老年阿爾茨海默病患者血清中TNF-α、M-CSF及miR-181a的表達(dá)水平及臨床應(yīng)用價(jià)值

付 丹,梁洪波,孫東鵬,李 斌

(1.江蘇省徐州市東方人民醫(yī)院老年精神科,江蘇 徐州 221000;2.江蘇省徐州市東方人民醫(yī)院心理科,江蘇 徐州 221000;3.江蘇省徐州市東方人民醫(yī)院精神科,江蘇 徐州 221000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,不僅影響患者身體健康及生活質(zhì)量,還給患者及家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為其發(fā)生與基因(如淀粉樣前體蛋白基因突變等)和環(huán)境因素(如生活習(xí)慣、慢性病等)有關(guān)[2]。深入研究影響AD發(fā)生的因素,尋找早期診斷AD的血清生物標(biāo)志物,對(duì)AD的早期診治具有重要意義。研究表明,AD的發(fā)生發(fā)展過程中涉及多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)等的大量分泌[3]。TNF-α、M-CSF作為具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子,參與炎癥和免疫應(yīng)答的調(diào)控,但過度分泌時(shí)會(huì)導(dǎo)致炎癥平衡失調(diào),造成神經(jīng)元組織的損傷,參與AD的發(fā)生發(fā)展[4-5]。微小RNA(microRNA, miR)是長度為20～24 nt的調(diào)控因子,研究表明,miR-181a通過海馬及杏仁核α-氨基羥甲基惡唑丙酸受體調(diào)控突觸可塑性,促進(jìn)β淀粉樣蛋白(Amyloid-beta peptide,Aβ)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),影響AD的發(fā)生發(fā)展過程,可作為AD早期診斷的分子標(biāo)志物[6-7]。本研究觀察AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達(dá),探討三者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取自2017年1月—2019年1月期間我院診治的140例AD患者為研究對(duì)象(AD組),男性55例,女性85例;年齡58～80歲,平均(70.15±7.27)歲;病程l～8年,平均病程(5.36±1.52)年。并根據(jù)臨床癡呆量表評(píng)分[8],將AD組分為輕度組(1分)52例,中度組(2分)49例,重度組(3分)39例。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①結(jié)合患者臨床癥狀,體格檢查及腦CT等檢查,采用美國精神病學(xué)、語言障礙和卒中-老年癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)明確AD診斷;②臨床資料完整;③患者家屬對(duì)本研究知情同意并簽字。排除標(biāo)準(zhǔn):①血管性癡呆;②伴有抑郁,精神分裂癥等精神障礙;③近3個(gè)月有急性炎癥性疾病,代謝性疾病病史。以同期健康查體的50例健康者為對(duì)照組,男性25例,女性25例;年齡59～79歲,平均(68.58±6.25)歲。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審核批準(zhǔn)通過。

1.2方法

1.2.1采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測 血清miR-181a相對(duì)表達(dá)量留取AD組入院后即刻藥物治療前,對(duì)照組健康體檢時(shí)清晨空腹靜脈血5 mL,4 ℃、5 000 r/min離心5 min,取上層血清-80 ℃保存。應(yīng)用Trizol試劑提取血清總RNA,應(yīng)用Nanodrop 2 000c分光光度計(jì) (美國,賽默飛公司)檢測RNA濃度,OD260/OD280比值介于1.8～2.0。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。miR-181a及內(nèi)參U6引物序列由華大公司設(shè)計(jì)合成,miR-181a上游序列為5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTC-3′,下游序列為5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAA-TTC-3′;U6上游序列為5′-CTCGCTTCGGCAG-CACATA-3′,下游序列為5′-AACGATTCA-CGAATTTGCGT-3′。總體系:MasterMIX 5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板cDNA 1 μL,雙蒸水補(bǔ)足至3 μL。條件:95 ℃ 2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火 30 s,70 ℃延伸30 s,變性退火延伸共35個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算miR-181a的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2血清TNF-α、M-CSF水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測血清TNF-α、M-CSF水平,試劑盒購自上海江萊生物公司,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。簡要步驟:微量反應(yīng)板每孔加入標(biāo)本50 μL。每孔加酶結(jié)合物50 μL,充分混勻,封板,37 ℃恒溫箱中孵育30 min。洗滌液100 μL注滿各孔洗滌5次。每孔加顯色劑A液、B液各50 μL,充分混勻,封板,置37 ℃恒溫箱孵育15 min。加終止液50 μL,充分混勻。用酶標(biāo)儀讀數(shù),取波長450 nm,讀取各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的OD值,對(duì)應(yīng)計(jì)算每孔樣品的濃度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料2組間比較采用t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)分析AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達(dá)的相關(guān)性。受試者工作曲線(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達(dá)對(duì)AD的診斷價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AD組和對(duì)照組一般資料比較 AD組和對(duì)照組之間在性別、年齡、文化程度、人際活動(dòng)、高血壓史、冠心病史、糖尿病史、腦卒中史、吸煙史、飲酒史、TC、TG、HDL-C和LDL-C之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 AD組和對(duì)照組一般資料比較

