淫羊藿苷對去卵巢大鼠骨髓間充質干細胞分化的影響

周亞妮,趙雪麗,趙永麗

(1.商洛學院健康管理學院,陜西 商洛 726000;2.商洛市康養產業工程技術研究中心,陜西 商洛 726000;3.商洛市中心醫院,陜西 商洛 726000)

骨質疏松癥是一種以骨量降低、骨組織微結構損壞為特征的臨床常見骨骼疾病。隨著人口老齡化日趨嚴重,骨質疏松癥已成為我國面臨的重要公共健康問題。骨質疏松癥分為原發性和繼發性兩大類,原發性骨質疏松癥包括絕經后骨質疏松癥、老年骨質疏松癥和特發性骨質疏松癥,其中絕經后骨質疏松癥發病率高達50%,可見絕經后婦女是骨質疏松癥的高風險人群[1]。淫羊藿屬于小檗科草本植物,是常用的治療骨質疏松癥的中藥,淫羊藿苷是淫羊藿提取物的主要活性成分和指標性成分[2]。相關研究表明,淫羊藿苷既能抑制骨吸收,提升骨密度,又沒有雌激素的潛在不良反應[3-6],故被稱之為“植物雌激素”。骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓來源的干細胞,具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞等多種細胞的潛能,其中BMSCs成骨分化和成脂分化動態平衡是維持骨內穩態、決定骨組織結構的關鍵[7]。女性絕經后雌激素水平降低,機體內分泌系統紊亂,會加速BMSCs自噬、衰老,影響BMSCs成骨分化,并導致骨形成減少,引起骨質疏松[8]。本研究通過探討淫羊藿苷誘導BMSCs向成骨細胞分化的機制,旨在為淫羊藿苷應用于女性絕經后骨質疏松癥的臨床治療提供動物實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 8周齡SPF級健康雌性大鼠70只,體重180～220 g,購于西安交通大學醫學部實驗動物中心,動物許可證編號:SCXK(陜)2018-001。于商洛學院SPF級動物實驗室適應性喂養1周(溫度20～23 ℃,濕度50%～65%),自由飲水,自然光線晝夜交替。本實驗獲商洛學院實驗動物倫理委員會認證批準(商研論審函[2022]13號)。

1.2藥物、儀器與試劑 淫羊藿苷,成都新成醫藥科技有限公司,批號:110737-200715,純度>98%;青霉素,西安利君制藥有限責任公司,批號:B20190814,規格:80萬IU;17β-雌二醇,上海麥克林科技有限公司,批號:J20200316。倒置顯微鏡(Leica,美國);二氧化碳恒溫培養箱(Thermo,美國),流式細胞儀(BD,美國);全自動酶標儀(南京普朗醫療設備有限公司);紫外可見分光光度計(西安光華玻璃儀器廠);TD-25 電子分析天平(天津志誠儀器有限公司);微量移液器(上海求精玻璃儀器廠);DMEM培養基(武漢普諾賽生命科技有限公司);堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(批號:BC2162);大鼠骨鈣素(OCN)檢測試劑盒(批號:E30602)。其余儀器、試劑、分析純均由商洛學院醫學實驗中心提供。

