新疆伊犁昭蘇不同動物源糞腸球菌耐藥性及耐藥基因檢測

徐琦琦， 陳月月， 李宏博， 陳萬昭， 秦蕾， 王東， 夏利寧*

（1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052； 2.霍城縣職業技術學校，新疆 伊犁 835200）

糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為革蘭氏陽性球菌，是腸球菌屬的一種，廣泛分布于各種環境介質中，如空氣、土壤、水源等，同時也是人和動物胃腸道內正常菌群之一[1]。過去，人們認為腸球菌危害不大，某些腸球菌甚至可以作為益生菌來使用。但近年來不斷有調查表明，腸球菌已經成為醫院感染的重要病原體，且高毒力的腸球菌往往來自糞腸球菌[2]。糞腸球菌感染可引起牛子宮蓄膿[3]、綿羊腦炎[4]、肉雞內臟病變[5]等。李鵬[6]研究表明，糞腸球菌的耐藥水平可以作為在具體環境下所釋放該抗菌藥物耐藥性選擇壓力的參考，可將糞腸球菌用作當地細菌耐藥性的指示菌，并以此研究為基礎來反映當地其他種菌株的耐藥現狀。前人研究多以集約化養殖場樣本為主，很少針對散養動物樣本進行深入探討。因此，本研究通過采集新疆伊犁昭蘇地區散養戶不同動物源樣品，對從中分離的糞腸球菌進行耐藥性和相關耐藥基因的檢測，了解該地區不同動物源糞腸球菌的耐藥現狀及耐藥基因攜帶情況，為當地畜牧養殖的合理用藥提供科學依據，同時填補當地糞腸球菌的耐藥數據庫，及時掌握當地流行的耐藥基因類型，為防控耐藥性及耐藥基因的擴散提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

于2020 年11 月從新疆伊犁昭蘇縣各散養戶分別采集牛、羊的鼻拭子（200 份、210 份）和肛拭子（200 份、210 份）及雞的泄殖腔拭子（300 份）樣品共1 120份，從中分離試驗用糞腸球菌。

1.2 試劑

肉湯（mueller-hinton borth，MH）培養基、腦心浸液（brain-heart infusion broth，BHI）培養基、腸球菌購自青島海博生物技術有限公司；科瑪嘉顯色培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司（原產地法國科瑪嘉）；1×TE 緩沖液、50×TAE 購自上海生工生物有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL 2000 DNA Maker 購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定 用滅菌棉簽分別從牛、羊的鼻腔、直腸和雞的泄殖腔內捻轉采集內容物樣品后放入裝有滅菌肉湯的采樣管中。在實驗室無菌間吸取含有樣品的滅菌肉湯放入裝有高鹽BHI 的圓底離心管中，42 ℃ 180 r·min-1培養18～24 h 后，在腸球菌選擇性培養基上劃線，37 ℃倒置培養18～24 h，挑取平板表面光滑、突起、周圍有黑色沉淀的白色或半透明單一菌落，置于裝有BHI 的圓底離心管中，42 ℃過夜培養后在科瑪嘉顯色培養基上劃線，37 ℃倒置培養16～20 h 后挑取藍綠色單菌落于裝有BHI 的圓底離心管中，42 ℃過夜培養，完成對腸球菌的初次篩選。參照劉洋[7]方法合成糞腸球菌持家基因引物，進行PCR 擴增，將檢出有目的條帶的菌液送至上海生工生物有限公司進行測序。通過BLAST 進行序列比對，同源性＞96.0%的菌株判定為糞腸球菌。

1.3.2 保菌 在裝有1 mL 菌液的EP 管中加入0.5 mL 60.0%（體積分數）滅菌甘油，使之成為20.0%（體積分數）的甘油菌，保存至-20 ℃冰箱。

1.3.3 藥物敏感性試驗 按照美國臨床和實驗室標準協會（Clincal and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法[8]執行標準對糞腸球菌進行8 大類10 種抗菌藥物的藥敏試驗，所選抗菌藥物分別為四環素類（四環素、多西環素）、氟喹諾酮類（環丙沙星、左氧氟沙星）、噁唑烷酮類（利奈唑胺）、糖肽類（萬古霉素）、β-內酰胺類（氨芐西林）、酰胺醇類（氟苯尼考）、氨基糖苷類（慶大霉素）、大環內酯類（紅霉素）。糞腸球菌ATCC29212 作為標準質控菌株，藥敏試驗結果以敏感（sensitivity，S）、中介（intermediary，I）、耐藥（resistance，R）表示。