2.2各組血清TNF-α、M-CSF及miR-181a水平比較 AD組血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(t=49.291、30.485、28.313,均P<0.05)。對(duì)照組、輕、中、重度組間血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=846.924、600.930、449.211,均P<0.05)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、M-CSF及miR-181a水平比較

2.3AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,AD患者血清TNF-α與M-CSF、miR-181a表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.524、0.610,均P<0.05),M-CSF與miR-181a表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.498,P<0.05)。

2.4影響AD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 對(duì)影響AD的單因素進(jìn)行多因素非條件 Logistic 回歸分析,將血清TNF-α、M-CSF及miR-181a引入回歸方程,結(jié)果提示血清TNF-α>27.18 ng/L、血清M-CSF>635.81 ng/L及血清miR-181a>1.83為影響AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 影響AD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

2.5血清TNF-α、M-CSF及miR-181a對(duì)AD的診斷價(jià)值 血清TNF-α、M-CSF及miR-181a的曲線下面積分別為0.741(95%CI:0.684～0.789)、0.693(95%CI:0.630～0.757)、0.727(95%CI:0.682～0.774)及0.862(95%CI:0.818～0.899),聯(lián)合檢測診斷AD的曲線下面積大于TNF-α、M-CSF及miR-181a單獨(dú)診斷(Z=3.357、5.894、4.911,均P<0.05)。見表4,圖1。

表4 血清TNF-α、M-CSF及miR-181a及聯(lián)合檢測對(duì)AD的診斷效能

圖1 ROC曲線分析血清TNF-α、M-CSF及miR-181a及聯(lián)合檢測對(duì)AD的診斷效能

3 討 論

AD是一種漸進(jìn)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、日常生活能力下降和行為改變,是造成老年癡呆的最主要原因[9]。AD的確切病因及機(jī)制尚不清楚,藥物治療只能延緩認(rèn)知障礙的進(jìn)程。因此,AD的早期診斷十分重要。目前對(duì)AD 的診斷主要依賴于臨床癥狀、體格檢查以及心理精神量表等,但對(duì)早期或非典型病例的診斷往往會(huì)存在偏倚[10]。近年來,通過影像學(xué)檢查以及腦脊液檢測也獲得一些有價(jià)值的生物標(biāo)志物,但由于價(jià)格昂貴、有創(chuàng)以及部分有輻射等原因,而限制其在臨床的應(yīng)用[11]。因此,探尋一種簡便易得且能準(zhǔn)確反映AD病理進(jìn)程的外周血清標(biāo)志物成為目前研究的熱點(diǎn)。

淀粉樣前體蛋白等基因的突變導(dǎo)致β前體樣蛋白主要經(jīng)β、γ分泌酶裂解為Aβ,Aβ大量聚集形成神經(jīng)毒性的原纖維,促進(jìn)AD的病情發(fā)展。Aβ沉積會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng),同時(shí)伴有如TNF-α、白細(xì)胞介素1及M-CSF等細(xì)胞因子的釋放,加重炎性反應(yīng),促進(jìn)AD患者神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[12]。炎性因子TNF-α、M-CSF在AD發(fā)生過程中發(fā)揮神經(jīng)元毒性作用[13]。本研究中,AD 組血清TNF-α、M-CSF水平均高于對(duì)照組,并且TNF-α、M-CSF的表達(dá)與AD患者病情程度有關(guān),是影響AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素,提示血清TNF-α、M-CSF表達(dá)升高可能通過激活體內(nèi)炎性反應(yīng),促進(jìn)AD疾病的發(fā)生及發(fā)展。分析其原因,一方面是AD發(fā)生時(shí)淀粉樣蛋白的神經(jīng)纖維纏結(jié)激活小膠質(zhì)細(xì)胞并激活補(bǔ)體產(chǎn)生TNF-α、M-CSF等炎癥因子,促進(jìn)炎癥反應(yīng)的同時(shí),通過其神經(jīng)毒性促使神經(jīng)元發(fā)生凋亡[14]。另一方面,淀粉樣蛋白Aβ的沉積與氧自由基的產(chǎn)生密切相關(guān),Aβ可誘發(fā)氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)超氧陰離子、羥自由基等活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生,促進(jìn)活性氧自由基產(chǎn)生,產(chǎn)生氧化損傷,進(jìn)而激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α、M-CSF等細(xì)胞因子,而TNF-α、M-CSF等能夠損傷神經(jīng)元,加重神經(jīng)元炎癥損傷,導(dǎo)致AD患者疾病程度加重[15]。此外,M-CSF是一個(gè)重要的促進(jìn)增殖的造血生長因子,其可通過刺激骨髓來源的CD34+造血干細(xì)胞分化和激活,促進(jìn)微環(huán)境中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的擴(kuò)增,分泌促炎性細(xì)胞因子,抑制腦組織中Aβ的清除,促進(jìn)AD的疾病進(jìn)展[5]。因此,血清TNF-α、M-CSF水平越高,反映AD患者神經(jīng)元炎癥性損傷更為嚴(yán)重,可能是評(píng)估AD疾病嚴(yán)重程度的血清標(biāo)志物。

