大柴胡湯對結石性膽囊炎豚鼠膽囊動力的影響及其機制

馬亦湘,周春宇,楊成城,張少輝,張 濤,錢嘉惠,王馨悅,郭彥每,安佳琳

(1.北京中醫藥大學,北京 100029;2.北京中醫藥大學東方醫院,北京 100078)

結石性膽囊炎是由膽囊結石引起的膽囊急慢性炎癥,常因肥胖、飲食、情緒等因素導致反復發作,臨床上常表現為反復發作的右上腹疼痛不適,嚴重影響患者的生活質量[1]。現代研究認為,結石性膽囊炎的主要病理機制為膽囊結石導致膽囊管阻塞、擴張、水腫,膽汁淤積引起膽汁酸代謝途徑障礙,膽固醇清除能力下降,引起炎癥因子趨化,膽囊動力降低,膽囊炎性細胞浸潤,進一步加重炎癥反應[2-3]。中醫將結石性膽囊炎歸為“膽脹”“脅痛”“黃疸”范疇[4-5],多運用大柴胡湯疏肝理氣、利膽消石。本實驗旨在通過高脂飼料誘導建立結石性膽囊炎豚鼠模型,觀察大柴胡湯對豚鼠血清炎癥因子水平及膽囊動力的影響,探討該方治療結石性膽囊炎的作用機制,以期為臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 普通級健康成年雌性豚鼠40只,體重(300±40)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物合格證號:SCXK(京)2016-0011。動物飼養于斯貝福(北京)生物技術有限公司動物實驗室(SPF級),室溫條件(22±2)℃,相對濕度保持在50%～60%,光照保持正常晝夜節律,分籠飼養。本實驗通過斯貝福(北京)生物技術有限公司動物倫理審批(20200524-01)。

1.2藥物 消炎利膽片(廣東萬年青制藥有限公司生產,國藥準字Z44023159);大柴胡湯復方顆粒制劑(由柴胡15 g、大黃6 g、枳實12 g、黃芩9 g、姜半夏8 g、白芍12 g、生姜12 g、大棗12 g組成,北京醫珍堂中醫診所有限公司生產),按70 kg成年人日有效劑量為89 g(1 271 mg/kg),參考《中藥藥理實驗方法學》[6]中人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值,豚鼠灌胃劑量=人的每日劑量(1 271 mg/kg)×70 kg×0.031/400 g=6.9 g/kg,故400 g豚鼠的用藥劑量為2.8 g/d,按照2 mL/g的標準稀釋顆粒制劑,豚鼠的灌胃劑量為5.6 mL/d。

1.3試劑及致石飼料 通用型4%組織固定液、蘇木素染液、豚鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA檢測試劑盒、豚鼠白細胞介素-1β(IL-1β) ELISA檢測試劑盒、豚鼠膽囊收縮素(CCK) ELISA檢測試劑盒、豚鼠小窩蛋白-3(Cav-3) ELISA檢測試劑盒、切片石蠟,購自北京泰科美生物科技有限公司。綜合參考文獻[7-9]的造模方法,選取含1%酪蛋白、1.5%蔗糖、1%豬油、0.02%膽酸、0.05%膽固醇與普通飼料混合的致石飼料,購自北京歐北實驗科技有限公司。

1.4實驗方法 將40只豚鼠按照隨機數字法分為正常組、模型組、消炎利膽片組、大柴胡湯組,每組10只。模型組、消炎利膽片組和大柴胡湯組豚鼠普通飼料適應性飼養7 d后,連續喂以高膽固醇致石飼料4周建立結石性膽囊炎模型。造模成功后,參考文獻[10]方法,消炎利膽片組給予消炎利膽片0.25 g/kg灌胃,大柴胡湯組給予大柴胡湯2.8 g/d灌胃,正常組和模型組給予生理鹽水灌胃,灌胃量均為5.6 mL/d,1次/d,連續灌胃4周,各組喂養的飼料與灌胃前相同。

1.5檢測指標與方法

1.5.1豚鼠一般情況 造模成功后觀察各組大鼠的精神狀態、皮毛的光澤度、進食量、排便量、大便形態,分別在造模后的第1天、第7天、第14天、第21天、第28天測量每只大鼠的體重,計算體重變化率(體重變化率=本次測量體重/上次測量體重×100%)。

1.5.2血清學指標 末次灌胃后禁食12 h,稱重,用10%水合氯醛0.2～0.3 g/kg麻醉豚鼠,打開腹腔,取腹主動脈血5 mL,在室溫下靜置2 h,4 ℃下3 000 r/min離心10 min,分離得到上層血清,按照ELISA檢測試劑盒說明測定TNF-α、IL-1β、CCK、Cav-3水平。

1.5.3膽汁量 腹主動脈取血后,結扎膽囊管,行膽總管插管,收集膽汁共2 h,測量膽汁量。

1.5.4膽囊肌條收縮活性 收集膽汁后,完整切除豚鼠膽囊,于膽囊頸部離斷。每枚膽囊沿縱軸制備長1 cm、寬5 mm肌條3條,連于張力換能器,1.0 g前負荷下沒于(37±0.5)℃ Krebs液,待出現自發節律性收縮并穩定15 min后,記錄機械收縮信號(膽囊收縮頻率、膽囊收縮振幅)。