1.3.4 耐藥基因檢測 根據選擇的抗菌藥物選擇相對應的耐藥基因進行檢測。包括抗大環內酯類藥物基因ermA、ermB、ermC；抗噁唑烷酮類藥物基因cfr、optrA、poxtA；抗酰胺醇類藥物基因fexA；抗四環素類藥物基因tet(M)；抗氟喹諾酮類藥物基因emeA；抗氨基糖苷類藥物基因aph(3’)-Ⅲ。參考文獻[9-17]合成上述基因的引物序列并進行PCR 擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結果經BLAST比對后確定。

1.3.5 數據分析 使用SPSS22.0 軟件進行數據分析，單因素分析采用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗。

2 結果與分析

2.1 糞腸球菌分離鑒定結果

采集不同動物源各部位樣品共1 120 份，經糞腸球菌持家基因鑒定得到263 株糞腸球菌，分離率為23.5%。雞源糞腸球菌、羊鼻糞腸球菌、羊肛糞腸球菌、牛鼻糞腸球菌和牛肛糞腸球菌的分離率分別為21.3%、19.0%、28.6%、21.0%和28.5%（表1）。

表1 不同動物源糞腸球菌的分離結果Table 1 Isolation results of Enterococcus faecalis from different animal sources

2.2 糞腸球菌藥敏結果

對不同動物源糞腸球菌的耐藥性進行分析，結果（表2）表明，羊源糞腸球菌對紅霉素、四環素、氟苯尼考、多西環素的耐藥率分別為78.0%、83.0%、83.0%、84.0%，均高于75.0%，顯著高于雞源、牛源糞腸球菌；雞源糞腸球菌對紅霉素、四環素和多西環素的耐藥率分別為36.0%、48.4%和50.0%，顯著高于牛源糞腸球菌。在羊源糞腸球菌中，羊鼻拭子糞腸球菌對利奈唑胺的耐藥率為42.5%，顯著高于羊肛拭子、雞源、牛鼻拭子和牛肛拭子糞腸球菌。5 種來源糞腸球菌對慶大霉素的耐藥率均較低。羊源糞腸球菌對環丙沙星表現為完全敏感；雞源和牛源糞腸球菌對環丙沙星耐藥情況表現為差異不顯著。左氧氟沙星耐藥菌株僅在雞源糞腸球菌中檢出。所有糞腸球菌分離株均對氨芐西林和萬古霉素表現為完全敏感。

表2 不同動物源糞腸球菌的耐藥率Table 2 Resistance of E. faecalis from different animal sources

2.3 糞腸球菌的多藥耐藥結果

表3 為伊犁昭蘇不同動物源糞腸球菌多藥耐藥結果。263 株糞腸球菌中4 耐占比最高，為26.2%。64 株雞源糞腸球菌中，0 耐占比最高，為45.3%；5 耐次之，為18.8%。100 株羊源糞腸球菌中，4 耐占比最高，為64.0%；99 株牛源糞腸球菌中，僅檢測到對1～3 種藥具有耐受性，其中1 耐占比最高，為24.2%。

表3 不同動物源糞腸球菌的耐藥率Table 3 multidrug resistance of Enterococcus faecalis from different animal sources（%）

2.4 糞腸球菌中耐藥基因的檢測

263株糞腸球菌中除cfr、ermC和poxtA基因未檢出外，其他7種耐藥基因均有檢出（表4）。外排泵基因emeA在不同來源糞腸球菌中均有檢出，檢出率高于80.0%。在羊源糞腸球菌中，ermB、fexA、optrA、tet(M)和aph(3’)-Ⅲ基因的檢出率分別為73.0%、75.0%、75.0%、81.0%和77.0%，顯著高于雞源和牛源糞腸球菌。ermA基因僅在雞源和羊源糞腸球菌中檢出，且羊源糞腸球菌檢出率顯著高于雞源糞腸球菌。

表4 伊犁昭蘇不同動物源糞腸球菌耐藥基因檢測結果Table 4 Detection results of drug resistance genes of Enterococcus faecalis from different animal sources in Zhaosu， Yili

