琥珀酸曲格列汀對糖尿病模型小鼠膽汁酸代謝的影響*

朵德龍,桓芝蘭,趙妮,常亞娥,王亞峰

(青海省人民醫院藥學部,西寧 810000)

關鍵字 琥珀酸曲格列汀;磷酸西格列汀;膽汁酸;2型糖尿病

膽汁酸(bile acids,BAs)是膽固醇分解代謝的主要下游產物,在肝臟以膽固醇為原料合成,其合成有兩條途徑:一條是經典途徑,由7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)催化;另一條是替代途徑,由27α-羥化酶(CYP27A1)和12α-羥化酶(CYP8B1)催化,其中90%以上的膽汁酸通過經典途徑合成[1]。CYP7A1作為膽汁酸合成的關鍵限速酶,其表達調控對于維持機體膽汁酸的穩態發揮重要作用[2]。膽汁酸一方面作為乳化劑促進小腸中脂類等物質的吸收及轉運,同時也作為重要的信號分子與法呢醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)結合啟動下游信號通路。FXR已被大量研究證實參與糖脂代謝、膽汁酸代謝、炎癥及纖維化等病理過程[3-5]。研究表明,FXR可被膽汁酸激活,并通過小異二聚體伴侶(small heterodimer partner,SHP)的轉錄調控CYP7A1的表達[6]。另外,文獻報道FXR/SHP信號通路在糖脂代謝中發揮重要作用,可調控微小RNA-802(microRNA-802,miR-802)的表達進而改善胰島素抵抗[7]。琥珀酸曲格列汀是一種長效二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)抑制劑,每周口服一次,用于2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的治療[8]。磷酸西格列汀是比琥珀酸曲格列汀上市早的DPP-4抑制劑,在臨床應用比較成熟,效果確切,SCOTT等[9]報道口服磷酸西格列汀對肥胖、老年和腎臟受損等T2DM患者血糖控制療效顯著,大多數不良事件為輕度至中度,兩藥是否引起T2DM膽汁酸代謝的改變筆者未見報道。本次研究采用UHPLC-MS/MS膽汁酸高通量靶標定量檢測技術測定小鼠回腸內容物中的69種膽汁酸的含量,探討琥珀酸曲格列汀對T2DM膽汁酸代謝的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 db/db 雄性小鼠18只,為基因敲除的T2DM模型,體質量25～30 g;C57小鼠6只,體質量18～22 g,無特定病原體(SPF)級,均購自常州卡文斯實驗動物有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(蘇)2016-0010,實驗動物合格證:202010621。各小鼠均分籠飼養,相對濕度40%～50%,飼養溫度20～24 ℃,自由進食、進水。動物實驗符合倫理學標準,并得到倫理委員會的批準。

1.2藥品與試劑 琥珀酸曲格列汀(中國MCE,批號:1029877-94-8);磷酸西格列汀(中國MCE,批號:654671-77-9);Prime Script RT reagent Kit(寶日醫生物技術有限公司,批號:RR047A);BCA蛋白濃度測定試劑盒(beyotime,批號:G2002-100ML);預染蛋白Marker(abclonal,批號:RM19001);CYP7A1抗體(abclonal,批號:A10615);FXR抗體(abclonal,批號:A8320);SHP抗體(abclonal,批號:A1836);生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(affinity,批號:s0001)。

1.3儀器與設備 實時熒光定量儀(Thermo Fisher Scientific公司,型號:QuantStudioTM3);熱循環儀(美國ThermoFisher儀器有限公司,型號:TCA0096);電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司,型號:JY200C);全功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific 公司,型號:MK3);超高效液相儀(Thermo Fisher Scientific公司,型號:Vanquish);高分辨質譜儀(Thermo Fisher Scientific公司,型號:Heraeus Fresco17)。

1.4動物分組與給藥 將18只db/db小鼠按照隨機數字表法分為模型對照組、琥珀酸曲格列汀組、磷酸西格列汀組,每組6只,C57小鼠6只為對照組。根據《藥理實驗方法學》中人與小鼠的等效劑量換算[10],琥珀酸曲格列汀組給藥劑量為17.29 mg·kg-1,每周1次;磷酸西格列汀組給藥劑量為16.71 mg·kg-1·d-1,連續給藥8周。處死小鼠,取肝臟、胰腺、腎臟和回腸,稱質量后-80 ℃保存,保存的組織應避免反復凍融。

