三肽基肽酶1 和環狀RNA Tau-微管蛋白激酶2 在食管癌組織中的表達及與患者預后的關系

薛金良，靳超，張曉

鄭州大學附屬洛陽中心醫院胸外科，洛陽市心胸外科疾病臨床研究中心，河南 洛陽 471009

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤，近年來發病率日益增高。據統計，全球每年食管癌病死例數約30 萬例，中國約15 萬例，約占全球的50%[1]。盡管近年來影像技術、外科手術、放化療等技術快速發展，但多數患者就診時仍已處于食管癌晚期，因此，早期診斷、及時治療是提高食管癌患者預后的關鍵。相關研究表明，食管癌的發生與相關蛋白的表達密切相關[2]。端粒保護蛋白三肽基肽酶1（tripeptidyl peptidase 1，TPP1）高表達與多種腫瘤細胞的發生、發展、轉移密切相關[3]。近年來，相關報道顯示，基因轉錄會形成非編碼環狀RNA（circular RNA，circRNA）Tau-微管蛋白激酶2（Tau-tubulin kinase 2，TTBK2），其是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，并誘導細胞凋亡、產生細胞毒性，可作為腫瘤生物學標志[4]。因此，本研究探討TPP1、circ-TTBK2 在食管癌中的表達及與患者預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年6 月至2017 年6 月鄭州大學附屬洛陽中心醫院收治的食管癌患者。納入標準：①年齡49～75 歲；②術前未接受化療、放療等輔助治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并心、肝、腎嚴重疾病；②合并嚴重神經功能、認知功能障礙；③依從性差；④合并其他惡性腫瘤。依據納入和排除標準，本研究共納入100 例食管癌患者，其中男59 例，女41 例；年齡49～75 歲，平均（59.31±6.65）歲；病理類型：鱗狀細胞癌67 例，其他33 例；分化程度：高分化21 例，中分化37 例，低分化42 例。取100 例食管癌患者的食管癌組織及癌旁正常組織。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測TPP1 蛋白的表達情況

選取100 例食管癌患者的食管癌組織及癌旁正常組織，生理鹽水清洗后保存在10%甲醛溶液中，-80 ℃恒溫箱保存待檢。石蠟切片標本厚2 μm，烘烤60 ℃，二甲苯脫蠟，抗原修復，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次。滴加內源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，沖洗。滴加一抗（稀釋濃度1∶100），室溫孵育1 h，沖洗。滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G 聚合物，室溫孵育30 min，采用PBS 代替一抗；滴加山羊抗兔二抗室溫孵育30 min。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，樹膠封片[5]。結果判定：采用雙盲法評估TPP1 蛋白的表達情況[6]。隨機選取5 個視野，依據染色強度進行評分：無著色計0 分，淺黃色染色計1 分，棕黃色染色計2 分，棕褐色染色計3分；依據陽性細胞所占比例進行評分：陽性細胞所占比例﹤25%計1分，陽性細胞所占比例為25%～50%計2分，陽性細胞所占比例﹥50%計3分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，﹤4分判定為陰性，≥4分判定為陽性。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測circ-TTBK2 的相對表達量

選取100 例腫瘤組織及癌旁正常組織，生理鹽水沖洗后保存于-70 ℃冰箱中待檢。采用Trizol 總RNA 提取試劑盒提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉錄，得到互補DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA 為模板用RT-PCR 試劑盒進行PCR 反應。PCR 反應條件：90 ℃60 s，92 ℃30 s，56 ℃30 s，74 ℃30 s，38 個循環。circ-TTBK2 上游引物：5'-AATAGTACTTGGGTCCTCCTCT-3'，下游引物：5'-CTGCCAACTGTCGCATGTTC-3'；以β-actin為內參，上游引物：5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'。每個標品均設3 個平行反應復孔，參照每孔Ct 值進行分析[7]。計算circ-TTBK2 的相對表達量。

1.4 隨訪

對所有患者進行為期3 年的隨訪，隨訪時間截至2020 年6 月，記錄患者的預后情況。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對所有數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；食管癌患者預后的影響因素采用Cox 風險比例回歸模型分析；以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TPP1、circ-TTBK2 表達情況的比較

食管癌組織中TPP1 的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，circ-TTBK2 的相對表達量明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1、圖1）

