心臟死亡器官捐獻(xiàn)供腎零點活檢冷凍組織改良PAS、Masson和PASM染色技術(shù)

陳 昕,黃海建,王 晨,陳 新,陳惠玉

隨著國際標(biāo)準(zhǔn)化心臟死亡器官捐獻(xiàn)(donation after cardiac death, DCD)工作的廣泛開展,DCD來源的供腎在臨床的應(yīng)用逐漸增多。DCD供腎移植術(shù)后并發(fā)癥亦呈逐漸增加趨勢,如移植腎缺血再灌注損傷、機(jī)會性病毒感染、排斥反應(yīng)等,這就要求臨床醫(yī)師評估供腎質(zhì)量,除了臨床評分及肉眼評估外,腎移植術(shù)中零點穿刺標(biāo)本是評估移植腎功能、預(yù)測器官分配或遠(yuǎn)期存活的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。目前大多數(shù)腎移植中心常規(guī)使用冷凍切片HE染色評估供腎功能狀態(tài)。由于冷凍制片HE染色存在較多不足,如不能很好地觀察腎小球硬化及血管硬化,尤其是制片過程中形成的間質(zhì)增寬假象,使得供腎評估存在重復(fù)性較差、評分不準(zhǔn)確等,導(dǎo)致丟棄腎臟或無法預(yù)測移植后腎功能。作者通過對DCD來源的供腎穿刺組織行冷凍切片的改良PAS、Masson、PASM特殊染色[2],縮短操作流程,保證在較短時間內(nèi)完成染色,使得供腎質(zhì)量在較短時間內(nèi)得以較準(zhǔn)確地評估,介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年3月～2022年2月福建省立醫(yī)院獲得的DCD供腎合計45例。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器櫻花OCT冷凍膠世泰玻片(磨砂片),AAF固定液(95%乙醇85 mL、冰醋酸5 mL、40%甲醛10 mL),3%高碘酸,六胺銀工作液(蒸餾水20 mL、3%六次甲基四胺水10 mL、5%四硼酸鈉2.5 mL、5%硝酸銀0.6 mL),0.25%硫代硫酸鈉,0.2%氯化金,Harrias蘇木精,各級梯度乙醇,二甲苯;PAS試劑盒(邁新公司),Masson試劑盒(貝索生物公司);德國Leica CM1950恒溫冰凍切片機(jī)。

1.3 方法改良PAS染色步驟[3]:(1)3 μm厚冷凍切片,AAF液固定30 s;(2)高碘酸氧化10 min,蒸餾水沖洗;(3)滴加Schiff液暗處50 ℃烤箱孵育10 min,流水沖洗5 min;(4)蘇木精襯染30 s,流水返染;(5)梯度乙醇脫水,二甲苯透明干燥,中性樹膠封固。

改良Masson染色步驟[4]:(1)3 μm厚冷凍切片,AAF液固定30 s;(2)Weigert鐵蘇木精(Weigert鐵蘇木精A、B液等比例混合液)染5～10 min,流水稍洗;(3)1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,流水沖洗數(shù)分鐘;(4)麗春紅酸性品紅染液65 ℃烤箱孵育10～15 min,流水稍沖洗;(5)磷鉬酸溶液處理2～3 min,傾去玻片上磷鉬酸溶液(無需水洗);(6)苯胺藍(lán)染液復(fù)染3～5 min,傾去玻片上染液(無需水洗);(7)1%冰醋酸水溶液(1%冰醋酸水溶液配制:99 mL蒸餾水+1 mL冰醋酸)沖洗切片至切片無藍(lán)色脫出(必要時鏡下控制);(8)95%乙醇稍洗,無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

改良PASM染色步驟[5-7]:(1)3 μm厚冷凍切片,AAF液固定30 s;(2)3%高碘酸氧化10～15 min,流水稍洗;(3)2%硫酸鐵銨媒染5 min,蒸餾水洗;(4)浸入85 ℃預(yù)熱的六胺銀工作液中15～20 min至組織達(dá)到著色標(biāo)準(zhǔn),蒸餾水速洗2次終止染色;(5)0.25%硫代硫酸鈉1 min,水洗;(6)Harrias蘇木精襯染30 s,流水返染;(7)梯度乙醇脫水,二甲苯透明干燥,中性樹膠封固。

2 結(jié)果

45例腎移植穿刺組織改良PAS染色呈紫紅色,清晰染色腎小球囊壁、系膜細(xì)胞、基膜以及血管(圖1)。在腎小球硬化中呈深紫紅色(圖2),腎小球入球小動脈可見淡粉色空泡狀,顯示內(nèi)膜水腫變性(圖3)。45例腎移植穿刺組織改良Masson染色示,基膜、系膜基質(zhì)和膠原呈藍(lán)色,免疫復(fù)合物、纖維素樣壞死、血栓均呈紅色顆粒狀、球形(圖4);細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。腎小管上皮細(xì)胞壞死呈顆粒狀紫紅色、細(xì)胞輪廓不清,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清(圖5)。45例腎移植穿刺組織改良PASM染色示毛細(xì)血管基膜呈黑色,細(xì)胞核呈藍(lán)色,紅細(xì)胞呈紅色。通過六胺銀染色可以更清晰地顯示基膜病變與細(xì)胞外基質(zhì)增多,腎小球硬化及間質(zhì)纖維化時呈現(xiàn)網(wǎng)線狀黑色著色(圖6)。

圖1 腎小球囊壁、系膜細(xì)胞、基膜、腎小管周基膜均呈紫紅色染色,PAS染色 圖2 腎小球硬化,PAS染色 圖3 腎小球入球小動脈硬化,間質(zhì)較多炎癥細(xì)胞浸潤,PAS染色 圖4 腎小球血管襻內(nèi)微血栓形成,Masson染色 圖5 腎小管上皮細(xì)胞崩解、顆粒狀變性、壞死,Masson染色 圖6 腎小球纖維性新月體,伴硬化,PASM染色

