度洗脫程序見表1，后運行平衡1.5 分鐘。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。離子源：AJSESI；正離子模式，MRM 掃描模式；干燥氣溫度325℃，流速6 升/分鐘，鞘氣溫度370℃，流速11 升/分鐘，霧化器壓力為45psi，毛細管電壓為4000 伏。質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表2 動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）質(zhì)譜采集參數(shù)

3.標準系列溶液配制。

（1）分別準確稱取4 種標準品和4 種同位素內(nèi)標適量，甲醇溶解并定容至10 毫升棕色容量瓶中，分別配制成濃度為1.0 毫克/毫升標準儲備液和同位素內(nèi)標標準儲備液，-18℃避光保存。

（2）分別準確量取濃度為1.0 毫克/毫升的4 種標準品儲備液和4 種同位素內(nèi)標儲備液適量，用甲醇逐級稀釋，分別配制成濃度為1.0 微克/毫升的混合標準中間液和同位素混合內(nèi)標標準中間液。

（3）準確量取混合標準中間液，甲醇逐級稀釋，配制成濃度為100 納克/毫升和10 納克/毫升的混合標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。準確量取同位素混合內(nèi)標標準中間液，甲醇逐級稀釋，配制成濃度為100 納克/毫升混合內(nèi)標標準工作液。

工作人員正在檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量

4.樣品前處理。

（1）樣品水解與衍生化處理。準確稱取搗碎后的水產(chǎn)品（皖魚）樣品2 克(精確到0.01 克)于50 毫升聚丙烯離心管中,加入50 微升濃度為100 納克/毫升混合內(nèi)標標準工作液，渦旋混合1 分鐘，加0.2 摩爾/升鹽酸溶液5 毫升、渦旋1 分鐘，加入濃度為0.05摩爾/升的2-硝基苯甲醛溶液0.15 毫升。渦旋震蕩1 分鐘,置于恒溫振蕩器中，60℃避光震蕩2 小時。

（2）樣品提取與凈化。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 摩爾/升磷酸氫二鉀溶液4.0 毫升調(diào)PH 至7.0～7.5，旋渦震蕩1 分鐘，加入乙酸乙酯8 毫升,渦旋振蕩1 分鐘，10000 轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心5 分鐘，取上清液至15 毫升離心管，45℃氮氣吹干，加入5%甲醇溶液1 毫升溶解殘留物，以10000 轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5 分鐘，取上清液過濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

5.標準曲線的制備。稱取6 個空白基質(zhì)樣本，分別加入50、100、200 微升濃度為10 納克/毫升的混合標準工作液以及50、100、200 微升濃度為100納克/毫升的混合標準工作液，配制成濃度為0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 納克/毫升的基質(zhì)標準曲線，再完全按照樣品前處理過程步驟進行操作，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測定。

二、結(jié)果與分析

1.檢測標準曲線的建立。按照上述基質(zhì)標準溶液的濃度進行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。硝基呋喃代謝物AMOZ、AHD、AOZ、SEM 在濃度0.5～20.0 納克/毫升呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

表3 方法線性范圍、標準曲線方程、相關(guān)系數(shù)

2.加標回收率及精密度。在空白魚肉中添加0.5 微克/千克、1.0 微克/千克、5.0 微克/千克三個不同濃度水平的標準物質(zhì)進行回收率試驗，各濃度水平平行測定6 次，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，在0.5,1.0,5.0微克/千克添加水平下，目標分析物的加標回收率 為82.0% ～103%，相對標準偏 差（RSD） 為0.996%～4.46%（n＝6），結(jié)果見表4，其回收率和精密度水平均符合方法標準的規(guī)定。

AOZ 0.5 96 1.33 1.0 102 2.43 5.0 99.2 0.996 0.5 82 4.37 2.5 100 3.72 5.0 102 3.22 SEM

表4 加標回收率及精密度

3.方法檢出限和方法定量限。本方法中AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的檢測限均為0.5 微克/千克，當添加濃度為0.5 微克/千克時，AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的 信 噪 比 分 別 為226.12、187.73、2168.43、42.01，RS/N 均大于3。該方法的定量限均為1.0 微克/千克。當添加濃度為1.0 微克/千克時，AMOZ、AHD、AOZ、SEM 的信噪比分別為2086.16、270.18、2023.20、80.57，RS/N 均大于10，檢出限和定量限均滿足標準相關(guān)要求。

三、結(jié)論

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，具有5-硝基本結(jié)構(gòu)，通過影響細菌體內(nèi)的氧化還原酶體系，干擾細菌正常代謝，本方法參照GB31656.13—2021，建立了檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的方法。本方法以乙酸乙酯為提取劑，酸性條件提升了衍生溫度，縮短衍生時長，在3 個不同添加濃度水平自由度為6 的條件下平均回收率、精密度以及各測定組分在0.5～20.0 納克/毫升范圍內(nèi)線性關(guān)系均滿足檢測要求，在針對日常抽檢樣品的多種魚類進行風險評估檢測篩查時，用該方法同時檢測質(zhì)控樣品，回收率達到分析要求，結(jié)果準確可靠。本方法快速簡便、靈敏度高，適合于水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留檢測。