血清lncRNA TGFB2-AS1水平與冠狀動脈鈣化及其嚴重程度的關系

回振宇,張文娟,李 陽

冠狀動脈鈣化(coronary artery calcification,CAC)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的一種病理現象,其可降低血管壁的順應性、彈性,可引發心血管事件[1-2]。CAC不僅與糖尿病、年齡等相關,還與長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)異常表達、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型轉化等有關[3-4]。研究發現,轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是TGF-β家族的一員,其在血管鈣化中水平較高,TGF-β1可能參與并影響血管鈣化過程[5];而lncRNA TGFB2-反義RNA 1(lncRNA TGFB2-antisense RNA 1, lncRNA TGFB2-AS1)可負性調節TGF-β信號傳導[6]。但lncRNA TGFB2-AS1在CAC中的表達水平及其與CAC嚴重程度的關系尚不明確?；诖?本研究探討lncRNA TGFB2-AS1在CAC病人中的表達情況,分析lncRNA TGFB2-AS1與CAC嚴重程度的關系,以期為診斷CAC并評估CAC病人病情程度提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月—2021年7月于丹東市第一醫院行CT、冠狀動脈造影檢查的病人185例為研究對象,男115例,女70例;年齡40～72(57.14±12.78)歲。納入標準:1)受試者對本研究知情同意;2)臨床檢查資料齊全;3)受試者行CT、冠狀動脈造影檢查。排除標準:1)既往接受過冠狀動脈旁路移植術者;2)合并甲狀腺功能亢進、急慢性感染者;3)合并結締組織病、骨代謝疾病及肝、腎功能不全者;4)合并心律失常、腫瘤者;5)合并貧血性疾病或嚴重血液病者;6)伴有嚴重心力衰竭,左室射血分數(LVEF)<35%者。本研究獲得了本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

收集病人入院24 h內、健康者體檢當日4～5 mL外周血,靜置28～31 min,分離血清(4 500 r/min離心6 min),分裝,置于-70 ℃冰箱待用。

1.2.2 反轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)法檢測血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平

解凍適量血清,以TRIzol LS Reagent(美國Invitrogen公司,10296010)抽提總RNA;之后,以First Strand cDNA Synthesis Kit(上?？道噬锟萍加邢薰?KL411A)制備cDNA;最終,以QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit(德國Qiagen公司,208152)配制擴增體系,并以qRT-PCR儀(美國ABI公司,StepOne TM)擴增cDNA,獲取循環閾值CT。qRT-PCR儀參數:97.2 ℃ 7 min;95 ℃ 30 s,64 ℃ 25 s,62.5 ℃ 15 s,40個循環。lncRNA TGFB2-AS1引物序列:正向5′-AGGGAGTGTGGAAATGAGG-3′,反向5′-GGGTTTGGGAGTACATTCAAC-3′;GAPDH引物序列:正向5′- ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG -3′,反向5′- GCTCCTGGAAGATGGTGATGGG -3′。血清lncRNA TGFB2-AS1相對表達量以2-△△CT法計算。

1.2.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清TGF-β1水平

采用人TGF-β1ELISA試劑盒(武漢益普生物科技有限公司,YX-E10113)配制TGF-β1的標準品溶液,解凍血清樣本,酶標儀(瑞士Tecan公司,Infinite 200 Pro)測定TGF-β1血清樣本、標準品溶液在波長450 nm處的吸光度,繪制TGF-β1回歸曲線,依據TGF-β1標準回歸方程,計算血清TGF-β1水平。

1.2.4 CAC積分

利用CT機(美國通用電氣公司,GE Lightspeed)進行冠狀動脈CT檢查掃描。掃描參數:螺距為0.516∶1,轉速為0.35 s/r,電流為400～500 mA,層厚為0.65 mm,電壓為120 kV。掃描范圍:從氣管隆突處到心臟膈面向下2 cm處。由2位專業醫師對右冠狀動脈、左前降支、左主干、左回旋支及其分支進行鈣化程度評估。以Agaston積分方法計算鈣化積分[7-8],鈣化積分=鈣化面積×鈣化灶最大CT值(要求:鈣化面積>1 mm2,CT值>130 Hu),且若鈣化灶最大CT值為130～199 Hu、>199～299 Hu、>299～399 Hu、>399 Hu則分別定義為1分、2分、3分、4分。

按病人是否發生CAC分為非CAC組(47例)與CAC組(138例),收集兩組高血壓、體質指數(body mass index, BMI)、總膽固醇(total cholesterin, TC)、糖尿病、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、冠心病、三酰甘油(triacylglycerol, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、吸煙、空腹血糖等資料。依據鈣化積分將CAC組病人分為輕度CAC組(鈣化積分<100分,47例)、中度CAC組(100分≤鈣化積分<400分,48例)、重度CAC組(鈣化積分≥400分,43例)。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 CAC組、非CAC組臨床資料比較

與非CAC組比較,CAC組病人高血壓、LDL-C水平、糖尿病、冠心病差異均有統計學意義(P<0.05),性別、TC、吸煙、BMI、TG、年齡、HDL-C、空腹血糖比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 CAC組、非CAC組臨床資料比較