1.5蘇木精-伊紅(HE)染色評估組織病理 參照文獻[11-12]方法,用無菌水沖洗組織1～2 h,甲醛固定胰腺和腎臟,用乙醇溶液梯度脫水,孵育。用石蠟包埋組織,切片后,HE色,觀察具體病變,并根據SCHMIDT等[13-14]建立方法對小鼠胰腺和腎臟組織病理學評分。

1.6實時聚合酶鏈反應(real-time PCR)測定CYP7A1、FXR和SHP的mRNA水平 參照文獻[15]方法,以β-actin為內參,根據總RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA。逆轉錄反應后置于PCR儀上進行擴增,按照PCR擴增試劑盒進行操作,測定CT值,采用2-△△CT法計算mRNA表達水平。所用引物見表1。

表1 所用引物及堿基序列

1.7Western blotting測定CYP7A1、FXR和SHP的蛋白水平 參照文獻[16]方法。使用RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。每組樣品各取蛋白質50 μL,經電泳分離后轉到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。將PVDF膜與一抗孵育:CYP7A1 1：2 000;FXR 1：2 000;SHP 1：2 000;β-actin 1：50 000,隨后與生物素化山羊抗兔IgG(H+L)二抗孵育。孵育后,用ECL發光液孵育印跡,曝光掃描,結果以目的蛋白相對表達量表示。

1.8超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法聯合膽汁酸高通量靶標定量檢測小鼠回腸內各種膽汁酸的含量 稱取回腸樣本25 mg,加入提取液(甲醇：乙腈：水=2：2：1)1 000 μL,渦旋混勻30 s。然后,加入鋼珠,40 Hz研磨處理4 min,超聲5 min,重復以上步驟3次,隨后-40 ℃靜置1 h。最后,將樣品在4 ℃,13 778×g離心15 min,取上清液進樣,用于UPLC-MS/MS分析。色譜相條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相A相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液(pH值= 8),B相為乙腈。柱溫為45 ℃,樣品盤設為4 ℃,進樣體積為1 μL。質譜條件:以平行反應監測(parallel reaction monitoring,PRM)模式進行質譜分析。離子源參數:霧化壓=+3 500/-3 200 V,鞘氣(N2)流速 40 L·min-1,輔助氣(N2)流速=15 L·min-1,掃氣(N2)流速=0,輔助氣(N2)溫度350 ℃,進樣毛細管溫度320 ℃。

2 結果

2.1病理狀態 模型對照組胰島輕微萎縮,胰島細胞變性壞死,細胞核固縮;琥珀酸曲格列汀組則出現少量胰島細胞萎縮和變性壞死,其他未見明顯病理變化;磷酸西格列汀組也出現少量胰島萎縮和變性壞死,其他未見明顯病理變化。模型對照組腎小球內基質增生,腎小管變性壞死,胞質溶解,部分細胞胞核固縮或裂解;琥珀酸曲格列汀組磷酸西格列汀組出現腎小球基底膜增厚和腎小管上皮細胞變性壞死。根據胰腺和腎臟組織病理評分,琥珀酸曲格列汀組胰島萎縮及其細胞變性壞死和腎小球基底膜增厚以及腎小管上皮細胞變性壞死評分低于模型對照組。上述結果提示琥珀酸曲格列汀可減輕T2DM的胰腺和腎臟組織病理狀態。見圖1。

Con:對照組;Mod:模型對照組;Tre:琥珀酸曲格列汀組;Sit:磷酸西格列汀組。①與對照組比較,t=3.279～6.000,P<0.05。

2.2對肝臟CYP7A1、FXR和SHP表達的影響 結果見圖2。與模型對照組比較,琥珀酸曲格列汀組和磷酸西格列汀組CYP7A1 mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義;琥珀酸曲格列汀組FXR mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),而磷酸西格列汀組對FXR mRNA和蛋白表達水平變化不顯著;琥珀酸曲格列汀組對SHP mRNA和蛋白表達水平有升高趨勢,但差異無統計學意義,磷酸西格列汀組SHP mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義。

