circ_0092315通過調控微小RNA-1256/高遷移率族蛋白A2促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和侵襲

柯淑紅 孔彩霞 徐瑤 彭聰

摘要：目的 研究circ_0092315對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖和侵襲的影響，并探討其分子機制。方法 采用實時熒光定量PCR方法檢測人甲狀腺乳頭狀癌細胞中circ_0092315的表達水平，CCK-8法和Transwell實驗檢測TPC-1細胞的增殖和侵襲能力，Western blot檢測高遷移率族蛋白A2（HMGA2）蛋白表達水平。通過生物信息數據庫、雙熒光素酶報告基因檢測、實時熒光定量PCR、蛋白質印跡法探討circ_0092315、微小RNA-1256（miR-1256）和HMGA2的靶向調控關系。結果 circ_0092315在人甲狀腺乳頭狀癌細胞中呈現高表達（P均＜0.001）。circ_0092315促進TPC-1細胞增殖和侵襲能力（P均＜0.001）。轉染circ_0092315小干擾RNA可上調miR-1256的表達水平（P<0.001）。miR-1256抑制物上調HMGA2蛋白表達（P＜0.001）。結論 circ_0092315在人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中呈高表達，通過調控miR-1256/HMGA2軸促進TPC-1細胞的增殖和侵襲。

關鍵詞：甲狀腺乳頭狀癌；circ_0092315；微小RNA-1256；高遷移率族蛋白A2

中圖分類號： R581.9? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）01-0016-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15026

circ_0092315 Promotes Proliferation and Invasion of Papillary Thyroid Carcinoma Cells via Regulating microRNA-1256/High Mobility Group A2 axis

KE Shuhong1，KONG Caixia1，XU Yao2，PENG Cong1

1Department of Endocrinology，2Department of Pathology，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan 430030，China

Corresponding author：PENG Cong Tel：027-85332130，E-mail：343747430@qq.com

ABSTRACT：Objective To investigate the role and mechanism of circ_0092315 in the proliferation and invasion of papillary thyroid carcinoma cells.Methods The expression of circ_0092315 in papillary thyroid carcinoma cells was examined by real-time fluorescence quantitative PCR.The proliferation and invasion of TPC-1 cells was assessed by CCK-8 and Transwell assays.The protein level of high mobility group A2 （HMGA2） was determined by Western blotting.The regulatory relationship of circ_0092315，microRNA-1256 （miR-1256），and HMGA2 was explored by bioinformatics tools，dual-luciferase reporter assay，real-time fluorescence quantitative PCR，and Western blotting.Results circ_0092315 was overexpressed in papillary thyroid carcinoma cells （all P<0.001）.circ_0092315 promoted the proliferation and invasion of TPC-1 cells （all P<0.001）.The transfection of si-circ_0092315 up-regulated the expression of miR-1256 （P<0.001），and miR-1256 inhibitor up-regulated the protein level of HMGA2 （P<0.001）.Conclusion circ_0092315 is overexpressed in TPC-1 cells and it promotes the proliferation and invasion of TPC-1 cells by regulating the miR-1256/HMGA2 axis.

Key words：papillary thyroid carcinoma；circ_0092315；microRNA-1256；high mobility group A2

Acta Acad Med Sin，2023，45（1）：16-21

甲狀腺癌是目前最常見的內分泌腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢，占內分泌系統惡性腫瘤的95%［1］。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌臨床病理分型之一，也是最常見、分化程度高、惡性度小的甲狀腺腫瘤［2］。盡管對其已有許多研究，但甲狀腺乳頭狀癌的發生發展是一個涉及多因素的復雜生物學過程，目前具體發病機制不清。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類共價閉合環狀的內源性非編碼RNA，在正常生理活動以及各種疾病進程中具有重要作用［3］。研究表明circRNA在腫瘤中表達異常且與腫瘤的發生發展密切相關，但circRNA在甲狀腺癌中的功能尚不清楚。最近研究發現，hsa_circ_0060060在甲狀腺乳頭狀癌細胞中表達上調，并通過抑制微小RNA（microRNA，miR）-144-3p增加甲狀腺癌細胞的順鉑耐藥性［4］。本研究通過生物信息學方法研究circ_0092315對甲狀腺癌乳頭狀癌細胞增殖和侵襲的影響，并探究其潛在的分子機制。