圖1 食管癌組織中TPP1蛋白的表達情況（免疫組化染色，×400）

表1 食管癌組織和癌旁正常組織中TPP1、circ-TTBK2表達情況的比較

2.2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中TPP1、circ-TTBK2 表達情況的比較

不同性別、年齡、病理類型食管癌患者食管癌組織中TPP1 蛋白表達情況和circ-TTBK2 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。分化程度為低中分化、有淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、浸潤深度為T3～4食管癌患者食管癌組織中TPP1 蛋白陽性表達率分別高于分化程度為高分化、無淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、浸潤深度為T1～2的患者，差異均有統計學意義（χ2=28.168、4.345、7.994、6.156，P﹤0.05）。分化程度為低中分化、有淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、浸潤深度為T3～4食管癌患者食管癌組織中circ-TTBK2 的相對表達量分別高于分化程度為高分化、無淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、浸潤深度為T1～2的患者，差異均有統計學意義（t=6.060、11.721、15.728、11.240，P﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中TPP1、circ-TTBK2表達情況（n=100）

2.3 食管癌患者預后影響因素的單因素分析

隨訪3 年，100 例食管癌患者生存68 例，死亡32 例，病死率為32.00%。年齡、性別、病理類型均可能與食管癌患者的預后無關（P﹥0.05）；分化程度、TNM 分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況、circ-TTBK2 表達情況、TPP1 表達情況均可能與食管癌患者的預后有關（P﹤0.05）。（表3）

表3 食管癌患者預后影響因素的單因素分析

2.4 食管癌患者預后影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統計學意義的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況、circ-TTBK2表達情況、TPP1 表達情況作為自變量，食管癌患者的預后作為因變量納入多因素Cox 風險比例回歸模型分析，結果顯示，浸潤深度為T3～4、分化程度為低中分化、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移、circ-TTBK2高表達、TPP1蛋白陽性表達均為食管癌患者預后的獨立危險因素（P﹤0.05）。（表4）

表4 食管癌患者預后影響因素的Cox 風險比例回歸模型分析

3 討論

有研究顯示，腫瘤的發生發展與端粒、端粒酶密切相關[8]。TPP1 表面的TEL patch 與端粒酶結合，可調節端粒酶的募集及活性，進而控制端粒的長度和穩定性，且端粒的改變與乳腺癌、肝癌、神經膠質瘤等多種腫瘤的發生密切相關。既往在宮頸癌細胞中加入端粒酶抑制劑——BIBR1532，可抑制TPP1 上的TEL patch 與端粒酶結合，從而抑制宮頸癌Hela 細胞的生長，并促進其凋亡[9]。Zhang 和Dong[10]對慢性B 淋巴細胞白血病的端粒變化情況進行研究發現，僅TPP1 及復制蛋白AⅠ（replication protein AⅠ，RPAⅠ）的表達明顯上調，其他蛋白水平均有降低。Wallace 等[11]采用基因芯片技術檢測結腸癌中基因表達情況發現，與正常結腸組織相比，結腸癌組織中TPP1 的表達明顯上調，提示TPP1 蛋白陽性表達對結腸癌患者的用藥選擇有指導意義。

circ-TTBK2 是一種激酶，是神經細胞骨架的主要成分，其通過催化微管中含量最高的Tau 蛋白使微管處于不穩定狀態，激活微管磷酸化，通過調節miRNA-217 等通路調控膠質瘤的惡性程度[12]。相關研究發現，circ-TTBK2 在多種惡性腫瘤中過表達，能促進腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲[13]。

本研究結果顯示，食管癌組織中TPP1的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，circ-TTBK2 的相對表達量明顯高于癌旁正常組織，且隨著食管癌臨床分期增高、組織分化程度的降低及淋巴結轉移情況，TPP1 和circ-TTBK2 的表達也逐漸上調，這與徐勇軍等[14]研究食管癌組織中circ-TTBK2 表達情況一致，說明其與食管癌的發生發展密切相關。同時，為明確影響食管癌患者預后的危險因素，本研究對食管癌患者進行為期3年的隨訪發現，100例患者病死率高達32%。相關研究發現，TPP1表達升高與食管癌患者3 年總生存率降低密切相關[15]。而Zhang等[16]的研究也表示，circ-TTBK2 可作為判斷食管癌患者惡性程度與預后的生物學標志物。本研究Cox風險比例回歸模型分析結果顯示，浸潤深度為T3～4、分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移、circ-TTBK2 高表達、TPP1 蛋白陽性表達均為食管癌患者預后的獨立危險因素（P﹤0.05）。表明TPP1 和circ-TTBK2 均與食管癌患者的預后關系密切，進一步提示TPP1 和circ-TTBK2 可通過參與腫瘤細胞的分化、浸潤和轉移影響食管癌患者的臨床結局，但關于其以何種方式來調節食管癌的進展仍未明確，后續仍將繼續深入研究。

綜上所述，TPP1 在食管癌中陽性表達，circ-TTBK2 在食管癌中高表達，且與食管癌患者的臨床特征密切相關，circ-TTBK2 高表達、TPP1 蛋白陽性表達均為食管癌患者預后的獨立危險因素。