Con:對照組;Mod:模型對照組;Tre:琥珀酸曲格列汀組;Sit:磷酸西格列汀組。①與模型對照組比較,t=-3.838,-8.102,P<0.05;②與對照組比較,t=2.322～18.424,P<0.05。

2.3琥珀酸曲格列汀對膽汁酸代謝組學的影響

2.3.1數據采集和預處理 所有質譜檢測數據由Orbitrap Exploris 120進行采集,峰識別、鑒定、降噪以及歸一化處理后,從中提取代謝物69個。為更好地分析數據,對原始數據進行一系列的準備和整理,對單個代謝物進行過濾,只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的代謝物數據。對原始數據中的缺失值進行模擬數值,經過預處理后48個代謝物被保留。

2.3.2主成分分析 使用SIMCA軟件(V16.0.2),對數據進行對數(LOG)轉換加UV格式化處理,然后進行自動建模分析,主成分分析(principal component analysis,PCA)得分圖中橫坐標PC1和縱坐標PC2分別表示排名第一和第二的主成分的得分,每個散點代表一個樣本,散點的顏色和形狀表示不同的分組,樣本基本處于95%置信區間。采用PCA主成分分析法對回腸樣本各組的分布趨勢進行預測,見圖3。由圖3可見,與對照組比較,模型對照組較明顯,表明小鼠回腸中膽汁酸代謝發生改變。琥珀酸曲格列汀組有60%小鼠回腸樣本可與模型對照組分離,磷酸西格列汀組有80%的小鼠回腸樣本可與模型對照組分離,表明琥珀酸曲格列汀和磷酸西格列汀可逆轉小鼠回腸膽汁酸代謝的改變。

Con:對照組;Mod:模型對照組;Tre:琥珀酸曲格列汀組;Sit:磷酸西格列汀組。

2.3.3篩選對照組與模型對照組有差異的膽汁酸 圖4A顯示,對照組和模型對照組小鼠回腸樣本在有監督的正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)得分圖中分離明顯;圖4B顯示,對回腸樣本的OPLS-DA得分圖模型進行200次置換檢驗,得到對照組和模型對照組的R2Y和Q2的回歸線,其與縱軸的截距分別為0.35,-1.17,

Con:對照組;Mod:模型對照組。

說明原模型具有良好的穩健性,不存在過擬合現象。利用OPLS-DA分析方法過濾掉不相關的雜亂數據,采用OPLS-DA模型得到的VIP值(variable importance in the projection)大于1的膽汁酸,結合統計分析(P<0.05)以及變化趨勢共預測12種差異膽汁酸,見表2。

表2 模型對照組和對照組之間的差異膽汁酸

2.3.4琥珀酸曲格列汀對差異膽汁酸的影響 將對照組、模型對照組、琥珀酸曲格列汀組和磷酸西格列汀組小鼠回腸的48種膽汁酸和12種差異膽汁酸進行可視化熱圖分析,見圖5。與對照組比較,模型對照組小鼠回腸中有8種膽汁酸水平顯著上調,包括去甲膽酸(nor cholic acid,NCA)、豬脫氧膽酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)、α-鼠膽酸(α-muricholic acid,αMCA)、牛磺熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)、牛磺豬去氧膽酸(taurohyodeoxycholic acid,THDCA)、牛磺鵝去氧膽酸(taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、牛磺脫氧膽酸(taurodeoxycholic acid,TDCA)、牛磺α-鼠膽酸(tauro α-muricholic acid,TαMCA);有4種膽汁酸下調,包括脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)、7-酮基去氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid,7-ketoLCA)、甘氨脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid,GDCA)、膽酸-3-硫酸(cholic acid-3-sulfate,CA-3S)。與模型對照組比較,琥珀酸曲格列汀組和磷酸西格列汀組可回調部分差異膽汁酸。通過觀察給藥后膽汁酸的回調個數和回調程度,可直觀反映琥珀酸曲格列汀和磷酸西格列汀對2型糖尿病小鼠回腸膽汁酸的作用,結果見圖6。與模型對照組比較,琥珀酸曲格列汀組可顯著下調4種膽汁酸,包括NCA、HDCA、THDCA和αMCA,可顯著上調TCDCA;與模型對照組比較,磷酸西格列汀組能顯著下調6種膽汁酸,包括NCA、HDCA、THDCA、αMCA、TDCA和TαMCA。

