高血壓病人血清中長鏈非編碼RNA MEG3、miR-142-3p表達及與內皮功能的相關性

趙麗華,郭長磊,呂風華

高血壓是全球心血管疾病的主要危險因素之一,近年來,高血壓的患病率有所增加,目前,它已成為一個重大的公共衛生挑戰[1]。高血壓會導致血管內皮功能受損,而內皮功能的破壞與血管舒張、氧化應激、內皮前炎癥和血栓前狀態相關,其嚴重程度與心血管事件相關[2]。因此,了解高血壓引起內皮功能障礙的分子機制尤為迫切。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被定義為長度超過200個核苷酸的非蛋白編碼RNA,近年來受到研究人員的關注。研究報道,許多lncRNA在內皮細胞中高度表達,它們在內皮細胞正常功能中起重要的調節作用,lncRNA的異常表達與高血壓相關的內皮功能障礙密切相關[3]。母系表達基因3(Maternally expressed gene 3,MEG3)編碼一個lncRNA,被報道作為腫瘤抑制因子發揮著重要作用,其過表達能夠抑制細胞增殖并促進細胞凋亡[4]。有研究證實lncRNA MEG3與高血壓的進展有關[5]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是由18～24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA,通過與特定mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)結合,負向調節基因功能,最近的研究報道,微小RNA(miRNA)表達的異常調控與大量臨床上重要的心血管疾病有關[6]。miR-142-3p作為MicroRNA家族成員之一,研究表明,miR-142-3p的表達升高會對血管造成損傷,在機體血管的生理和病理過程中發揮著關鍵的調控作用[7]。到目前為止,還少有研究揭示lncRNA MEG3和miR-142-3p在高血壓誘導的內皮功能障礙中的作用。因此,本研究檢測高血壓病人血清lncRNA MEG3和miR-142-3p的表達水平,以探討兩者與內皮功能的相關性,為尋找高血壓誘導的內皮功能障礙的分子生物標志物提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究方案經我院倫理委員會批準后進行。觀察組研究對象為我院門診部2018年8月—2020年10月收治的符合《中國高血壓防治指南(2010年修訂版)》[8]診斷標準的高血壓病人,共145例,其中男79例,女66例;年齡38～80歲,病程4～15年。根據高血壓分級標準[8]將觀察組病人分為3組,輕度組(1級高血壓)45例、中度組(2級高血壓)60例和重度組(3級高血壓)40例。所有病人臨床資料完善,無先天性心臟病或其他系統性免疫疾病,且近2周未服用過治療藥物;排除繼發性高血壓、心律失常、意識不清的病人。對照組研究對象為同期在我院體檢的健康個體,共145人,其中男72人,女73人,年齡35～75歲。對照組與觀察組研究對象均簽署了知情同意書,且兩組性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 血清采集與保存

觀察組病人(開始治療當天)及對照組健康體檢者(體檢當天)空腹采集5 mL靜脈血,靜置20 min,在4 ℃條件下以1 500 r/min轉速離心20 min,取上層血清分裝到潔凈的收集管中,一部分用于實驗室指標檢測,一部分儲存在-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 血清lncRNA MEG3和miR-142-3p的表達水平檢測

參照試劑盒說明書,使用TRIzol試劑(貨號:10296028,賽默飛世爾科技有限公司)從血清中提取總RNA,并通過分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定RNA質量。檢測合格后每個樣品取1 μL RNA,使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒(貨號:No.04 896866001,大連寶生物Takara有限公司)將總RNA逆轉錄為cDNA,按照試劑盒說明書的步驟進行。實時反轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析,使用ABI 7700 PCR儀器(美國應用生物系統公司)和SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(貨號:QPK-201,北京索萊寶科技有限公司)進行,反應體系和反應條件參照試劑盒說明書進行設定。分別以GAPDH和U6作為內源基因,應用2-ΔΔCt的方法計算lncRNA MEG3和miR-142-3p的RNA相對表達水平,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 血管內皮相關因子檢測

