不同時間高氧對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞能量代謝的影響

黃蓉蓉 瞿珊珊 郭鴻 陳蘇衡 楊傳奇 張俊妹 李玉蘭

摘要：目的 探討不同時間高濃度氧對肺泡Ⅱ型上皮細胞線粒體能量代謝的影響。方法 將大鼠RLE-6TN細胞分為對照組（21% O2常規培養4 h）、高氧1、2、3、4 h組（95% O2分別培養1、2、3、4 h）。采用熒光素酶化學發光法檢測各組細胞的三磷酸腺苷（ATP）含量，采用微量法檢測線粒體呼吸鏈復合體V活性，熒光探針JC-1檢測細胞線粒體膜電位，實時熒光定量PCR法檢測線粒體呼吸鏈復合體 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的核心亞基NADH脫氫酶亞基1（ND1）、細胞色素b（Cytb）、細胞色素C氧化酶亞基I（COXI）、ATP酶6（ATPase6）mRNA的表達水平。結果 與對照組比較，高氧1、2、3、4 h組細胞線粒體呼吸鏈復合體核心亞基ND1（q=24.800，P＜0.001；q=13.650，P＜0.001；q=9.869，P＜0.001；q=20.700，P＜0.001）、COXI（q=16.750，P＜0.001；q=10.120，P＜0.001；q=8.476，P＜0.001；q=14.060，P＜0.001）及ATPase6 mRNA（q=22.770，P＜0.001；q=15.540，P＜0.001；q=12.870，P＜0.001；q=18.160，P＜0.001）表達水平均顯著降低；且高氧1、4 h組細胞ATPase活性受到抑制（q=9.435，P＜0.001；q=11.230，P＜0.001），ATP含量降低（q=5.615，P=0.007；q=5.029，P=0.005）；而高氧2、3 h組細胞ATPase活性（q=0.156，P=0.914；q=3.197，P=0.116）及ATP含量（q=0.859，P=0.557；q=1.273，P=0.652）差異無統計學意義。各組細胞線粒體膜電位之間差異無統計學意義（F=0.303，P=0.869）。結論 短時間高氧會抑制呼吸鏈復合體核心亞基表達并降低ATPase活性，導致肺泡Ⅱ型上皮細胞能量代謝障礙。

關鍵詞：高氧；線粒體；肺泡Ⅱ型上皮細胞；能量代謝

中圖分類號： R614.2+7? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）01-0009-07

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15096

Excess Oxygen Supply for Different Time Periods Affect Energy Metabolism in Rat Alveolar Epithelial Type Ⅱ Cells

HUANG Rongrong1，QU Shanshan1，GUO Hong1，CHEN Suheng1，YANG Chuanqi1，ZHANG Junmei1，LI Yulan2

1The First School of Clinical Medical，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

2Department of Anesthesiology，the First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Corresponding author：LI Yulan Tel：13519625065，E-mail：jasm@sina.com

ABSTRACT：Objective To observe the effect of excess oxygen supply for different time periods on the mitochondrial energy metabolism in alveolar epithelial type Ⅱ cells.Methods Rat RLE-6TN cells were assigned into a control group （21% O2 for 4 h） and excess oxygen supply groups （95% O2 for 1，2，3，and 4 h，res-pectively）.The content of adenosine triphosphate （ATP），the activity of mitochondrial respiratory chain complex V，and the mitochondrial membrane potential were determined by luciferase assay，micro-assay，and fluorescent probe JC-1，respectively.Real-time fluorescence quantitative PCR was employed to determine the mRNA levels of NADH dehydrogenase subunit 1 （ND1），cytochrome b （Cytb），cytochrome C oxidase subunit I （COXI），and adenosine triphosphatase 6 （ATPase6） in the core subunits of mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，and Ⅴ，respectively.Results Compared with the control group，excess oxygen supply for 1，2，3，and 4 h down-regulated the mRNA levels of ND1 （q=24.800，P<0.001；q=13.650，P<0.001；q=9.869，P<0.001；q=20.700，P<0.001），COXI （q=16.750，P<0.001；q=10.120，P<0.001；q=8.476，P<0.001；q=14.060，P<0.001），and ATPase6 （q=22.770，P<0.001；q=15.540，P<0.001；q=12.870，P<0.001；q=18.160，P<0.001）.Moreover，excess oxygen supply for 1 h and 4 h decreased the ATPase activity （q=9.435，P<0.001；q=11.230，P<0.001） and ATP content （q=5.615，P=0.007；q=5.029，P=0.005）.The excess oxygen supply for 2 h and 3 h did not cause significant changes in ATPase activity （q=0.156，P=0.914；q=3.197，P=0.116） and ATP content （q=0.859，P=0.557；q=1.273，P=0.652）.There was no significant difference in mitochondrial membrane potential among the groups （F=0.303，P=0.869）.Conclusion Short-term excess oxygen supply down-regulates the expression of the core subunits of mitochondrial respiratory chain complexes and reduces the activity of ATPase，leading to the energy metabolism disorder of alveolar epithelial type Ⅱ cells.