材料和方法

材料 人正常甲狀腺細胞Nthy-ori3-1、人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1、BCPAP、IHH4購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，TRIzol試劑盒、脂質體轉染試劑LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司，反轉錄和實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司，circ_0092315小干擾RNA（si-circ_0092315）及小干擾RNA對照（si-對照）、miR-1256模擬物及模擬物對照、miR-1256抑制劑及抑制劑對照、空載質粒、過表達人高遷移率族蛋白A2（high mobility group A2，HMGA2）質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司，兔抗人HMGA2抗體（貨號：ab207301）和GAPDH抗體購自美國Abcam公司，RIPA裂解液和BCA蛋白檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。

細胞培養及轉染 人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1、BCPAP、IHH4細胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。取對數生長期的TPC-1細胞以1×105個/孔的密度接種于六孔板中，按照Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒說明書進行轉染。根據處理情況將細胞分為si-circ_0092315組和si-對照組、miR-1256模擬物組和模擬物對照組、miR-1256抑制劑組及抑制劑對照組、si-circ_0092315+miR-1256抑制物組和si-circ_0092315+抑制物對照組、si-circ_0092315+過表達HMGA2組和si-circ_0092315+空載體組。

qRT-PCR檢測 采用Trizol試劑按說明書提取細胞總RNA，通過反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。在ABI 7500定量PCR儀上完成qRT-PCR擴增，采用2-ΔΔCT法分別計算目標基因的相對表達量。引物序列：circ_0092315上游引物：5′-TGCCAGCATGTAGACCTCAG-3′，下游引物：5′-TTGTGAAAATGCCAAGGACA-3′；miR-1256上游引物：5′-GGCGCGATTTTAGTTTATC-3′，下游引物：5′-TTTAATTACCAACCGAATACG-3′；GAPDH上游引物：5′-GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物：5′-CGGTGCCATGGAATTTGCC-3；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3′。circ_0092315基因檢測以GAPDH作為內參，miR-1256基因檢測以U6作為內參。

細胞增殖實驗 將轉染si-circ_0092315的TPC-1細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，分別培養24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，用酶標儀測定各孔細胞在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

細胞侵襲實驗 將10 μl Matrigel基質膠均勻涂在Transwell小室內面，待基質膠凝固。向24孔板中加入600 μl含有10%血清的DMEM高糖培養基，其內放置Transwell（8 μm）小室。向小室內加入轉染si-circ_0092315或陰性對照的TPC-1細胞（2.5×104個/孔），置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。24 h后取出小室，用棉簽將上室內面的細胞去掉，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%結晶紫染色液染色15 min，PBS清洗3次，用棉簽擦凈膜內面未遷移的細胞和染料，在顯微鏡下拍照，每個孔隨機選5個視野拍照，并分別計數后求出平均值進行比較。

Western blot檢測 按照每1.0×106個TPC-1細胞加入100 μl RIPA蛋白裂解液，混勻后置冰上30 min，4 ℃ 12 000 ×g離心30 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量。將轉有蛋白的PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫中振蕩封閉1 h，TBST緩沖液清洗后，加入兔抗人HMGA2抗體（1∶1000）4 ℃孵育過夜，清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，電化學發光法顯色，凝膠成像系統掃描分析。

雙熒光素酶報告基因檢測 利用Circular RNA Interactome數據庫（https：//circinteractome.nia.nih.gov/）預測circ_0092315靶基因。將circ_0092315的互補結合位點突變，構建突變型（circ_0092315突變型）和野生型（circ_0092315野生型）熒光素酶報告載體（廣州銳博生物技術有限公司），并與miR-1256模擬物或模擬物陰性對照轉染至TPC-1細胞中。轉染24 h后，利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒（Promega公司，美國）檢測熒光素酶活性。

統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD檢驗進行兩兩比較；多組間不同時間點比較采用重復測量方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結? 果