miRNA是短的非編碼RNA,參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,與腫瘤、中風(fēng)、糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年來發(fā)現(xiàn),AD患者血清微小RNA存在異常表達(dá)的現(xiàn)象,可作為新的AD診斷的血清標(biāo)志物[11]。miR-181a是嚙齒類動(dòng)物海馬中豐富的微小RNA,可以調(diào)節(jié)多種與突觸可塑性相關(guān)蛋白,如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1、沉默信息調(diào)節(jié)因子1等的表達(dá),影響學(xué)習(xí)和記憶功能[16]。本研究中,AD組血清miR-181a明顯較高,與AD疾病嚴(yán)重程度有關(guān),是影響AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素,提示miR-181a參與AD的疾病發(fā)生發(fā)展過程。既往研究表明,miR-181a在AD小鼠模型中的海馬組織中以病理依賴的方式顯著增加,并與可塑性相關(guān)蛋白水平降低相關(guān)[17]。miR-181a在調(diào)節(jié)活動(dòng)依賴的突觸可塑性和記憶形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其表達(dá)升高可能導(dǎo)致功能突觸的加速喪失和認(rèn)知功能衰退。筆者分析,血清miR-181水平升高能夠通過促進(jìn)tau蛋白的過量表達(dá)和異常過度磷酸化,導(dǎo)致AD疾病嚴(yán)重程度加重。研究發(fā)現(xiàn),在AD小鼠模型中miR-181a能夠促進(jìn)了海馬中可溶性和突觸體富集的tau蛋白的形成,突觸中tau蛋白的積累能夠誘導(dǎo)NMDA受體N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基2B亞基的磷酸化,引起神經(jīng)元的興奮性毒性損傷,導(dǎo)致AD疾病的發(fā)生發(fā)展[18]。尚有研究表明,miR-181a可以負(fù)向控制蛋白激酶AMP激活的催化亞基α1的表達(dá),降低腺苷酸活化蛋白激酶的活性,抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素信號(hào)通路,促進(jìn)神經(jīng)退行性小鼠模型大腦中tau蛋白的總量和磷酸化水平,導(dǎo)致AD的進(jìn)展[19]。因此,miR-181a在控制突觸可塑性中的潛在機(jī)制使其成為潛在的AD的標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),AD患者血清miR-181a與TNF-α、M-CSF表達(dá)呈顯著正相關(guān),筆者分析其原因,可能是miR-181a的表達(dá)升高促進(jìn)tau的異常磷酸化激活,造成神經(jīng)元興奮性毒性損害,激活局部微環(huán)境中免疫細(xì)胞,造成繼發(fā)性的炎癥反應(yīng),促進(jìn)TNF-α、M-CSF的分泌[20]。此外,TNF-α作為重要的細(xì)胞因子,亦能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)miR-181a的表達(dá)。研究表明,TNF-α能夠通過激活細(xì)胞表面的胰島素受體,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)miR-181a及miR-23a-3p的表達(dá),參與胰島素抵抗的形成[21]。但AD中三者的具體作用機(jī)制仍有待深入研究。通過對(duì)血清中TNF-α、M-CSF、miR-181a及聯(lián)合檢測的敏感度、特異度和曲線下面積進(jìn)行分析,血清TNF-α、M-CSF、miR-181a聯(lián)合檢測的敏感度、特異度及曲線下面積較高,提示,聯(lián)合三者檢測可以作為早期診斷AD的重要指標(biāo),不僅為AD的早期診斷提供了更有意義的生物標(biāo)志物,也為其早期診斷依據(jù)提供了新的思路。

綜上所述,AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達(dá)升高,與疾病嚴(yán)重程度有關(guān),三者聯(lián)合檢測對(duì)AD具有較高的診斷價(jià)值。血清TNF-α>27.18 ng/L、血清M-CSF>635.81 ng/L及血清miR-181a>1.83為影響AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。但本研究樣本量較小, TNF-α、M-CSF及miR-181a在AD發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。