Key words：excess oxygen supply；mitochondria；alveolar epithelial type Ⅱ cell；energy metabolism

Acta Acad Med Sin，2023，45（1）：9-15

在全身麻醉過程中，患者高氧血癥的發生率可達83%［1］。相關研究表明，長時間暴露于超生理水平氧分壓下會導致肺組織的氧化應激損傷［2-4］。肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar epithelial type Ⅱ cell，AEC Ⅱ）是高氧介導肺損傷的關鍵靶點［5］，同時也是AEC Ⅰ的祖細胞［6］，在肺發育和損傷修復過程中具有重要作用［7］。線粒體是細胞能量代謝的核心，AEC Ⅱ能量代謝異常可能影響其合成、修復功能，參與肺組織損傷的病理過程。有研究發現高氧4 h后小鼠肺泡上皮細胞呼吸鏈復合體酶活性及氧化磷酸化水平降低，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成減少［8］；高氧6 h后肺血管內皮細胞線粒體結構紊亂［9］。但Farrow等［10］研究發現，在95%的高氧條件下，肺血管內皮細胞線粒體基質內活性氧在15 min內顯著增加，30 min時達到最大［10］，可見線粒體對高氧非常敏感，而高氧4 h內是否影響AEC Ⅱ 的能量代謝尚不清楚。因此，本研究體外培養大鼠AEC Ⅱ 建立高氧細胞模型，檢測4 h內不同時間點細胞線粒體呼吸鏈復合體和能量代謝變化趨勢，探究高氧肺損傷的形成機制。

材料和方法

材料 細胞株RLE-6TN購自北京北納創聯生物技術研究院，為永生化大鼠AEC Ⅱ。RPMI-1640培養基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素、0.25%胰酶均購自上海逍鵬生物科技有限公司；MolPure Cell/Tissue Total RNA試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒（JC-1）、線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

細胞培養及分組 RLE-6TN細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5% CO2的常規培養箱中培養，待細胞覆蓋培養瓶80%～90%時，用胰酶消化并傳代，一般2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞接種于培養瓶中，培養48 h后采用隨機數字表法將細胞分為對照組（21% O2常規培養4 h）、高氧1、2、3、4 h組（95% O2分別培養1、2、3、4 h）。

ATP含量檢測 收集各組細胞加入200 μl ATP裂解液，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 g離心5 min取上清液；黑色96孔板中加入100 μl ATP檢測液，靜止3～5 min后每孔加20 μl樣品或標準品，采用多功能酶標儀進行測定，根據標準曲線測定樣品中ATP的濃度，最后計算ATP濃度與BCA法檢測樣品蛋白濃度的比值，以μmol/mg表示。

線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性檢測 收集各組細胞以800 r/min（r=6 cm）的速率離心3 min，棄掉上清液，隨后采用微量法按照線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性檢測試劑盒說明書測定各組細胞ATP酶（ATP synthase，ATPase）的活性，同時測定各組細胞的蛋白濃度，以消除由于樣本中蛋白量的差異而造成的誤差。最后根據試劑盒說明書公式計算ATPase的濃度，以U/mg prot表示。

MMP檢測 收集各組細胞加入1 ml培養液和1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，置于37 ℃細胞培養箱中孵育20 min；吸除上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入2 ml培養液，在倒置熒光顯微鏡下觀察。MMP較高時，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，產生紅色熒光；MMP較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，以單體形式存在，產生綠色熒光。采用Image J分析平均熒光強度，計算紅色平均熒光強度/綠色平均熒光強度的比值來反應MMP變化。

qRT-PCR檢測 收集各組細胞，采用MolPure Cell/Tissue Total RNA試劑盒提取總RNA并測定濃度，HiScript Ⅱ Q RT SuperMix試劑盒進行反轉錄，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR測定。以GAPDH作為內參，擴增基因為NADH脫氫酶亞基1（NADH dehydrogenase subunit 1，ND1）、細胞色素b（cytochrome b，Cytb）、細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COXI）、ATPase6。反應程序：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，40個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物序列見表1。

統計學處理 采用GraphPad Prism 9軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊兩兩比較采用SNK檢驗。所有實驗均獨立重復3次。P＜0.05為差異有統計學意義。

