EBER原位雜交手工檢測常見問題與對策

施 洋

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)屬于皰疹病毒,在人群中普遍存在感染,一旦原發感染康復后會轉變為終身潛伏狀態。隨著對EBV的深入研究,我們發現它與許多腫瘤的發生有關[1]。原位雜交檢測可在分子層面上確認EBV與腫瘤之間的關聯,是檢測EBV相關腫瘤的金標準。目前,多數大型醫院EBER原位雜交檢測已使用全自動免疫組化染色儀,鑒于中小型醫院受場所、資金、人員等因素的限制,手工操作方法依然是首選。本科室根據實際工作對EBER原位雜交(EBER試劑盒購自北京中杉金橋公司)手工檢測過程中出現的問題、原因及應對措施進行詳細分析,取得良好效果,現報道如下。

1 酶消化前

1.1 組織固定不良

1.1.1組織輕度固定不良導致信號定位不準確 原因:離體組織經充分及時地固定能夠最大限度的保存細胞內核酸的完整性,保持mRNA的穩定性。有時候因固定溫度、時間、試劑濃度、組織大小等因素的影響,導致組織出現輕度固定不良的現象,使組織細胞核結構松散,原本定位細胞核內的mRNA在細胞內出現彌散,導致信號定位不準確影響最終判讀(圖1)。對策:離體組織需在室溫環境下30 min內進行固定,固定液建議使用10%中性緩沖福爾馬林(pH 7.2～7.4)。活檢組織固定時間4～6 h,大組織固定時間8～12 h,一般建議不超過24 h,長時間甲醛固定組織對核酸會有較大的破壞作用,同時也會產生甲醛色素干擾最終結果判讀。

1.1.2組織嚴重固定不良導致無信號表達 原因:嚴重固定不良的組織發生自溶,組織結構完全破壞,細胞核碎裂溶解,DNA和RNA丟失殆盡,無法進行EBER檢測。這一情況大多數是人為造成的,如組織未添加固定液或用錯試劑配置甲醛固定液等。對策:加強人員崗位技能培訓,制定完善的科室管理制度,建設科室質量安全管理團隊[2];配置試劑時,“取、配、棄”三個環節要做到三核查,可以最大限度避免配錯試劑的可能。

1.2 組織脫蠟不干凈導致信號表達強度下降甚至假陰性原因:組織脫蠟不干凈會較大程度的影響酶組織消化效果,同時也會造成探針的穿透結合效率下降,導致最終信號表達減弱或不表達。對策:EBER檢測要單獨使用二甲苯脫蠟,脫蠟時間控制為10～15 min。脫蠟液要根據實際工作定量、定期更換以保證脫蠟質量,通常情況下脫蠟超過80張切片或使用3天就要進行脫蠟液更換,尤其在南方地區濕度較大,更換需更加頻繁。

1.3 酶消化前組織干燥不徹底導致信號表達強度下降原因:首先,胃蛋白酶消化對pH值的變化較為敏感,它需在pH 1.5～5.0才具有較高的活性,而干燥不充分會導致殘留的水分改變了消化環境的pH值,在滴加胃蛋白酶后影響酶活性,造成組織消化不徹底;其次,由于胃蛋白酶的空間結構使其在一定程度上表現有疏水特性,在組織含有水分的情況下影響酶的穿透與消化能力,也會造成組織消化不完全。對策:每次實驗前更換無水乙醇保證其純度,并且多次浸泡切片達到充分脫水的要求;延長組織干燥時間,通常在空氣中放置10 min就能達到較好的干燥效果。

2 雜交前

2.1 蛋白酶消化不足導致信號表達減弱原因:蛋白酶消化效果受眾多因素的影響,如蛋白酶種類選擇不當、消化時間過短、消化溫度過低、切片偏厚等均會導致蛋白酶不能完全消除靶核酸周圍的雜蛋白,將其核酸序列完全暴露出來,影響了組織的通透性,不利于探針滲透并進行充分雜交(圖2)。對策:采用胃蛋白酶在37 ℃恒溫環境下3 μm厚組織切片消化10 min,組織厚度每增加1 μm消化時間增加5 min。由于組織過厚會導致消化時間難以控制,組織消化不充分,且組織細胞大量重疊會影響陽性定位判讀,一般建議組織厚度不超過5 μm。