血清一氧化氮(nitric oxide,NO)、血管內皮素(endothelin-1,ET-1)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)表達水平的檢測均采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),ET-1試劑盒(貨號:18016208,武漢華美生物工程有限公司),NO試劑盒(貨號:csB-F13209h,武漢華美生物工程有限公司),vWF試劑盒(貨號:mlE1405,上海酶聯生物科技有限公司),具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組臨床資料比較

不同分級高血壓病人及對照組年齡、性別、吸煙史、體質指數(BMI)比較差異均無統計學意義(P>0.05),而各組收縮壓和舒張壓比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組臨床資料比較

2.2 觀察組和對照組血清lncRNA MEG3、miR-142-3p及血管內皮相關因子的表達水平比較

與對照組比較,觀察組血清lncRNA MEG3和NO的表達水平下降,血清miR-142-3p mRNA、ET-1和vWF的表達水平升高(P<0.05)。詳見表3、表4。

表3 兩組血清lncRNA MEG3、miR-142-3p的mRNA相對表達量(±s)

表4 兩組血管內皮相關因子水平比較(±s)

2.3 不同高血壓分級組血清lncRNA MEG3、miR-142-3p及血管內皮相關因子的表達水平

血清lncRNA MEG3和NO在輕度組、中度組和重度組高血壓病人中的表達水平依次降低,血清miR-142-3p、ET-1和vWF的表達水平則依次增高(P<0.05)。詳見表5、表6。

表5 不同高血壓分級組血清lncRNA MEG3和miR-142-3p的mRNA相對表達量(±s)

表6 不同高血壓分級組血管內皮相關因子水平比較(±s)

2.4 觀察組血清lncRNA MEG3和miR-142-3p表達、血壓與血管內皮相關因子的相關性

Pearson相關性分析結果顯示,觀察組病人的血清lncRNA MEG3表達水平與NO水平呈正相關,與ET-1和vWF水平呈負相關(P<0.05);血清miR-142-3p表達水平與NO水平呈負相關,與ET-1和vWF水平呈正相關(P<0.05);收縮壓和舒張壓與NO水平呈負相關,與ET-1和vWF水平呈正相關(P<0.05)。詳見表7。

表7 觀察組血清lncRNA MEG3和miR-142-3p表達、血壓與血管內皮相關因子的相關性

2.5 觀察組血清lncRNA MEG3與miR-142-3p表達水平的相關性

進一步相關性分析發現,觀察組血清lncRNA MEG3與miR-142-3p表達水平呈負相關(r=-0.607,P<0.05)。詳見圖1。

圖1 觀察組血清lncRNA MEG3與miR-142-3p表達水平的相關性分析

2.6 高血壓多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結果顯示, lncRNA MEG3、NO水平降低及miR-142-3p、ET-1和vWF水平升高均是高血壓的危險因素(P<0.05)。詳見表8。

表8 影響高血壓的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

高血壓是常見的健康問題之一,其發病機制復雜,受多種因素影響。目前,已有多種藥物研發用于控制血壓,然而,由于炎癥、血管疾病等并發癥發生率高,疾病很難根除。有研究報道顯示,高血壓病人通常伴隨內皮功能紊亂,是引起心血管疾病的關鍵原因,血管內皮功能障礙與高血壓的發生發展關系密切[9-10]。故篩選與高血壓和內皮功能相關的關鍵靶點,對于臨床緩解高血壓和預防心血管疾病具有重要意義。