結? 果

細胞內ATP含量 對照組，高氧1、2、3、4 h組細胞ATP含量分別為（0.44±0.02）、（0.37±0.01）、（0.45±0.03）、（0.46±0.03）、（0.38±0.01）μmol/mg，差異有統計學意義（F=11.170，P=0.001）。與對照組比較，高氧1、4 h組細胞ATP含量明顯降低（q=5.615，P=0.007；q=5.029，P=0.005），而2、3 h組細胞ATP含量差異無統計學意義（q=0.859，P=0.557；q=1.273，P=0.652）；與高氧1 h組比較，高氧2、3 h組細胞ATP含量明顯升高（q=6.474，P=0.005；q=6.888，P=0.005），而4 h組細胞ATP含量差異無統計學意義（q=0.586，P=0.687）；與高氧4 h組比較，高氧2、3 h組細胞ATP含量明顯升高（q=5.888， P=0.005；q=6.302，P=0.006）。

線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性 對照組，高氧1、2、3、4 h組細胞ATPase活性分別為（148.10±7.36）、（109.40±10.57）、（148.70±4.16）、（135.00±8.32）、（102.00±1.32）U/mg prot，差異有統計學意義（F=28.240，P＜0.001）。與對照組比較，高氧1、4 h組細胞ATPase活性明顯降低（q=9.435，P＜0.001；q=11.230，P＜0.001），而2、3 h組細胞ATPase活性差異無統計學意義（q=0.156，P=0.914；q=3.197，P=0.116）；與高氧1 h組比較，高氧2、3 h組細胞ATP含量明顯升高（q=11.230，P＜0.001；q=9.591，P=0.001），而高氧4 h組細胞ATP含量差異無統計學意義（q=1.793，P=0.234）；與高氧4 h組比較，高氧2、3 h組細胞ATPase活性明顯升高（q=11.380，P＜0.001；q=8.032，P＜0.001）。

熒光探針檢測MMP變化 熒光顯微鏡觀察結果顯示，對照組及高氧1、2、3、4 h組細胞平均熒光強度比值分別為4.320±0.641、4.149±1.023、4.371±0.599、4.585±0.397、4.649±0.260，差異無統計學意義（F=0.303，P=0.869）（圖1）。

ND1、Cytb、COXI和ATPase6的mRNA表達 對照組及高氧1、2、3、4 h組細胞ND1（F=93.650，P＜0.001）、COXI（F=41.080，P＜0.001）和ATPase6 mRNA（F=73.420，P＜0.001）表達水平差異有統計學意義，而Cytb mRNA表達水平差異無統計學意義（F=3.280，P=0.058）。與對照組比較，高氧1、2、3、4 h組細胞ND1（q=24.800，P＜0.001；q=13.65，P＜0.001；q=9.869，P＜0.001；q=20.700，P＜0.001）、COXI（q=16.750，P＜0.001；q=10.120，P＜0.001；q=8.476，P＜0.001；q=14.060，P＜0.001）及ATPase6 mRNA（q=22.770，P＜0.001；q=15.540，P＜0.001；q=12.870，P＜0.001；q=18.160，P＜0.001）表達水平明顯降低；與高氧1 h組比較，高氧2、3 h組細胞ND1（q=11.160，P＜0.001；q=14.940，P＜0.001）、COXI（q=6.625，P=0.002；q=8.273，P=0.001）和ATPase6 mRNA（q=7.225，P=0.001；q=9.897，P＜0.001）表達水平明顯升高，高氧4 h組ND1（q=4.107，P=0.016）、ATPase6 mRNA（q=4.612，P=0.009）表達水平明顯升高，而COXI mRNA表達水平差異無統計學意義（q=2.688，P=0.087）；與高氧4 h組比較，高氧2、3 h組細胞ND1（q=7.052，P＜0.001；q=10.830，P＜0.001）、COXI（q=3.938，P=0.019；q=5.585，P=0.007）及高氧3 h組ATPase6 mRNA（q=5.285，P=0.010）表達水平明顯增高，而高氧2 h組ATPase6 mRNA表達水平差異無統計學意義（q=2.613，P=0.094）（圖2）。

討? 論

長時間高氧暴露會導致多器官損傷，尤其是肺損傷［11］。高氧性肺損傷的機制非常復雜，至今尚未完全清楚。Garcia等［8］研究表明，高氧4 h會引起線粒體動力學、能量代謝等功能紊亂，但是4 h以內高氧是否會影響線粒體功能尚不清楚。本研究基于外科常規手術時間［12-14］、既往研究［15-16］及預實驗制備了高氧RLE-6TN細胞模型，探究4 h內的高氧暴露對AEC Ⅱ能量代謝的影響，結果顯示高氧1 h AEC Ⅱ線粒體呼吸鏈復合體核心亞基ND1、COXI、ATPase6 mRNA表達水平明顯降低，細胞總ATP合成急劇減少，ATPase活性降低；高氧持續2～3 h線粒體功能和酶活性代償性增高；高氧4 h細胞ATP含量又進一步下降，能量合成障礙，表明短時間高氧可抑制AEC Ⅱ的能量代謝，參與高氧肺損傷的發生。