3 討論

由于供腎零點活檢只能在供腎從供體取下后移植到受者體內(nèi)非常短暫的數(shù)小時窗口期內(nèi)進(jìn)行,故盡可能快速獲得組織病理結(jié)果尤為重要。冷凍診斷雖然快,但與常規(guī)HE染色相比,存在染色對比度較低,組織細(xì)微變化易被忽略;而對于供腎零點活檢,腎小球硬化率、間質(zhì)纖維化、血管內(nèi)膜增厚等形態(tài)學(xué)特征是評估供腎質(zhì)量及移植預(yù)后的關(guān)鍵,特殊染色則能補充以上冷凍診斷的不足,滿足醫(yī)師對這些變化的觀察[2]。

PAS染色是腎臟病理診斷、分類和臨床治療的重要參考依據(jù),其能較好地勾畫出腎小球、腎小管基膜的輪廓和腎臟各固有細(xì)胞的種類,清晰地顯示出腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生的情況、腎小管萎縮狀態(tài)、血管壁增厚與否及炎細(xì)胞浸潤的嚴(yán)重程度等,是腎臟病理診斷必要的特殊染色技術(shù)[3]。在冷凍中由于時效性的要求,實驗將滴加Schiff液的待檢片放入烤箱暗處加熱孵育,加快染色速度。化學(xué)反應(yīng)的速度大多隨溫度升高而加快,溫度升高時活化分子增加,分子運動加快,反應(yīng)物分子間的有效碰撞機(jī)會增加。糖原染色積分均數(shù)隨溫度升高依次增加,說明多糖類或糖原的乙二醇經(jīng)過碘酸氧化成雙醛基后,后者與Schiff液作用由無色品紅變成紫紅色化合物速度也加快[8]。

在腎活檢組織樣本中,Masson染色顯示基膜、系膜基質(zhì)和膠原呈綠色或藍(lán)色(取決于使用亮綠或苯胺藍(lán)),免疫復(fù)合物、纖維素樣壞死、血栓均呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。主要用于觀察壞死性病變、免疫復(fù)合物沉積及膠原纖維增生[9]。染色注意要點:固定時間需延長10 min,Masson染色成敗與組織固定的關(guān)系較大,包括固定液的選擇與固定時間的長短。本組冷凍固定液選擇的是AAF液,內(nèi)含甲醛、冰醋酸、95%乙醇,能夠很好地固定組織。在PAS、PASM、Masson染色中,相同的固定時間PAS、PASM染色效果較理想,Masson染色則存在染色偏淡情況,可能與固定時間較短有關(guān),作者嘗試延長固定時間,麗春紅酸性品紅加溫染色,減少染色水洗時間與磷鉬酸分化時間,切片染色得到改善,達(dá)到滿足診斷的要求。

由于改進(jìn)前PASM染色耗時較長,約2 h,無法滿足快速診斷的需要,所以在工作中未予以開展,但通過改進(jìn)后染色時間縮短到1 h內(nèi),對懷疑供腎有腎小球硬化性腎炎和原發(fā)性腎小球腎病等的診斷及預(yù)測起到了重要的指導(dǎo)作用[7]。另外,移植標(biāo)本較小,用冷凍組織做特殊染色可以觀察到組織的最大切面,信息含量大,而冷凍組織經(jīng)脫水后組織縮小20%～30%,再加上常規(guī)染色、免疫組化制片損耗較多,信息面不如冷凍活檢有優(yōu)勢。本實驗改進(jìn)方法中要注意的問題:(1)冷凍切片厚3 μm,太厚將影響基膜的觀察,太薄則延長染色時間。(2)傳統(tǒng)氧化使用2%高碘酸,本實驗將氧化濃度提高到3%,目的在于使組織內(nèi)黏多糖更好地暴露出醛基,醛基再把六胺銀還原為金屬銀。(3)傳統(tǒng)方法氧化后直接入六胺銀工作液,改良后加入硫酸鐵銨媒染,使銀染更快。(4)提高六胺銀工作液中硝酸銀的量,由原來的0.5 mL提高到0.6 mL,工作液需新鮮配制,先將3%六次甲基四胺水加入蒸餾水,再加入5%四硼酸鈉放烤箱預(yù)熱10 min,待染色時再加入5%硝酸銀,待溶液呈透明狀表示配置成功即可使用。四硼酸鈉與六次甲基四胺水混合液體堿化后再加入硝酸銀,這樣可以削弱六次甲基四胺螯合銀離子的穩(wěn)定性,使銀離子極易被游離的醛基還原成棕黑色沉淀。(5)孵育溫度與時間是染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)染色溫度在56～58 ℃染色60～90 min,銀染均勻效果好,缺點是耗時。另有文獻(xiàn)報道提高工作液染色溫度可以縮短染色時間。文獻(xiàn)報道[6]90 ℃ 20 min的染色條件亦能達(dá)到染色效果,但作者經(jīng)過實驗認(rèn)為85 ℃染色20 min就可以達(dá)到同樣染色效果,而且不易出現(xiàn)過度著色現(xiàn)象,基膜染色也較清晰。銀染過程中應(yīng)以腎小球基膜著色強度為終止染色的判斷標(biāo)準(zhǔn),以達(dá)到黑色為準(zhǔn),背景應(yīng)呈黃棕色。這要求技師應(yīng)關(guān)注鏡下染色程度,達(dá)到染色要求后及時終止染色,避免染色過深,影響觀察。