Ag-HA涂層種植體對牙周炎大鼠牙周炎癥及種植體骨結合能力的影響

馬 蘭,楊 磊,丹 丹,賈 慧,來衛東

(邯鄲市口腔醫院,河北 邯鄲 056001)

牙周炎是微生物相關導致牙周附著喪失的炎癥,已經成為成人牙列缺損、牙列缺失的主要病因,其對機體的損傷不僅限于口腔,細菌可通過血運循環進入全身,是許多全身系統性疾病的危險因素[1-2]。口腔種植修復技術逐漸成為恢復口腔美觀、功能的首選方式,遠期預后良好[3]。但牙周炎患者自身存在牙周致病菌,口腔固有菌群失調、術中致病菌清理困難、常規種植體表面處理無抗菌性能,使常規種植的種植體周圍炎發生率較高,故改進種植體材料成為重點研究方向[4]。此外,種植體成功修復的前提為良好骨礦化及骨結合能力,種植體材料則是影響其能力的重要因素[5]。種植體表面的羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)涂層與哺乳動物牙齒無機質成分相同,結構相似,生物活性、相容性較好,但HA易吸附蛋白質、氨基酸及其他有機質,給細菌提供營養,利于細菌生長繁殖[6]。為增加HA抗菌性,常將其與不同具有抑制性的金屬結合,其中Ag+具有微動效應,對種植體周圍炎中革蘭陰性細菌有較強殺菌作用[7],因此將Ag+與HA混合形成新骨結合材料Ag-HA,無論是在富營養還是貧營養環境都表現出抗菌性能,可加強細胞附著,促進成骨性能[8-9]。本研究觀察了Ag-HA涂層種植體對牙周炎大鼠牙周炎癥及種植體骨結合能力的影響,旨在為Ag-HA涂層種植體的臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 40只牙周健康清潔雄性大鼠,確認大鼠無真菌感染、系統性疾病,5～8周齡,體重225～255 g,由河北醫科大學(實驗動物公共服務平臺)提供,合格證號:SYXK(冀)2020-002。大鼠于層流架內由專人負責管理分籠飼養,飼養環境定期消毒,環境溫度22～25 ℃,相對濕度40%～60%,飼養墊以干凈的木屑為主,自來水、普通飼料喂養,自由飲食、飲水,適應性喂養1周后開始實驗。本實驗經邯鄲市口腔醫院倫理委員會批準(IRM-DWLL-2019036)。

1.2Ag-HA涂層制備方法 將97%的HA粉末(瑞士Sulzer Metco,粉末粒徑15～50 μm)和3%Ag粉混合2 h,使用瑞士Sulzer Metco真空等離子噴涂設備在30 mm×30 mm×2 mm鈦合金基材上制備HA涂層和載Ag抗菌劑的Ag-HA涂層,噴涂參數設置:等離子氣體Ar 40 L/min,等離子氣體H210 L/min,噴涂距離300 mm,涂層厚度200 μm,真空室氣壓100 Pa,送粉載氣Ar 2.0 L/min,送粉率20 g/min,電流650 A,電壓60 V。根據 ASTM C-633標準,HA和Ag-HA涂層結合強度分別為20.1 MPa、23.4 MPa。Ag-HA涂層由HA、磷酸三鈣、氧化鈣、Ag+組成,磷酸三鈣、氧化鈣由HA噴涂中分解而得。電解液中Ag+濃度0.5 mmol/L,溶液溫度40 ℃,pH 4.0,脈沖電位-2 V,沉積時間2 h,熱處理溫度700 ℃,利用CHl660D電化學工作站,肽片為工作電極、鉑盒板為對電極、飽和汞電極為參比電極進行電化學沉積,用燒杯取電解液100 mL,將其置于恒溫加熱磁力攪拌器中,溫度設置40 ℃,初始電位為3次開路電位測量均值,高電位0.30 V、低電位-2 V,階躍72 次,脈沖寬度100 s,間隔1 s采樣,靜置0.5 s,完成電沉積,將制得樣品放入馬弗爐高溫處理,升溫速率5 ℃/min,然后進行熱處理、保溫得出沉淀物,將沉淀物用去離子水5 L洗滌,放入高溫箱干燥,溫度設置為70 ℃,得到的晶體首先進行馬爾文粒度測試及其他性能測試,從而檢測獲得材料的小大、含Ag量及HA合成情況,使用瑪瑙研磨器研磨,得到Ag-HA顆粒。