Con:對照組;Mod:模型對照組;Tre:琥珀酸曲格列汀組;Sit:磷酸西格列汀組。

Con:對照組;Mod:模型對照組;Tre:琥珀酸曲格列汀組;Sit:磷酸西格列汀組。①與對照組比較,t=-9.963～-2.127,P<0.05;②與模型對照組比較,t=2.431～4.712,P<0.05。

3 討論

BAs除從肝臟合成外,還可從末端回腸重吸收,正常情況下從肝臟合成的BAs僅占膽汁酸池的5%,約95%的BAs需從膽汁釋放入回腸末端經肝臟門靜脈重吸收,以滿足自身需求和保持BAs的穩定[17]。FXR是一種細胞內信號蛋白,在肝臟、腸、腎上腺和腎臟等組織高表達,對維持BAs穩態至關重要,在體內外實驗表明,BAs可通過作用于FXR途徑來影響宿主的生理機能[18-20]。

琥珀酸曲格列汀通過抑制腸道中分泌的DPP-4,從而減少胰高血糖素樣肽-1的失活,促進胰腺分泌糖依賴性胰島素而治療T2DM[8]。CHEN等[21]證實四妙丸可改變T2DM的膽汁酸譜而激活FXR。在本次研究中發現主要有 12 種可能與 T2DM 相關的膽汁酸發生變化,琥珀酸曲格列汀可顯著回調部分差異膽汁酸且增加FXR和SHP表達,提示琥珀酸曲格列汀通過抑制DPP-4的同時可能通過調控膽汁酸代謝協同發揮降糖作用。此外,本實驗結果顯示db/db小鼠胰島有不同程度的萎縮、變性和壞死,這與孔曉妮等[22]研究一致,并發現琥珀酸曲格列汀可改善胰腺組織病理狀態。

有研究表明,NCA可通過負調控肝細胞中的FXR/SHP信號通路,TαMCA是天然的FXR拮抗劑,它們均可降低FXR和SHP的表達[23-24]。也有研究證實HDCA、CDCA、DCA、CA、LCA及其與甘氨酸和牛磺酸的偶聯物是FXR內源性激動劑[25-27]。本研究發現琥珀酸曲格列汀可顯著下調NCA和 αMCA,顯著上調TCDCA,這可能是FXR和SHP表達升高的原因,而磷酸西格列汀顯著下調 NCA、αMCA 和TαMCA,同時又下調了 HDCA、THDCA 和 TDCA,所以未能增加 FXR 和 SHP 的表達。研究證實高血糖可誘導系膜細胞分泌MCP-1,繼而引起TNF-α、MCP-1、IL-6等炎癥因子表達增加,激活NF-κB信號通路,它的激活可進一步誘導MCP-1、ICAM-1等炎癥分子的高表達,促進糖尿病腎病的進展[28-31]。ZHANG等[32]研究證實FXR激動劑WAY-362450在非酒精性脂肪肝模型中可顯著減少TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達。WANG等[33]證實FXR激動劑INT-747治療可減少蛋白尿、腎小球硬化和腎小管間質纖維化并可改善腎臟組織病理狀態。研究表明琥珀酸曲格列可改善IL-1β誘導的氧化應激和促炎因子TNF-α、IL-6的產生,并能降低NF-κBp65的表達水平[34-35]。糖化血紅蛋白作為血糖控制的金標準和評估并發癥發生風險的指標,根據先前的研究,琥珀酸曲格列汀可降低血清中糖化血紅蛋白的濃度,且可改善腎臟組織病理狀態,提示琥珀酸曲格列汀可能通過激活FXR對糖尿病腎病產生保護作用,后續將在糖尿病腎病模型中深入探討琥珀酸曲格列汀對糖尿病腎病的保護作用。

本研究應用靶向膽汁酸代謝組學的方法和思路,發現琥珀酸曲格列汀可調控T2DM的膽汁酸代謝,但未研究琥珀酸曲格列汀不同劑量以及其對健康小鼠膽汁酸代謝的影響,將在后續的研究中進一步探討。另外,膽汁酸代謝涉及的生理機制和疾病領域廣泛而復雜,本次研究僅涉及FXR、SHP、CYP7A1的表達以及69種膽汁酸含量變化,有待更深入、更全面的研究。