人甲狀腺乳頭狀癌細胞circ_0092315的表達水平 qRT-PCR檢測結果顯示，與人正常甲狀腺細胞Nthy-ori3-1比較，人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1（3.152±0.053比0.989±0.007；t=104.977，P<0.001）、BCPAP（2.257±0.041比0.989±0.007；t=71.930，P<0.001）、IHH4細胞（1.859±0.059比0.989±0.007；t=37.323，P<0.001）中的circ_0092315表達水平顯著升高，且在TPC-1細胞中表達最高（F=483.233，P<0.001）。

circ_0092315對TPC-1細胞增殖和侵襲能力的影響 與si-對照組比較，轉染si-circ_0092315的TPC-1細胞中circ_0092315表達水平顯著降低（0.486±0.046比0.990±0.009；t=30.982，P<0.001）。CCK-8法檢測結果顯示，si-circ_0092315組的TPC-1細胞在24、48、72 h的細胞增殖能力顯著低于si-對照組（F=1896.298，P<0.001），且兩組OD值變化趨勢差異有統計學意義（F=1320.688，P<0.001）（圖1A）。Transwell實驗檢測結果顯示，si-circ_0092315組TPC-1細胞的侵襲能力顯著低于si-對照組（37.000±5.121比94.100±4.012；t=27.756，P<0.001）（圖1B）。

circ_0092315與miR-1256的關系 利用Circular RNA Interactome數據庫分析發現，miR-1256和circ_0092315之間存在結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-1256模擬物和circ_0092315野生型共轉染后，與模擬物對照組比較，miR-1256模擬物組熒光素酶活性顯著降低（0.528±0.048比0.978±0.009；t=27.889，P<0.001）。與si-對照組比較，轉染si-circ_0092315的TPC-1細胞miR-1256表達水平顯著增加（2.126±0.063比0.986±0.011；t=51.347，P<0.001）。

si-circ_0092315和miR-1256抑制物對TPC-1細胞增殖和侵襲能力的影響 CCK-8法檢測結果顯示，si-circ_0092315+miR-1256抑制物組TPC-1細胞在24、48、72 h的細胞增殖能力顯著高于si-circ_0092315+抑制物對照組（F=1690.251，P<0.001），si-對照+抑制物對照組、si-circ_0092315組、si-circ_0092315+抑制物對照組和si-circ_0092315+miR-1256抑制物組OD值變化趨勢差異有統計學意義（F=598.694，P<0.001）（圖2A）。Transwell實驗檢測結果顯示，與si-對照+抑制物對照組比較，si-circ_0092315組TPC-1細胞遷移能力顯著降低（21.100±7.838比98.400±1.265，t=30.789，P<0.001）；與si-circ_0092315組比較，si-circ_0092315+抑制物對照組TPC-1細胞遷移能力差異無統計學意義（21.000±2.449比21.100±7.838，t=0.039，P=0.970）；與si-circ_0092315+抑制物對照組比較，si-circ_0092315+miR-1256抑制物組TPC-1細胞遷移能力顯著升高（55.400±3.098比21.000±2.449，t=27.542，P<0.001）（圖2B）。

circ_0092315和miR-1256對HMGA2表達的影響 利用Targetscan數據庫預測發現miR-1256與HMGA2之間存在結合位點（圖3A）。Western blot檢測結果顯示，與模擬物對照組比較，miR-1256 模擬物組TPC-1細胞HMGA2蛋白表達水平顯著降低（0.267±0.036比0.990±0.007；t=51.946，P<0.001）；與抑制物對照組比較，miR-1256抑制物組TPC-1細胞HMGA2蛋白表達水平顯著升高（1.587±0.033比0.992±0.007；t=35.866，P<0.001）（圖3B）。與si-對照組比較，si-circ_0092315組TPC-1細胞HMGA2表達下降（0.237±0.036比0.990±0.008，t=64.648，P<0.001）；與si-circ_0092315組比較，si-circ_0092315+抑制物對照組TPC-1細胞HMGA2表達差異無統計學意義（0.224±0.023比0.237±0.036，t=0.967，P=0.346）；與si-circ_0092315+抑制物對照組比較，si-circ_0092315+miR-1256抑制物組TPC-1細胞HMGA2表達顯著增加（0.528±0.048比0.224±0.023，t=17.955，P<0.001） （圖3C）。