血管內皮對機體穩態至關重要,血壓升高會激活內皮細胞,引起血管活性因子釋放,導致高血壓發生[5]。lncRNA是一種新的RNA分子類型,越來越多的證據表明其異常表達在許多病理過程中起著關鍵作用,包括炎癥和氧化應激反應,lncRNA參與了高血壓相關的內皮功能障礙,如lncRNA GAS5主要通過β-連環蛋白信號調節內皮細胞和血管平滑肌細胞功能,其在高血壓病人中下調,能導致內皮功能失調[11]。MEG3位于人類染色體14q32上,編碼一種lncRNA,近年來,在血管疾病和炎性疾病的進展中的作用受到關注。田艷娟等[12]發現IncRNA MEG3在2型糖尿病伴幽門螺桿菌(Hp)感染病人血清中表達水平降低,可能通過調節機體內脂肪酸水平、炎性因子表達及氧化應激水平參與2型糖尿病合并Hp感染的發生與發展。lncRNA MEG3通過調控VSMCs參與血管重構,調控內皮細胞功能,Wang等[4]研究表明lncRNA MEG3參與了高糖誘導的內皮功能障礙,在高血糖的內皮細胞模型中下調,敲低lncRNA MEG3可能會加劇內皮細胞的炎癥損傷。本研究中發現,lncRNA MEG3在高血壓病人血清中的表達水平降低,并且隨著病情的加重而逐漸降低,說明lncRNA MEG3在高血壓的發展中起到重要作用。

除lncRNA以外,大量研究證實miRNA在調節高血壓內皮細胞功能和/或功能障礙中起到至關重要的作用[13]。高血壓病人發生血管內皮功能障礙可能與治療前病人血清中miR-297a、miR-143的表達水平降低有關[14];之前有報道miR-142-3p在免疫相關炎性疾病中發揮調控作用[15];Sha等[7]研究發現,miR-142-3p在高糖誘導下表達上調,通過抑制SPRED2介導的自噬促進糖尿病的發生,包括誘導細胞凋亡、加重細胞氧化應激和炎性因子的分泌。本研究結果顯示,相對于對照組而言,高血壓病人血清miR-142-3p的表達水平升高,并且隨著病情的加重而逐漸升高,說明miR-142-3p的表達升高與高血壓的發展緊密相關。

另有研究表明,血管內皮指標可在一定程度上反映疾病嚴重程度[16]。臨床上常使用NO、ET-1和vWF的水平來評價內皮細胞功能,NO和ET-1是血管內皮細胞中的重要活性物質,在調節血壓方面起作用,當發生內皮功能障礙時,體內NO的水平下降,ET-1水平升高;vWF是一種在內皮細胞受損中分泌較多的多聚糖蛋白,是評價機體內皮受損的重要特異性標志物。本研究檢測高血壓病人和對照組血清NO、ET-1和vWF水平,結果顯示,高血壓病人血清中NO水平降低,ET-1和vWF水平升高,并且3項指標的水平均與高血壓的分級有關,收縮壓和舒張壓分別與NO水平呈負相關,與ET-1和vWF水平呈正相關,高血壓病人的內皮細胞功能受到損傷,高血壓與內皮功能受損的程度有關。為了進一步了解lncRNA MEG3和miR-142-3p與內皮功能的關系,采用Pearson法分析了兩者表達水平分別與NO、ET-1和vWF水平的相關性,結果顯示,lncRNA MEG3表達水平與NO水平正相關,與ET-1和vWF水平呈負相關,而miR-142-3p表達水平與NO水平呈負相關,與ET-1和vWF水平呈正相關,表明lncRNA MEG3和miR-142-3p在高血壓相關內皮功能障礙病理調節中具有作用。多因素Logistic回歸分析結果也表明lncRNA MEG3、NO、miR-142-3p、ET-1和vWF均是高血壓的獨立影響因素。此外,lncRNAs和miRNAs之間的相互作用已被證明在不同的生物過程中發揮著重要作用,本研究中發現lncRNA MEG3與miR-142-3p的表達水平表現為呈負相關,提示lncRNA MEG3可能通過負向調控miR-142-3p參與調節高血壓相關的內皮功能障礙。

綜上所述,高血壓病人血清中lncRNA MEG3表達水平降低,miR-142-3p表達水平升高,可能在高血壓的進展中具有調節作用,其表達水平能夠反映高血壓病人內皮功能受損的程度,可能是高血壓相關的內皮功能障礙的新型治療靶點和分子生物標志物。