1.3分組、造模及干預 適應性喂養7 d后,將70只大鼠隨機分為正常組、假手術組、骨質疏松組、淫羊藿苷低濃度組、淫羊藿苷中濃度組、淫羊藿苷高濃度組、雌二醇組,每組10只。正常組不做任何造模實驗。其余組大鼠實驗前禁食過夜,參考文獻[9-10]相關造模方法,肌肉注射氯胺酮0.1 mL/100 g(藥物含量為100 g/2 mL)麻醉大鼠后,將大鼠俯臥位固定在自制的固定板上,局部備皮,碘伏消毒,從腹背部肋緣下1 cm與脊柱外側各2.0 cm交界處切開皮膚進入腹腔,游離脂肪層,用絲線結扎雙側卵巢根部下的輸卵管并摘除卵巢(假手術組只行切口切開,不摘除卵巢組織),逐層縫合關閉創口,碘伏消毒。術后肌肉注射80萬IU青霉素,劑量為0.1 mL/(只·d),連續6 d,每天定期碘伏消毒雙側切口,逐層縫合組織。術后經陰道上皮角化細胞瑞氏染色法比較確定建模成功后,假手術組和骨質疏松組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃,淫羊藿苷低、中、高濃度組分別給予含淫羊藿苷0.4 g/100 mL、0.8 g/100 mL、1.2 g/100 mL的生理鹽水混懸液灌胃,雌二醇組給予含17β-雌二醇0.8 g/mL的生理鹽水混懸液灌胃,均1次/d,每天固定9:00—11:00灌胃,連續灌胃12周。

1.4BMSCs的培養及純化 采用頸椎脫臼法處死SD大鼠,置于75%乙醇中消毒10 min,無菌條件下取股骨、脛骨及肱骨,切除兩端干骺端,PBS清洗3次,暴露出骨髓腔,直至骨髓被全部沖出,用含雙抗的DMEM培養基反復吹打,制成單細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,重懸后接種于培養瓶中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中。首次24 h后更換培養基,隔天觀察細胞狀態,以后每48 h更換培養基1次。采用全骨髓貼壁法[11-12]分離培養BMSCs,待原代細胞貼壁生長鋪滿瓶底,生長密度達90%左右時,觀察取狀態良好的細胞,按1∶2比例進行首次傳代培養進行純化,獲得第1代骨BMSCs,同樣方法獲得第2代、第3代BMSCs。

1.5BMSCs成骨誘導的細胞形態觀察及表面標志物鑒定 用倒置顯微鏡觀察第1代、第2代、第3代細胞的形態。選定第3代細胞,將細胞濃度調整為1×106/mL,分別加入anti-rat CD29、anti-rat CD11、anti-rat CD44、anti-rat CD45、anti-rat CD90以及anti-rat CD34,送商洛市國際醫學中心,流式細胞術檢測細胞表面抗原,每份樣本分析1×104個細胞,用軟件Flow Jo Ver.10計算陽性細胞百分比。鑒定后,留用第3代細胞,加入成骨分化誘導液(DMEM高糖培養基),每3 d更換1次誘導液,連續培養7 d后進行后續相關實驗。

1.6BMSCs生長曲線繪制 取生長良好的第3代細胞,用胰蛋白酶消化細胞后重懸于α-MEM培養液中制成細胞懸液,吹打均勻后進行計數。根據細胞計數的結果,取7個6孔板,每組細胞3個復孔,每孔細胞以3×104/mL的密度接種,加2 mL培養液。于1～7 d固定時間點取3孔,用2.5 g/L胰蛋白酶消化,終止消化后,1 000 r/min離心5 min,并重懸于培養液中,每孔分別計數,取平均值。根據細胞計數的結果,以時間為橫軸、以細胞數為縱軸繪制生長曲線。

1.7BMSCs相關成骨標志物檢測 取培養7 d后的第3代細胞,用含2%牛血清白蛋白的PBS于4 ℃封閉30 min,將細胞濃度調整為 1×106/mL(100 μL細胞懸液),4 ℃、2 000 r/min離心20 min,參照相關試劑盒說明書,用比色法在波長540 nm檢測堿性磷酸酶 (ALP)活性和骨鈣素(OCN)水平。

1.8BMSCs中Runx-2蛋白表達量測定 采用Western blot法檢測:取培養7 d后的第3代細胞,提取各組細胞總蛋白,進行定量分析。經電泳分離,轉膜,5%脫脂奶粉室溫孵育2 h后,加入一抗工作液,置4 ℃過夜;TBS-T緩沖液洗膜5次,每次10 min,加入二抗工作液室溫孵育1 h,TBS-T洗膜5次,每次10 min,采用ECL法顯色。利用凝膠成像系統拍照并分析。

