血管外膜細胞鈣化及其鈣化機制研究

譚小青,張旭升,樊小容,黃戰軍

血管鈣化常見于動脈粥樣硬化、血脂異常、高血壓、糖尿病、慢性腎病及衰老等人群[1],血管鈣化引起血管硬度增加、順應性降低,導致心肌缺血、心力衰竭、血栓形成等,增加腦卒中、心臟病、動脈粥樣硬化斑塊破裂等的風險,被認為是影響心血管疾病的重要因素之一[2-4]。目前關于血管內膜、中膜和心臟瓣膜鈣化的關注和研究相對較多。臨床工作中發現,血管外膜也可發生鈣化,然而調查發現,現階段對血管外膜鈣化的關注較少,因此,需要更多的研究來闡明血管鈣化的致病機制。最初血管鈣化被認為是被動和退行性病變,標志著血管老化,但是越來越多研究表明血管鈣化是類似于胚胎骨形成的病理生物學過程[5-6]。Bostr?m等[7-8]研究發現,鈣化過程中大鼠血管中膜細胞由原有收縮表型轉變成為成骨樣細胞表型,原有的收縮標志物如平滑肌肌動蛋白α(α-SMA)等表達減少,并表達核心結合因子α1(Runx2)、骨形態生成蛋白2(BMP2)等多種成骨樣標志物,從而介導骨基質在血管中沉積。細胞凋亡與自噬為2種細胞死亡的方式,與血管鈣化息息相關,研究表明,血管中膜細胞在細胞凋亡過程中釋放凋亡小體,促進細胞鈣化,而細胞自噬通過多種機制調控細胞鈣化[9-10]。本研究對大鼠血管外膜細胞進行體外誘導鈣化,建立大鼠血管外膜細胞鈣化模型,并檢測鈣化過程中成骨相關指標及凋亡、自噬相關蛋白的表達變化,旨在為心血管疾病模型提供更精確的細胞模型,并初步探討其鈣化機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

胎牛血清(FBS,Gibco),青霉素,鏈霉素(Gibco,美國),茜素紅S溶液,β-甘油磷酸,抗壞血酸,地塞米松(Sigma,美國),抗GAPDH抗體(Bioworld),抗Bcl-2,Bax, Bcelin1和微血管相關蛋白(LC3)抗體(CST), 堿性磷酸酶檢測試劑盒、鈣(Ca)檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所)。

1.2 大鼠血管外膜細胞分離與培養

取10只4～6周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠(體質量120～180 g)胸主動脈分離血管外膜,采用組織黏附法培養。使用添加10%胎牛血清的高糖DMEM培養基(Gibco dmem) 在37 ℃、5%二氧化碳條件下培養細胞。當細胞增殖至80%～90%融合時,用0.25%胰酶消化傳代。使用第3代至第6代的細胞進行后續實驗。

1.3 體外鈣化模型的建立

鈣化誘導培養基為含10%胎牛血清,10 mmol/L β-甘油磷酸鈉,0.05 mmol/L 抗壞血酸和100 mmol/L 地塞米松的高糖DMEM 培養液。將第3代至第6代細胞分為對照組和鈣化組,待細胞長至50%融合時,使用鈣化誘導培養基培養,每3 d更換1次培養基,連續培養15 d。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)酶活測定

細胞鈣化誘導后,棄去培養基, 1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗細胞3次, 加入裂解液 500 μL(1%TritonX-100),冰上裂解 40 min后,離心,取上清液。使用上清液根據試劑盒說明書檢測ALP活性及總蛋白含量。

1.5 細胞內鈣含量檢測

細胞鈣化誘導后,棄去培養基, 1×PBS洗細胞3次,每孔加入500 μL 0.6 mol/L的鹽酸4 ℃脫鈣過夜,取上清,根據鈣測試試劑盒說明書檢測鈣含量。將脫鈣后的細胞用 4 ℃ PBS 洗 3 次,每孔加入 500 μL NaOH/0.1%SDS 裂解細胞,取上清,用二喹啉甲酸法(BCA)測定細胞蛋白含量。

1.6 茜素紅S染色

細胞鈣化誘導15 d,棄去培養基, 1×PBS洗細胞3次,加入0.5 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min, 用雙蒸水洗3次, 加入1 mL 0.1%茜素紅室溫孵育15 min, 吸去染液, 雙蒸水洗3次,在倒置顯微鏡下觀察。

1.7 實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測

細胞鈣化誘導后,棄去培養基, 1×PBS洗細胞3次,使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA,使用PrimeScripTMRT reagent Kit 將所提取的RNA逆轉錄合成 cDNA,以cDNA為模板, 通過SYBR Green I嵌合熒光定量RT-PCR檢測BMP-2、Runx2和GAPDH的表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測

細胞鈣化誘導15 d,棄去培養基,1×PBS洗細胞3次,提取細胞總蛋白。使用12% SDS-PAGE膠電泳分離,并轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,封閉后,加入一抗(Bax 1∶1 000,Bcl-2 1∶1 000,Beclin1 1∶1 000,LC3 1∶1 000,GAPDH 1:1 000)稀釋液,4 ℃孵育過夜;加入二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育1 h后,使用ECL發光試劑盒顯影并計算灰度值。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠血管外膜細胞可在體外被誘導鈣化