1.3實驗方法 40只大鼠采用絲線結扎和10%的高糖水飼養方法建立牙周炎模型:采用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,將其仰臥位固定后撐開上下切牙,暴露上頜第一磨牙和第二磨牙間隙,擴大間隙后用0.2 mm正畸結扎絲于大鼠第一磨牙穿入腭側遠中鄰間隙,頰側穿出,結扎絲位于齦溝,防止脫落,再用10%的高糖水和黏性飲食飼養,每日更換新鮮食物、水,每3 d檢查1次結扎絲有無脫落,發現脫落重新結扎。結扎飼養8周后隨機抽取3只大鼠,內眥靜脈采血,采用ELISA法檢測炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)]水平,然后麻醉大鼠,使用牙周探針重復測量3次齦溝出血指數、牙齦指數、探診深度,均由一人統一完成測量,再根據牙齦炎癥、牙槽骨破壞情況確定牙周炎是否造模成功。確認造模成功后,去除結扎絲,恢復正常飲食,然后將大鼠隨機分為牙周炎組5只、Ag-HA涂層組18只和HA涂層組17只。牙周炎組大鼠不給予任何干預;其余2組大鼠禁食、禁飲12 h后,肌內注射1.5 mL速眠新,10 min后再將30 g/L的戊巴比妥鈉按1 mL/kg肌肉注射,麻醉成功后消毒固定大鼠,Ag-HA涂層組植入Ag-HA涂層種植體,HA涂層組植入HA涂層種植體,縫合創口,術后肌肉注射頭孢唑啉鈉預防感染。

1.4檢測指標及方法

1.4.1牙周指標 分別于術前及術后1周、2周、4周、8周對各組大鼠進行牙周檢查,記錄齦溝出血指數、牙齦指數、探診深度。齦溝出血指數測量分級:0為牙齦健康,無炎癥、出血;1為牙齦有炎癥改變,探診不出血;2為探診后出現點狀出血;3為探診后出血呈線狀;4為出血溢滿、溢出齦溝;5為自動出血。牙齦指數測量分級:0為牙齦正常;1為炎癥輕,牙齦顏色輕度改變、水腫;2為炎癥中度,牙齦顏色紅、水腫,探診出血;3為炎癥重,牙齦顏色紅腫或有潰瘍形成,有自發性出血傾向。記錄頰側近中、中央、遠中,舌側近中、中央、遠中共6個部位牙周探診深度,正常牙齦齦溝深度不超過3 mm。

1.4.2血清炎癥因子水平 分別于術前及術后1周、2周、4周、8周內眥靜脈采血,3 000 r/min離心10 min獲取血清,采用大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒(上海初態生物科技有限公司)檢測相應指標水平。

1.4.3骨結合能力 根據血清堿性磷酸酶(ALP)水平和種植體-骨結合率評估骨結合能力。分別于術后1周、2周、4周、8周內眥靜脈采血和處死動物(術后1周、2周、4周時間點Ag-HA涂層組、HA涂層組各4只,牙周炎組1只,術后8周Ag-HA涂層組、HA涂層組各5只,牙周炎組2只),采用大鼠ALP ELISA試劑盒(上海初態生物科技有限公司)檢測3組大鼠血清ALP水平。Ag-HA涂層組、HA涂層組取大鼠種植體及其周圍3 mm范圍內骨組織,牙周炎組取牙周炎周圍3 mm范圍內的骨組織,采用美國西門子Inveon MM CT系統行顯微CT掃描,進行三維重建、骨形態計量,種植體周圍1 mm的區域設為感興趣區域,將掃描完成的組織塊用德國E300CP EXAKT硬組織切片機、德國E400CS艾卡特硬組織磨片機及其配套平行粘合壓片裝置制作硬組織切片,厚度30 μm,每個標本取2張切片進行亞甲基藍-酸性品紅染色,用Image-ProPlus 6.0 專業圖像處理軟件計算種植體-骨結合率。

2 結 果

2.1各組大鼠牙周指數比較 研究期間Ag-HA涂層組大鼠因麻醉意外死亡1只。Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術后1周、2周、4周、8周的齦溝出血指數、牙齦指數、探診深度均明顯低于同組術前及同期牙周炎組(P均<0.05),且Ag-HA涂層組術后1周、2周、4周的探診深度均明顯低于同期HA涂層組(P均<0.05)。見表1。

表1 牙周炎各組大鼠術前及術后不同時間牙周指標比較

2.2各組大鼠血清炎癥因子水平比較 Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術后4周、8周的血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明顯低于同組術前及同期牙周炎組(P均<0.05),且Ag-HA涂層組術后4周、8周的血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明顯低于同期HA涂層組(P均<0.05);3組大鼠術前及術后1周、2周的血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 牙周炎各組大鼠術前及術后不同時間血清炎癥因子水平比較