3 討論

本研究在不同種類動物的鼻腔、肛門和泄殖腔中分離鑒定出的糞腸球菌對被檢抗菌藥物表現不同程度的耐藥，其耐藥程度由高到低依次為羊源、雞源和牛源；羊源、牛源的鼻拭子與肛拭子糞腸球菌之間的耐藥性無明顯差異。羊源的鼻拭子、肛拭子對紅霉素、四環素、多西環素和氟苯尼考的耐藥率均在70.0%以上，高于阿迪萊·卡哈曼[18]的研究結果。本研究所采集的樣本均來自散養戶，與規模化養殖不同，散養動物有食物天然（放牧）以及抗菌藥物使用量少等優勢，但在這種情況下依然出現耐藥率高的現象，應引起注意。結合羊源鼻拭子也有檢出耐藥糞腸球菌的情況，可能是在放牧過程中所接觸的土壤、水及空氣中存在耐藥基因；也可能養殖人員攜帶耐藥菌，或養殖環境中有野生動物攜帶，比如野鼠等。這一現象警示我們，平時常說的“純天然綠色食品”的家養動物可能也無法逃離耐藥菌的侵襲。此外，值得注意的是，羊源鼻、肛拭子糞腸球菌中均檢出利奈唑胺耐藥菌，且鼻拭子糞腸球菌的耐藥率高達42.5%，遠高于王舒豐等[19]的結果。利奈唑胺被認為是治療耐萬古霉素腸球菌的最后關卡，應嚴格規范該藥物的使用，盡可能延長耐萬古霉素腸球菌出現的時間。不同動物源糞腸球菌對慶大霉素的耐藥率較低，且均為低水平耐藥，但也應提高警惕，盡量延長糞腸球菌對慶大霉素產生高水平耐藥的時間，因為它可能會打破氨基糖苷類和β-內酰胺類以及糖肽類抗菌藥物的協同殺菌作用[20]。牛源糞腸球菌的耐藥率普遍較低，這可能是由于每個散養戶養殖牛的數量較少，且飼養過程中沒有用過抗菌藥物。雞源糞腸球菌對四環素類藥物的耐藥情況最差，其次是紅霉素，但本研究結果均低于蔣逸凡等[21]的研究結果。通過對畜主走訪調研了解，雞在飼養過程中并未大量使用抗生素，食物來源也是自產的小麥及玉米，這可能是其耐藥率低于規模化養殖場的原因。但這樣的結果也不容樂觀，再一次證明“純天然”家養動物也可能將其攜帶的耐藥菌株通過飼喂、屠宰、食品加工、銷售等過程傳遞給人。從這一現象也可以推測，伊犁昭蘇地區的環境被耐藥菌污染的可能性較大，平時應做好環境消殺工作，并處理好動物的排泄物，以免污染當地水源，導致耐藥菌的廣泛傳播。

從耐藥基因的檢測結果來看，伊犁昭蘇地區不同動物源糞腸球菌中耐藥基因的攜帶率較高，對被檢測的6 大類耐藥基因均有檢出。其中，羊源糞腸球菌中耐藥基因的檢出率最高，ermB、fexA、optrA、tet(M)和aph(3’)-Ⅲ的檢出率均在70.0%以上，與其耐藥表型基本一致。結合羊源糞腸球菌對慶大霉素和利奈唑胺的耐藥率及中介率，證明在中介菌株中也能檢出相關耐藥基因，應加強監測。氟苯尼考是動物專用藥，在動物體內的耐利奈唑胺腸球菌與其在臨床長期使用有著密切關系[22-23]。本研究中optrA檢出率較高，該基因可介導細菌對利奈唑胺產生耐藥性，為避免引發交叉耐藥，在飼養過程中應謹慎使用此藥物。牛源糞腸球菌的耐藥基因檢測結果中，aph(3’)-Ⅲ和fexA的檢出率低于其相對應藥物的耐藥率，這可能由于菌株攜帶有未檢測的耐藥基因或新的耐藥基因。在雞源糞腸球菌中，aph(3’)-Ⅲ和optrA的檢出率略高于其相對應藥物的耐藥率，這可能是由于耐藥基因在菌體內未表達，這些攜帶耐藥基因的菌株在藥物選擇壓力下轉變成耐藥菌株。此外，3 種動物源糞腸球菌中外排泵基因emeA的檢出率均在80.0%以上，該基因可介導糞腸球菌對多種不同結構的抗菌藥物（如慶大霉素、紅霉素、環丙沙星、新生霉素等）產生外排作用[16]，降低細菌內藥物的有效含量，從而導致療效下降。

綜上所述，新疆伊犁昭蘇地區羊源糞腸球菌的耐藥性非常嚴重，相關耐藥基因的檢出率較高，因此紅霉素、四環素、多西環素和氟苯尼考應考慮不再繼續使用或謹慎使用；牛源糞腸球菌耐藥情況相對較好，但也應持續監測，避免耐藥程度的加劇。此外，該地區應加強環境的消殺管理，特別是動物排泄物的規范化處理，避免排泄物中的耐藥菌由環境向人或動物傳播。