過表達HMGA2和si-circ_0092315對TPC-1細胞增殖和侵襲能力的影響 CCK-8法檢測結果顯示，si-circ_0092315+過表達HMGA2組TPC-1細胞在24、48、72 h的細胞增殖能力顯著高于si-circ_0092315+空載體組（F=3980.506，P<0.001），si-對照+空載體組、si-circ_0092315組、si-circ_0092315+空載體組、si-circ_0092315+過表達HMGA2組OD值變化趨勢差異有統計學意義（F=1016.712，P<0.001）（圖4A）。Transwell實驗檢測結果顯示，與si-對照+空載體組比較，si-circ_0092315組TPC-1細胞侵襲能力顯著下降（35.100±2.079比104.800±1.932，t=77.658，P<0.001）；與si-circ_0092315組比較，si-circ_0092315+空載體組TPC-1細胞侵襲能力差異無統計學意義（35.600±2.271比35.100±2.079，t=0.514，P=0.614）；與si-circ_0092315+空載體組比較，si-circ_0092315+過表達HMGA2組TPC-1細胞侵襲能力顯著升高（82.200±4.614比35.600±2.271，t=28.656，P<0.001）（圖4B）。

討? 論

近年來越來越多的研究表明circRNA的異常表達與腫瘤的發生發展密切相關。本研究結果發現circ_0092315在甲狀腺乳頭狀癌細胞中呈高表達，且通過調控miR-1256/HMGA2通路促進TPC-1細胞的增殖和侵襲。

circRNA通過分子海綿作用結合miRNA從而調控蛋白表達發揮生物學作用。有文獻報道circ_0087862可以競爭性結合miR-1253，通過調控Ras癌基因家族蛋白Rab3D的表達促進非小細胞肺癌的進展［6］；circ_0001955吸附miR-516a-5p上調腫瘤壞死因子受體相關因子6/絲裂原激活蛋白激酶11的表達促進肝癌細胞的增殖和遷移［7］。本研究通過生物信息方法預測circ_0092315靶基因，發現circ_0092315與miR-1256存在互補結合位點，干擾circ_0092315可上調miR-1256表達，抑制TPC-1細胞的增殖和侵襲能力。miR-1256已被證實在多種腫瘤中起到腫瘤抑制作用，其表達下調會促進腫瘤的生長和轉移。Chang等［8］研究發現circ_0026134通過分子海綿機制下調miR-1256和miR-1287表達促進非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲；Cai等［9］研究顯示circHECTD1通過靶向下調miR-1256表達激活β-連環蛋白/c-Myc信號通路促進胃癌的進展。因此，circRNAs可能通過負調控miR-1256的表達發揮促癌作用。

本研究通過Targetscan數據庫分析發現HMGA2是miR-1256的靶基因，且miR-1256抑制HMGA2表達。HMGA2在多種惡性腫瘤中存在過表達現象，并通過多種機制促進腫瘤的發生［10］。Dong等［11］研究顯示HMGA2參與驅動的FOXL2反式激活可直接調節對化療耐藥胃癌的轉移和上皮間質轉換。Ma等［12］研究表明miR-302a-5p/367-3p介導HMGA2表達可調控子宮內膜癌細胞的惡性表型。此外，近年來研究發現circRNA可通過調控HMGA2促進腫瘤進展，circ_100565通過miR-506-3p/HMGA2促進非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲［13］；circFAM73A調控miR-490-3p/HMGA2增強胃癌細胞干性［14］。本研究結果顯示，過表達HMGA2可以逆轉si-circ_0092315對TPC-1細胞增殖和侵襲能力的抑制作用，提示HMGA2參與circ_0092315對TPC-1細胞的促增殖和侵襲作用。

綜上，本研究結果發現，circ_0092315在人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中呈高表達，通過內源競爭RNA機制調控miR-1256/HMGA2通路，促進TPC-1細胞的增殖和侵襲能力。但本研究缺乏體內實驗的驗證；此外，miR-1256/HMGA2下游的分子機制還有待進一步研究。

參 考 文 獻

［1］韓婧，康驊.甲狀腺癌的發病現狀及影響因素［J］.實用預防醫學，2018，25（7）：894-896.DOI：10.3969/j.issn.1006-3110.2018.07.037.