1.9BMSCs成骨誘導后礦化鈣結節形成情況 取培養7 d后的第3代細胞,棄去DMEM培養基,用PBS清洗3次,以40 g/L甲醛固定10 min,加0.1%茜素紅染液,37 ℃孵育1 h,常溫避光染色30 min,吸除染料,PBS再次沖洗3次,自來水沖洗并常溫干燥后,于顯微鏡下觀察礦化結節的形成情況。加入10%氯化十六烷基吡啶洗脫結合到鈣結節上的染料,使用酶標儀在波長540 nm處測定吸光度值。

1.10統計學方法 應用SPSS 18.0軟件對實驗數據進行統計分析,計量資料呈正態分布,組間差異比較采用單因素方差分析法(One Way ANOVA),兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1BMSCs形態 倒置顯微鏡下觀察,培養2 d(第1代)可見少量透亮的多形性細胞,細胞核成長橢圓形,貼壁較少,凌亂生長;培養4 d(第2代)可見細胞拉長,梭形細胞增多,也可見不規則形細胞,貼壁生長較前明顯,細胞核變成卵圓形,聚集呈放射狀排列;培養7 d(第3代)可見大量長梭形細胞,少部分三角形或不規則形細胞緊密排列,細胞核為規則卵圓形,呈瀑布狀或者漩渦狀生長,可見細胞結節。見圖1。

圖1 第1代、第2代、第3代大鼠骨髓間充質干細胞形態(×100)

2.2BMSCs培養及抗體分子鑒定 流式細胞儀檢測第3代BMSCs細胞表面抗原,其中CD90陽性率為98.2%,CD44陽性率為93.3%,CD29陽性率為99.5%,CD34陽性率為2.6%,CD45 陽性率為1.7%,CD11陽性率為4.4%,前3個指標為陽性,后3個指標為陰性,可與造血干細胞相鑒別。見圖2。

圖2 培養第3代大鼠骨髓間充質干細胞鑒定結果

2.3各組大鼠BMSCs生長曲線 各組大鼠BMSCs在增長期都呈S形生長,1～3 d處于潛伏期,3～7 d為快速生長期,第6天到達最高峰;隨后逐漸進入平臺期。見圖3。

圖3 正常組、假手術組和骨質疏松各組大鼠骨髓間充質干細胞生長曲線

2.4各組大鼠BMSCs成骨誘導后ALP活性和OCN水平比較 正常組與假手術組ALP活性和OCN水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05);骨質疏松組ALP活性和OCN水平均明顯低于假手術組(P均<0.05);淫羊藿苷中、高濃度組和雌二醇組ALP活性和OCN水平均明顯高于骨質疏松組(P均<0.05);淫羊藿苷中濃度組ALP活性和淫羊藿苷高濃度組OCN水平與雌二醇組最為接近,差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 正常組、假手術組和骨質疏松各組大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導后ALP活性和OCN水平

2.5各組大鼠BMSCs成骨誘導后Runx-2蛋白表達情況比較 正常組與假手術組Runx-2蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05);骨質疏松組Runx-2蛋白相對表達量明顯低于假手術組(P<0.05);淫羊藿苷中、高濃度組和雌二醇組Runx-2蛋白相對表達量均明顯高于骨質疏松組(P均<0.05);淫羊藿苷中、高濃度組Runx-2蛋白相對表達量和雌二醇組比較差異均無統計學意義(P均>0.05),淫羊藿苷中濃度組與雌二醇組最為接近。見圖5。

圖5 正常組、假手術組和骨質疏松各組大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導后Runx-2蛋白表達情況