圖2 蛋白酶消化不足導致信號表達減弱 圖3 消化過度造成組織松散信號分布不均

2.2 蛋白酶消化過度導致組織結構松散信號分布不均原因:過度消化一般是在消化溫度和時間上把控不好造成的,這種情況往往在使用蛋白酶K后時有發生。蛋白酶K是一種強力蛋白溶解酶,在55 ℃使用時要嚴格控制消化時間,操作過程中稍有不慎就會導致消化過度(圖3)。對策:建議使用消化能力相對穩定平和的胃蛋白酶,在操作過程中控制好消化時間。最新文獻報道改良EBER檢測方法中使用EDTA代替蛋白酶K,也取得了較好的消化效果,并且可以提高雜交信號[3]。

2.3 雜交前組織干燥不徹底導致雜交信號減弱原因:組織干燥不徹底,組織內含有的水分會稀釋了滴加微量的探針濃度,往往會導致雜交率下降。對策:同前一次組織干燥方法。

3 雜交中

3.1 探針效價下降造成信號減弱或無信號原因:探針效價下降往往是因為保存條件不符合要求造成的,或探針超過有效期限。對策:工作液保存在4 ℃冰箱,使用時要即拿即放,減少在外界停留時間;對于濃縮液需分裝置于-20 ℃保存,用多少取多少,避免反復凍融。存放探針的冰箱要建立冷鏈系統,嚴格監控冰箱溫度;同時要建立完善的試劑管理體系,做到專人專管,并記錄好試劑到貨、使用、過期的時間,在試劑上貼有相應時間標識,避免試劑過期使用。

3.2 雜交條件選擇不恰當導致信號表達不穩定原因:原位雜交的過程就是帶有標志物的探針與靶序列按照堿基配對互補的原則進行特異性雜交過程,其受很多因素的影響,尤其是組織層面。雜交前不同組織的狀態是不一致的,不同組織細胞核內病毒拷貝數也不確定,雜交時間達不到要求往往會導致信號強度下降;不穩定的溫度、濕度也會使雜交率發生波動,造成不穩定的結果。對策:采用原位雜交儀37 ℃雜交12～16 h,充足的雜交時間能夠滿足不同病毒拷貝數的組織,另一方面原位雜交儀的使用可為雜交過程提供穩定的環境,同時操作簡單,與恒溫培養箱相比具有明顯的優勢。

3.3 蓋玻片封片時有氣泡造成局部組織無信號表達原因:組織表面有雜質,蓋玻片表面有異物,探針滴加過少,這些原因都是導致氣泡處探針無法進入細胞核內并與靶序列雜交(圖4)。對策:PBS充分洗滌去除組織表面雜質;蓋玻片選擇硅化處理過的,提高表面清潔度;探針滴加量根據組織大小來適當增減。

圖4 雜交時探針分布不均導致信號雜亂,部分組織不表達 圖5 探針干燥后出現局灶性強背景

3.4 橡膠水泥封邊不到位導致非特異性背景原因:橡膠水泥封邊不全會造成雜交過程中探針干燥,與組織發生非特異性結合,在PBS沖洗中很難洗脫而造成背景染色(圖5)。對策:橡膠水泥封邊后將玻片放在37 ℃原位雜交儀上晾干,待橡膠水泥徹底干燥后仔細觀察封邊情況,如有遺漏可進一步添加補充。

4 雜交后

PBS緩沖液洗滌不徹底導致非特異性染色:組織切片洗滌不充分會造成探針、抗體在組織內部殘留,形成非特異性結合而造成背景著色(圖6)。對策:延長每一步PBS洗滌時間至10 min,同時PBS緩沖液每次使用前需重新配制,加入0.01%Tween-20。我們發現加入Tween-20可以有效地降低載玻片的表面張力,有利于試劑在組織上延展;有利于洗脫未結合的探針、抗體等[4]減少非特異性背景產生;實驗中我們還發現它還可以在一定程度上增加組織的通透性,有利于探針的穿透雜交。

圖6 沖洗不足導致非特異性背景

5 實驗對照的設立

為確保實驗結果的可靠性,在操作過程中需要設立實驗對照,這也是EBER檢測實驗室質量控制的重要手段。根據操作規范要求,每次檢測EBER時均需設立陰、陽性對照,對試劑造成一定的浪費。手工操作的影響因素是針對每一張組織切片,因此利用組織芯片技術可以最大限度的滿足EBER檢測實驗對照的需求。通常我們在每張組織切片充分烤片后將多余的組織擦掉,然后在近靶目標側裱上芯片組織再次烤片。有文獻報道,利用對照組織制作組織切片勻漿液也能達到較好的對照效果,且該方法制作簡單,組織用量少,陽性信號穩定[5]。

綜上所述,EBER手工檢測影響因素眾多,為此需要建立一套完整并符合規范的操作制度和操作流程以保證實驗室質量安全,同時實驗室工作人員還需要經過專業的培訓,操作時認真負責,嚴格遵循操作規范,得到安全可靠的EBER實驗室結果。