2.2 兩組血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平比較

與非CAC組比較,CAC組血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平降低(P<0.05),TGF-β1水平升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平比較(±s)

2.3 不同CAC嚴重程度病人血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平比較

與輕度CAC組比較,中度、重度CAC組病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平降低(P<0.05),TGF-β1水平升高(P<0.05);與中度CAC組比較,重度CAC組病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平降低(P<0.05),TGF-β1水平升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同CAC嚴重程度病人血清lncRNA TGFB2-AS1、mRNA及TGF-β1水平比較(±s)

2.4 CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平與TGF-β1的相關性

Pearson法分析顯示,CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平與TGF-β1呈負相關(r=-0.589,P<0.001)。詳見圖1。

圖1 CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1水平與TGF-β1的相關性

2.5 血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平對CAC的診斷價值

ROC曲線分析顯示,血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平診斷CAC的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.905[95%CI(0.844,0.966)],截斷值為0.78,約登指數為0.707,其敏感度為83.0%,特異度為87.7%。詳見圖2。

圖2 血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平診斷CAC的ROC曲線

3 討 論

CAC是鈣鹽在冠狀動脈壁上沉積的一種病理變化,是動脈粥樣硬化的重要特征,與心血管事件發生率相關[9]。此外,卿平等[7]研究顯示,高血壓、糖尿病等是CAC發生的危險因素。本研究顯示CAC組病人高血壓、LDL-C、糖尿病、冠心病高于非CAC組,與卿平等[7]研究結果部分一致,表明了解病人基礎病并監控LDL-C水平有利于臨床及時防治CAC。因此,積極尋找與CAC發生相關的機制,對防治CAC、降低心血管事件發生率甚為重要。

TGF-β1是一種細胞因子,其可調節VSMC增殖、遷移,影響細胞外基質降解、合成,參與免疫炎癥反應,與動脈粥樣硬化、高血壓、CAC等關系密切[10-11]。研究發現,TGF-β1不僅可促使VSMC向成骨樣細胞分化,還可促進VSMC鈣化[12]。另外,TGF-β1在慢性腎臟病中呈高水平,而血管舒縮素可通過抑制TGF-β1表達進而抑制VSMC鈣化,TGF-β1可能是治療慢性腎臟病病人血管鈣化的潛在靶標[13]。本研究中CAC組病人血清TGF-β1水平較高,與Zhao等[5]研究結果相似,且CAC越嚴重,病人血清TGF-β1水平越高,提示TGF-β1可能與CAC進程密切相關,TGF-β1具有評估CAC嚴重程度的潛在價值,推測高水平TGF-β1可能通過影響VSMC增殖、遷移及其向成骨細胞轉型,進而影響CAC病變過程。

lncRNA是一類可調節信號傳導、影響VSMC表型轉換的非編碼RNA分子,與冠心病、CAC、腦梗死等有關[14-15]。lncRNA TGFB2-AS1是lncRNA家族的一員,其在肺腺癌中表達失調,可能是治療肺腺癌的潛在靶標[16];另外,Liu等[17]研究發現,lncRNA TGFB2-AS1可通過調控肝癌細胞增殖、凋亡,進而影響肝細胞癌發生發展,其為治療肝細胞癌提供新思路。Papoutsoglou等[6]認為lncRNA TGFB2-AS1與TGF-β有關信號傳導過程有關,而lncRNA TGFB2-AS1與CAC的關系尚不清楚,故本研究探討了lncRNA TGFB2-AS1與CAC的相關性,結果顯示,lncRNA TGFB2-AS1在CAC病人血清中呈低表達,且血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平隨CAC嚴重程度加重而降低,提示lncRNA TGFB2-AS1可能與CAC病變進程有關,lncRNA TGFB2-AS1有望成為評估CAC嚴重程度的標志物。分析可能原因,lncRNA TGFB2-AS1作為lncRNA家族的成員,其可能通過調控VSMC表型轉換、影響相關信號轉導過程,進而影響CAC的病理過程。多層螺旋CT是診斷血管鈣化的重要手段,但其價格昂貴,臨床應用受限。故本研究分析了血清lncRNA TGFB2-AS1診斷CAC的價值,結果顯示,血清lncRNA TGFB2-AS1診斷CAC的AUC為0.905,當lncRNA TGFB2-AS1相對表達量<0.78時,CAC發生概率較高,提示lncRNA TGFB2-AS1對CAC有一定診斷價值,測定血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平有助于臨床診斷CAC,lncRNA TGFB2-AS1有望成為診斷CAC的輔助指標。

本研究分析CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平與TGF-β1的相關性,結果顯示,血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平與TGF-β1呈負相關,提示lncRNA TGFB2-AS1可能與TGF-β1共同參與CAC的發生發展過程,推測lncRNA TGFB2-AS1通過調節TGF-β1相關信號通路,進而影響CAC過程,其機制有待深入探究。

CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達水平較低,與TGF-β1呈負相關,且血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平與CAC嚴重程度相關,lncRNA TGFB2-AS1可作為臨床診斷CAC并評估其嚴重程度的參考指標。但由于本項研究經費和時間限制,未深入探討lncRNA TGFB2-AS1在CAC中的機制,且樣本較少,有待后續擴大樣本量進行深入探究。