圍產(chǎn)期氟攝入對子代小鼠肝功能的影響

張佳慧 陳詩琪 丁 斕 周 平 翟曉虎 賀衛(wèi)華＊

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇泰州 225300；2.上海睿金寵物診所 上海 201508）

氟是一種非金屬鹵素， 是人類生命活動(dòng)必需的微量元素之一， 廣泛存在于自然環(huán)境中。 長期攝入高劑量的氟化物會(huì)導(dǎo)致氟中毒， 該病是一種慢性中毒性疾病。 氟中毒不僅會(huì)侵害機(jī)體的牙齒、骨骼，導(dǎo)致氟斑牙、氟骨癥等，而且還會(huì)對非骨相器官組織，如肝臟、脾臟、腎臟、胃腸道、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、甲狀腺等造成廣泛性損傷[1-4]。 氟中毒會(huì)引起肝臟發(fā)生退行性病變，光鏡下可見索狀肝細(xì)胞、疏松的細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)；電鏡下可見肝細(xì)胞變形、細(xì)胞核膜褶皺、固縮，核仁邊集等，引起局部區(qū)域肝細(xì)胞變性、壞死等[5]；當(dāng)肝臟細(xì)胞受損時(shí)， 肝臟轉(zhuǎn)氨酶如天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的含量會(huì)隨著受損程度的加深而不斷升高。

本研究通過給圍產(chǎn)期小鼠飲用添加了氟化鈉的蒸餾水建立氟中毒動(dòng)物模型， 使用HE 染色觀察子代小鼠肝臟細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)通過ELISA 法檢測血清中AST 和ALT，旨在為研究圍產(chǎn)期氟攝入對子代小鼠肝臟損傷的影響提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ALT (南京建成生物工程研究所)；AST(南京建成生物工程研究所)；0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液；30% H2O2溶液；粘附載玻片；氟化鈉；蒸餾水；乙醇；二甲苯等常規(guī)實(shí)驗(yàn)室藥品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 懷孕昆明小鼠48 只， 由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均為普通級(jí)動(dòng)物。小鼠飼料為標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 將48 只懷孕昆明小鼠隨機(jī)分為四組飼養(yǎng)，即：對照組（A 組）、低氟組（B 組）、中氟組（C 組）、高氟組（D 組）。 對照組（A 組）供給蒸餾水，低氟組（B 組）供給含25 mg/L 氟化鈉的蒸餾水，中氟組（C 組）供給含50 mg/L 氟化鈉的蒸餾水，高氟組（D 組）供給含100 mg/L 氟化鈉的蒸餾水。 直到母鼠分娩21 d 后， 每組隨機(jī)選取雄仔鼠6 只，斷頸處死采血， 采集的血液室溫靜置2 h 后3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜谵D(zhuǎn)氨酶測定；摘取肝臟，以4 %多聚甲醛固定，4 ℃保存。

1.3.2 肝臟組織石蠟切片制作 肝臟組織在4%多聚甲醛中固定約24 h 后，取出組織進(jìn)行修塊，并轉(zhuǎn)移到75%酒精中過夜，置于梯度酒精中脫水，并用二甲苯透明，在石蠟中完成浸蠟與包埋。 之后，在切片機(jī)上將組織切成5 μm 薄片，在37 ℃攤片機(jī)中攤片，60 ℃烤片。

1.3.3 HE 染色 將制備好的石蠟切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木精染細(xì)胞核3 min、鹽酸乙醇分化30 s、伊紅倒進(jìn)倒出，用中性樹脂封固。干燥后，在生物顯微鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化。1.3.4 ALT 和AST 的測定 斷頸處死小鼠， 采血、分離血清， 根據(jù)ALT 和AST 試劑盒的操作流程，利用全波長多功能酶標(biāo)儀檢測血清中ALT 和AST 的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Graph pad Prism6.0 進(jìn)行方差分析。測定數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；* 表示差異顯著（P<0.05），** 表示差異極顯著（P<0.01）。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟組織切片觀察 由圖1 可知， 對照組（A）小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)緊密， 肝小葉緊湊有秩； 低氟組（B）局部區(qū)域肝細(xì)胞壞死，肝竇有充血腫脹且空腔變大，胞漿結(jié)構(gòu)疏松；中氟組（C）和高氟組（D）肝細(xì)胞局部壞死、細(xì)胞核溶解，肝竇葉間靜脈淤血，細(xì)胞排列紊亂。

2.2 血清ALT 和AST 測定結(jié)果 由表1 可知，血清ALT 和AST 測定結(jié)果顯示，中氟組和高氟組小鼠血清中ALT 和AST 的含量均分別極顯著高于對照組（P<0.01），表明肝細(xì)胞的功能受到了嚴(yán)重?fù)p害。

表1 ALT、AST 含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，與對照組相比，中氟組和高氟組肝細(xì)胞局部壞死、細(xì)胞核溶解，肝竇葉間靜脈淤血，細(xì)胞排列紊亂；血清中AST、ALT 含量均極顯著升高（P<0.01）。 因此，圍產(chǎn)期氟攝入可造成子代小鼠肝臟組織發(fā)生退行性病變和肝臟受損。

3 討 論

肝臟是動(dòng)物機(jī)體重要的解毒場所， 是體內(nèi)最大的消化腺，具有解毒、代謝、分泌膽汁、免疫防御等多種功能[6]。 在氟中毒大鼠肝細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，氟化物的毒性可導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[7]。 氟中毒導(dǎo)致小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)病變和肝功能受損的研究報(bào)道很多， 但是圍產(chǎn)期氟攝入對子代小鼠肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能有無影響、影響有多大鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)觀察到中氟組和高氟組仔鼠肝臟的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理變化，甚至出現(xiàn)肝細(xì)胞局部壞死、細(xì)胞核溶解等病變。同時(shí)ALT 和AST 含量極顯著高于對照組，肝臟功能受損嚴(yán)重，且隨著試驗(yàn)組氟含量的不斷升高，肝臟損傷加重。試驗(yàn)表明，圍產(chǎn)期攝入的氟可以通過胎盤屏障到達(dá)胎兒體內(nèi)，對胎兒的肝臟造成不良影響，同時(shí)也為研究人氟攝入對子代健康成長的影響提供一定的理論依據(jù)。