2.6各組大鼠BMSCs成骨誘導后礦化鈣結節形成情況及吸光度值比較 正常組和假手術組有鈣化結節,較為均勻;骨質疏松組沒有明顯的鈣化結節,吸光度值明顯低于正常組和假手術組(P均<0.05);淫羊藿苷各濃度組與雌二醇組出現明顯的鈣化結節染色,吸光度值均明顯高于骨質疏松組(P均<0.05),其中淫羊藿苷中濃度組鈣化結節數量最多,但各藥物組間吸光度值比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖6和圖7。

圖6 正常組、假手術組和骨質疏松各組大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導后鈣結節形成情況(茜素紅染色,標尺為20 μm)

圖7 正常組、假手術組和骨質疏松各組大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導后鈣結節形成吸光度值(540 nm)

3 討 論

骨質疏松癥是中老年人最常見的骨代謝性疾病,近年來其發病率呈逐年上升趨勢。現代醫學認為,骨組織處于骨形成和骨吸收的動態平衡之中,而絕經后婦女由于雌激素水平的驟然下降,導致該平衡不能維持是引起絕經后骨質疏松癥發生的主要原因[13]。大量臨床研究顯示,外源性雌激素能通過多途徑促進骨形成,可明顯減輕婦女絕經期的癥狀和預防骨質疏松癥的發生,但同時也指出雌激素的使用會增加子宮內膜癌、乳腺癌、高血凝狀態以及靜脈血栓栓塞等發病風險[14-15]。近年來,隨著中藥藥理學研究的深入和提取分離技術的進步,醫學界尋找雌激素天然替代物治療骨質疏松癥成為了一種熱點。淫羊藿提取物淫羊藿苷具有良好的植物雌激素樣作用,實驗證實其可促進BMSCs的成骨性分化和抑制破骨細胞的骨吸收活性[16-17]。

BMSCs是來源于中胚層,具有多向分化潛能的干細胞,合適的條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等,其是雌激素缺乏性骨質疏松骨修復的主要來源[18]。本研究采用經典去卵巢法建立大鼠骨質疏松模型模擬絕經后骨質疏松癥,取BMSCs體外培養,發現去卵巢骨質疏松大鼠的BMSCs生長緩慢;淫羊藿苷不同濃度組中,中濃度淫羊藿苷促BMSCs增殖作用最強。

細胞ALP的活性和礦化結節形成是成骨細胞早期和中期成骨細胞分化的標志,也是BMSCs成骨分化的重要指征[19]。OCN由成骨細胞和軟骨細胞合成,控制著軟骨礦化的速度,在一定程度上可反映骨轉化和礦化結節的形成[19]。Runx-2蛋白表達是成骨細胞分化過程中起決定作用的轉錄因子,影響著間充質干細胞等干細胞的成骨向分化[20]。本實驗結果顯示,去卵巢骨質疏松大鼠BMSCs細胞的ALP活性、OCN水平、Runx-2蛋白相對表達量均明顯降低,礦化結節形成較少;淫羊藿苷中、高濃度組ALP活性、OCN水平、Runx-2蛋白相對表達量均明顯高于骨質疏松組,且出現明顯的鈣化結節;其中淫羊藿苷中濃度組ALP活性、Runx-2蛋白相對表達量和淫羊藿苷高濃度組OCN水平更高,淫羊藿苷中濃度組鈣化結節數量更多。說明中、高濃度的淫羊藿苷均可以通過調控Runx-2蛋白表達,促進BMSCs的成骨分化,促進骨生長,而且中濃度淫羊藿苷誘導 BMSCs成骨和上調Runx-2蛋白表達能力最強。本實驗中ALP活性、OCN水平、Runx-2蛋白表達情況與文獻[21-23]研究結果一致。

綜上所述,淫羊藿苷可通過上調ALP活性、OCN水平及Runx-2蛋白表達,促進骨礦化鈣化結節的生成,其中0.8 g/100 mL淫羊藿苷上調ALP活性以及Runx-2蛋白表達作用最明顯,而調節OCN水平和鈣化結節生成的作用與淫羊藿苷的濃度有依賴性關系,濃度越高作用越好。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。