2.3各組大鼠骨結合能力比較 Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術后1周、2周、4周、8周的血清ALP水平均明顯高于同期牙周炎組(P均<0.05);Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術后1周、2周的血清ALP水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05),Ag-HA涂層組大鼠術后4周、8周的血清ALP水平和術后2周、4周、8周的種植體-骨結合率均明顯高于同期HA涂層組(P均<0.05)。見表3。

表3 牙周炎各組大鼠術后不同時間骨結合能力比較

3 討 論

牙周炎是導致成年人牙齒缺失的主要原因,種植牙與正常牙結構相似,咀嚼效率高、舒適美觀,因此種植修復成為牙缺失治療最常用的手段[10-11],但存在種植修復后易感染問題。種植體與骨間無牙周膜保護,一旦發生感染,炎癥會迅速進展,種植體和周圍骨結合被破壞,影響新骨形成,導致種植修復失敗[12]。傳統抗生素治療對細菌生物被膜引起的感染效果欠佳,但種植體抗菌涂層的出現賦予了種植體抗菌性能,為牙周炎患者種植修復術后感染提供了新思路。

隨著國內口腔種植技術的廣泛開展,各種植體廣泛應用于臨床,種植體周圍炎的發生率也在不斷提高[13-14]。HA是高溫熔融霧化后高速噴射在種植體表面而形成的涂層,因其具有良好的生物相容性、生物安全性而成為最經典的種植體涂層,能增加種植體與骨組織接觸的表面積,增強了生物-金屬間的結合能力,因此術后前期穩定性較好,但HA涂層種植體的高純度結晶涂層會被逐漸吸收,之后骨組織直接與種植體接觸[15]。Ag+具有抑菌作用,它可直接與細菌接觸,可抑制、殺滅細菌[16]。本研究比較了HA涂層種植體和Ag-HA涂層種植體修復對牙周指標的影響,結果顯示2組大鼠術后1周、2周、4周、8周的齦溝出血指數、牙齦指數、探診深度均降低,且Ag-HA涂層組大鼠術后1周、2周、4周的探診深度低于HA涂層組,提示Ag-HA涂層種植體在改善牙周炎大鼠探診深度方面更有優勢,同時提示探診深度的改變與齦溝出血指數、牙齦指數關系不大。炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β可通過旁分泌、自分泌形式調節免疫細胞,增強破骨細胞活性,參與種植體周圍炎的發生發展[17-18]。生物材料引發感染中有45%是細菌黏附在材料表面破壞材料結構造成的。HA用于種植體表面涂層,因其抑菌效果不佳,故常在材料中加入抗生素,但抗生素易被體液迅速沖洗,不能長期保護材料,另外微生物在抗生素長期作用下可產生耐藥性[19]。Ag+在低濃度范圍即可對致病菌表現出較強抗菌活性[20],其從Ag-HA涂層種植體表面緩慢釋出,通過靜電力吸附于帶負電的細菌細胞壁,與細胞壁發生肽聚糖反應,破壞細菌固有成分;Ag+穿透細胞壁,導致其破裂,細胞質外流,可導致細菌死亡;Ag+還能破壞DNA復制,其與DNA相結合,置換DNA分子雙螺旋結構中的氫,導致細菌DNA分子結構變形,使細菌失活[21-22]。本研究結果顯示,Ag-HA涂層組大鼠術后2周、4周血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯低于術前及同期HA涂層組,提示Ag-HA涂層種植體有助于減輕牙周炎大鼠術后炎癥反應,利于種植體存活和種植成功。

種植體涂層可通過改變種植體表面微觀形態、化學形成,在種植體-骨結合過程中起作用[23]。骨結合概念于1969年由Branemark教授提出,當時需取出種植體和部分軟硬組織才可觀察骨結合情況,切片技術的發明使得骨結合理論得到證實[24]。種植體表面粗化可增加表面張力,獲得更大骨結合面積,促進成骨細胞吸附、分化、擴增,可增加種植體-骨結合能力,促進成骨細胞ALP表達[25]。ALP在骨礦化中起重要作用,是成骨細胞表型的可靠標志,其活性可反映成纖維細胞轉化為成骨細胞的趨勢。黃正非等[26]研究顯示,氧化鋯涂層鈦種植體植入組兔的骨-種植體結合率較純鈦種植體植入組高,涂層后種植體表面粗糙度增加,粗糙度大利于成骨細胞礦化,促進種植體-骨結合形成。本研究結果顯示,Ag-HA涂層組大鼠術后4周、8周的血清ALP水平和術后2周、4周、8周的種植體-骨結合率均明顯高于同期HA涂層組,提示Ag-HA涂層種植體中Ag+可改變材料表面粗糙度,使得種植體-骨結合能力更好。

綜上所述,Ag-HA涂層種植體有助于改善牙周炎大鼠牙周指標,減輕炎癥反應,提高大鼠種植體骨結合能力。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。