線粒體呼吸鏈是細胞合成ATP的主要結構，ATP合成體系由2個電子載體（輔酶Q和Cytc）及位于線粒體內膜上的復合體Ⅰ～Ⅴ組成，其中復合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ具有質子泵功能，傳遞電子的同時驅動質子從線粒體基質跨過內膜進入膜間隙，同時形成MMP。質子通過線粒體復合體Ⅴ（ATPase）時驅動二磷酸腺苷與Pi結合并釋放ATP。由線粒體DNA編碼的13條多肽中包括線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ上的核心亞基ND1、Cytb、COXI和ATPase6［17-18］，是組成線粒體呼吸鏈復合體的主要成分，在電子傳遞及線粒體氧化磷酸化偶聯過程中起著重要作用，一旦受損可破壞呼吸鏈復合體的結構，從而導致氧化磷酸化解偶聯及ATP合成障礙［17］。動物實驗發現，暴露于高氧的大鼠肺泡細胞線粒體耗氧量減少，復合體 Ⅰ 和 Ⅱ 的活性分別降低77%和63%，ATP合成減少［19-20］；同樣，細胞實驗也顯示高氧降低了小鼠肺泡上皮細胞（MLE-12）對底物的利用率，抑制呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ功能，導致氧化磷酸化水平降低及ATP合成減少［8，21］，提示線粒體氧化磷酸化在高氧狀態下受到顯著抑制。本研究結果發現，AEC Ⅱ細胞在高氧4 h以內能量代謝呈雙向改變：高氧1 h能量代謝出現顯著“頓抑”現象，2～3 h有代償性增高，4 h再次出現降低；同時，ATPase活性和線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的核心亞基ND1、COXI、ATPase6 mRNA表達水平與ATP含量變化趨勢一致。由此可知短時間高氧暴露可引起線粒體能量代謝障礙，從而參與高氧肺損傷的病理過程。

然而，本研究中呼吸鏈復合體Ⅲ核心亞基Cytb的表達及MMP在高氧4 h內均未發生明顯的變化，這與Garcia等［8］及Resseguie等［22］研究結果一致。Cytb表達可能與細胞類型、高氧暴露的時間及對氧化應激刺激的敏感性不同有關。MMP是反映細胞內線粒體功能狀態的重要指標之一，是線粒體進行氧化磷酸化、產生ATP的先決條件。Audi等［23］將大鼠暴露于95%的高氧48 h后發現肺組織線粒體發生去極化，即MMP降低；同樣Zhu等［24］發現高氧24 h顯著降低了人肺泡上皮細胞MMP。而本研究中MMP表達沒有明顯變化，這可能是因為短時間高氧只影響了細胞的氧化磷酸化，并未對線粒體結構造成廣泛損傷［8］，或是線粒體在呼吸鏈損傷的狀態下通過糖酵解產生ATP來維持MMP［25］。

Garcia等［8］在探究高氧4 h對MLE-12細胞線粒體功能的影響時發現，在總的氧化磷酸化水平降低、ATP生成減少的同時，線粒體內、外膜融合蛋白轉錄增加，而線粒體分裂蛋白未發生改變，從而導致線粒體質量增加。線粒體代謝學與動力學關系密切，已有研究證實線粒體融合是對線粒體代謝失調的保護性反應［26］。本研究中高氧2～3 h代償性增高的原因及機制是否與線粒體動力學有關，還需進一步探究。

AEC Ⅱ功能呈能量依賴性，AEC Ⅱ內線粒體數量是Ⅰ型細胞的31倍，線粒體體積是其他肺組織細胞的3倍［27］。高氧引起的炎癥反應和氧化應激可誘導線粒體DNA突變或缺失［28］，線粒體呼吸鏈酶活性降低，引起AEC Ⅱ 能量代謝失衡，從而造成肺表面活性物質分泌不足，AEC Ⅱ 分化、修復 Ⅰ 型細胞能力受損［29-30］。因此，高氧誘導線粒體功能障礙引起的AEC Ⅱ能量代謝紊亂，可能是造成高氧肺損傷的原因之一。

綜上，本研究結果表明，短時間高氧雖然會出現損傷后代償效應，但代償后仍會導致線粒體呼吸鏈復合體核心亞基ND1、COXI及ATPase6的表達降低及線粒體ATPase的活性被抑制，進而干擾AEC Ⅱ 能量代謝，參與高氧肺損傷的病理過程。但本研究未進一步探究線粒體動力學及其與能量代謝之間的關系，未來還需要對高氧肺損傷時線粒體功能相關表型和機制的變化進行深入分析。

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（收稿日期：2022-05-06）