［2］中華人民共和國國家衛生健康委員會.甲狀腺癌診療規范（2018年版）［J］.中華普通外科學文獻（電子版），2019，13（1）：1-15.DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2019.01.001.

［3］Chen L，Huang C，Shan G.Circular RNAs in physiology and non-immunological diseases ［J］.Trends Biochem Sci，2022，47（3）：250-264.DOI：10.1016/j.tibs.2021.11.004.

［4］Liu F，Zhang J，Qin L，et al.Circular RNA EIF6 （Hsa_circ_0060060） sponges miR-144-3p to promote the cisplatin-resistance of human thyroid carcinoma cells by autophagy regulation ［J］.Aging （Albany NY），2018，10（12）：3806-3820.DOI：10.18632/aging.101674.

［5］Peng N，Shi L，Zhang Q，et al.Microarray profiling of circular RNAs in human papillary thyroid carcinoma ［J］.PLoS One，2017，12（3）：e0170287.DOI：10.1371/journal.pone.0170287.

［6］Li L，Wan K，Xiong L，et al.CircRNA hsa_circ_0087862 acts as an oncogene in non-small cell Lung cancer by targeting miR-1253/RAB3D axis ［J］.Onco Targets Ther，2020，13：2873-2886.DOI：10.2147/OTT.S243533.

［7］Yao Z，Xu R，Yuan L，et al.Circ_0001955 facilitates hepatocellular carcinoma （HCC） tumorigenesis by sponging miR-516a-5p to release TRAF6 and MAPK11 ［J］.Cell Death Dis，2019，10（12）：945.DOI：10.1038/s41419-019-2176-y.

［8］Chang H，Qu J，Wang J，et al.Circular RNA circ_0026134 regulates non-small cell lung cancer cell proliferation and invasion via sponging miR-1256 and miR-1287 ［J］.Biomed Pharmacother，2019，112：108743.DOI：10.1016/j.biopha.2019.108743.

［9］Cai J，Chen Z，Wang J，et al.circHECTD1 facilitates glutaminolysis to promote gastric cancer progression by targeting miR-1256 and activating β-catenin/c-Myc signaling ［J］.Cell Death Dis，2019，10（8）：576.DOI：10.1038/s41419-019-1814-8.

［10］Mansoori B，Mohammadi A，Ditzel HJ，et al.HMGA2 as a critical regulator in cancer development ［J］.Genes （Basel），2021，12（2）：269.DOI：10.3390/genes12020269.

［11］Dong J，Wang R，Ren G，et al.HMGA2-FOXL2 axis regulates metastases and epithelial-to-mesenchymal transition of chemoresistant gastric cancer ［J］.Clin Cancer Res，2017，23（13）：3461-3473.DOI：10.1158/1078-0432.CCR-16-2180.

［12］Ma J，Li D，Kong FF，et al.miR-302a-5p/367-3p-HMGA2 axis regulates malignant processes during endometrial cancer development ［J］.J Exp Clin Cancer Res，2018，37（1）：19.DOI：10.1186/s13046-01 8-0686-6.

［13］Li L，Wei H，Zhang H，et al.Circ_100565 promotes proliferation，migration and invasion in non-small cell lung cancer through upregulating HMGA2 via sponging miR-506-3p ［J］.Cancer Cell Int，2020，20：1 60.DOI：10.1186/s12935-020-01241-8.

［14］Xia Y，Lv J，Jiang T，et al.CircFAM73A promotes the cancer stem cell-like properties of gastric cancer through the miR-490-3p/HMGA2 positive feedback loop and HNRNPK-mediated β-catenin stabilization ［J］.J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）：103.DOI：10.1186/s13046-021-01896-9.

（收稿日期：2022-04-01）