為驗證高磷是否能誘導大鼠血管外膜細胞鈣化,使用鈣化誘導培養基培養細胞,在不同時間點檢測ALP活性和胞內鈣含量。隨著培養時間延長,ALP活性逐漸上升,在培養第12天達到峰值,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05);誘導第3天開始所測得的胞內鈣含量與對照組比較升高(P<0.05),ALP活性和鈣含量升高具有時間依賴性。詳見圖1、圖2。誘導15 d所測得鈣含量最高,因此,后續實驗選擇的誘導時間為15 d。對鈣化誘導15 d的細胞進行茜素紅S染色,結果顯示,對照組細胞呈長梭形,而鈣化組細胞變成菱形。茜素紅S染色后,鈣化組可觀察到大量的橘紅色鈣結節(見圖3),而對照組完全沒有。這也證明大鼠血管外膜細胞可在體外被鈣化培養基誘導鈣化。

圖1 鈣化誘導培養基誘導外膜細胞后ALP含量

圖2 鈣化誘導培養基誘導外膜細胞后胞內鈣含量

圖3 培養15 d時細胞經茜素S紅染色切片圖(×100)

2.2 血管外膜細胞鈣化與細胞向成骨樣表型轉化有關

血管鈣化的增加與成骨細胞特異性標志物如BMP2、和Runx2的增加有關[11]。RT-PCR結果顯示,與對照組比較,鈣化組的成骨細胞特異性標志物BMP2和Runx2 mRNA表達量增加,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 外膜細胞鈣化過程中BMP2和Runx2 mRNA表達量

2.3 血管外膜細胞鈣化過程涉及細胞自噬及凋亡調控

通過Western Blot檢測凋亡和自噬相關蛋白的表達量變化。與對照組比較,鈣化組促凋亡蛋白Bax表達上調,抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調(P<0.05)。詳見圖5。鈣化組自噬相關蛋白Beclin1表達上調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例上調(P<0.05),說明鈣化誘導培養后細胞內凋亡水平上調、自噬水平升高。詳見圖6。

圖5 誘導鈣化后促凋亡蛋白及抑凋亡蛋白表達變化

圖6 誘導鈣化后凋亡及自噬蛋白Beclin1等表達變化

3 討 論

血管鈣化作為心血管疾病病人的并發癥之一,其發病率與嚴重程度逐年增高及加重,是導致心血管疾病病人高死亡率的重要因素。血管鈣化缺乏有效的治療藥物。因此,探究血管鈣化發病機制,在分子水平尋找有效的診斷和防治靶點是急需開展的基礎研究工作。本研究證明,使用10 mmol/L β-甘油磷酸+0.05 mmol/L 抗壞血酸+100 mmol/L 地塞米松培養外膜細胞即可誘導大鼠血管外膜細胞在體外發生鈣化,這是通過茜素紅S染色、ALP活性檢測及胞內鈣含量檢測結果得以確定的。

血管鈣化過程中,血管中膜細胞向成骨樣細胞表型轉變并表達相關成骨標志物,從而引起骨基質的沉積,是血管鈣化的重要特點及機制[5]。本實驗所用的血管外膜細胞鈣化條件與血管中膜細胞鈣化條件一致,說明血管外膜細胞鈣化的機制可能與中膜細胞鈣化的機制部分一致。血管中膜細胞鈣化過程中,細胞表達成骨相關的轉錄因子如Runx2等,進而促進下游表達骨相關蛋白如骨形態發生蛋白BMP2等的表達,從而促使細胞向成骨樣細胞主動分化[12-13],本研究也觀察到類似的機制。通過PT-PCR檢測,發現鈣化培養基培養大鼠血管外膜細胞15 d后,BMP2和Runx2的mRNA表達水平升高。本研究通過對鈣鹽沉積與成骨樣細胞表型轉變2個維度的探討,證明血管外膜細胞可在體外被誘導鈣化,豐富了血管鈣化的分型。

血管鈣化的發生機制復雜,涉及多種信號通路,如細胞自噬和凋亡、Wnt/β-catenin信號通路激活、內質網應激等均參與調控血管鈣化的過程。自噬作為一種細胞應激的適應性反應,在維持血管結構與功能中十分關鍵。研究表明,血管鈣化過程中自噬水平增高[14-15]。在體外實驗中,高磷可提高大鼠血管中膜細胞的自噬水平,增加細胞內自噬體數量,從而抑制凋亡與鈣化[16]。還有研究表明,自噬可通過抑制大鼠血管中膜細胞氧化應激,抑制血管內皮細胞的炎癥反應,對三酰甘油等脂代謝進行調控,從而減輕血管鈣化[17-18]。LC3和Beclin1是2種典型的自噬標志物,Western Blot 實驗結果表明,用鈣化培養基誘導大鼠血管外膜細胞15 d, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率升高, Beclin1蛋白水平表達升高,說明細胞內自噬水平升高。

多項研究表明,細胞凋亡參與促進血管鈣化的發生,抑制細胞凋亡和抑制鈣化[16 -17]。在對大鼠的體內研究發現,成纖維細胞生長因子21通過內質網應激調控Caspase-12 信號通路來減少血管內中膜細胞凋亡,從而抑制血管鈣化[18]。另外,提高培養基中的Pi或Ca2+濃度,可誘導細胞質膜形成并釋放基質囊泡(如凋亡小體),從而導致細胞外基質鈣化,這種基質鈣化可能成為血管鈣化的成核位點[19]。Bax和Bcl-2是2種典型的凋亡和抑制凋亡蛋白,本實驗結果證明,利用鈣化培養基對血管外膜細胞誘導鈣化過程中,細胞內凋亡水平升高。同時細胞內自噬水平也升高,這可能是細胞自我調控以對抗鈣化的結果。

本研究證實血管外膜細胞可在體外被誘導鈣化,且外膜鈣化過程與骨組織鈣化過程類似,為主動可調控的過程。血管鈣化是一個復雜的過程,涉及細胞凋亡和自噬等調控通路,仍需進一步研究。