1.6統計學方法 所有獲取的實驗相關數據均使用SPSS 20統計軟件分析。符合正態分布的數據采用One-Way ANOVA方法進行組間比較,多重比較采用LSD法;不符合正態分布的數據采用非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組豚鼠一般情況比較 豚鼠在造模后出現行動遲緩,皮毛暗淡易脫,弓背,扎堆,尿液色黃,大便稀溏;消炎利膽片組和大柴胡湯組豚鼠藥物干預后排便排尿情況、日常活動、皮毛光澤度及精神情況均較模型組明顯改善,體重明顯增長,但未恢復到正常水平。造模后第7,14,21天,模型組豚鼠的體重增長率均明顯低于正常組(P均<0.05),消炎利膽片組和大柴胡湯組豚鼠造模后第7天和大柴胡湯組豚鼠造模后第21天的體重增長率均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和結石性膽囊炎各組豚鼠各時間點體重變化率比較 %

2.2各組豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較 模型組豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明顯高于正常組(P均<0.05)。消炎利膽片組和大柴胡湯組豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明顯低于模型組(P均<0.05),但大柴胡湯組豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明顯高于消炎利膽片組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 正常組和結石性膽囊炎各組豚鼠血清IL-1β、TNF-α水平

2.3各組豚鼠血清CCK、Cav-3水平比較 與正常組比較,模型組豚鼠血清CCK水平明顯降低,血清Cav-3水平明顯升高,差異均有統計學意義(P均<0.05);與模型組比較,消炎利膽片組和大柴胡湯組豚鼠血清CCK水平均明顯升高,血清Cav-3水平均明顯降低,差異均有統計學意義(P均<0.05);與消炎利膽片組比較,大柴胡湯組豚鼠血清CCK水平更高,血清Cav-3水平更低,差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和結石性膽囊炎各組豚鼠血清CCK、Cav-3水平

2.4各組豚鼠膽汁量比較 模型組豚鼠的膽汁量明顯少于正常組(P<0.05);消炎利膽片組和大柴胡湯組豚鼠的膽汁量均明顯多于模型組(P均<0.05),且大柴胡湯組豚鼠的膽汁量明顯多于消炎利膽片組(P<0.05)。見圖3。

圖3正常組和結石性膽囊炎各組豚鼠膽汁量

2.5各組豚鼠膽囊肌條收縮活性比較 與正常組比較,模型組豚鼠的膽囊收縮頻率明顯減慢(P<0.05),膽囊收縮振幅無明顯變化(P>0.05);與模型組比較,消炎利膽片組和大柴胡湯組豚鼠的膽囊收縮頻率均明顯增快(P均<0.05),膽囊收縮振幅均無明顯變化(P均>0.05);與消炎利膽片組比較,大柴胡湯組豚鼠的膽囊收縮頻率更快(P<0.05),收縮振幅無明顯變化(P>0.05)。見圖4。

圖4 正常組和結石性膽囊炎各組豚鼠膽囊肌條收縮活性

3 討 論

中醫認為結石性膽囊炎病位在肝膽,其病機多為飲食不節、情志不暢、濕熱蘊結等導致肝膽疏泄不利,肝調達受阻,膽升發不暢[11],膽內精汁不能排出,聚集成石,阻滯膽道,不通則痛,發為膽脹、協痛[12-13]。結石阻遏膽道,膽液不循常道,發為黃疸。本著治病求本的中醫思想,臨床多運用大柴胡湯治療。大柴胡湯是仲景《傷寒雜病論》和解少陽、內瀉熱結的代表方,方中君以柴胡解熱疏肝,除少陽之邪氣,臣以黃芩和解清熱,柴胡、黃芩合用得以疏肝解郁、清熱利濕;大黃逐瘀瀉熱,芍藥柔肝緩急止痛,與枳實配伍可理氣和血,使疏肝而不傷肝[14];半夏、生姜可調和脾胃,緩解惡心嘔吐;諸藥合用,共同發揮疏肝理氣、利膽消石之功。現代藥理學研究表明,柴胡中的柴胡皂苷a和d能夠通過抑制炎癥介質和內源性糖皮質激素的釋放發揮抗炎作用,且柴胡皂苷b2能夠通過干擾IKKβ和IκBα活化有效抑制脂多糖誘導的促炎介質的釋放,從而阻止NF-κB的激活[15];黃芩苷可通過阻斷NF-κB、TNF-α、IL-6等炎癥信號通路發揮抗炎作用[16];大黃中所含的大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素等蒽醌類化合物可雙靶點(NF-κB和iNOS)抑制脂多糖刺激巨噬細胞產生的炎癥反應[17];大柴胡湯中的槲皮素可以參與調控CCK的表達從而治療結石性膽囊炎[18]。

目前研究認為,結石性膽囊炎因膽囊黏膜層受到淤積膽汁中膽汁酸刺激和胃腸道細菌移位或者門靜脈菌血癥等因素影響而出現炎癥反應,引起炎性細胞浸潤和膽囊運動障礙等病理改變,其中TNF-α、IL-1β等炎性因子在結石性膽囊炎的發生發展中起了關鍵作用[19]。TNF-α能增強血管內皮細胞對白細胞的黏附作用,使白細胞聚集于炎癥反應部位[20];IL-1β可通過吸引中性粒細胞趨化浸潤、細胞因子合成、細胞內顆粒釋放等過程來推進和加劇急、慢性炎癥反應[21]。TNF-α、IL-1β的活化可以激活NF-κB信號通路,從而引發炎癥級聯效應,致使機體內炎性反應擴大并彌散蔓延[22]。本實驗結果顯示,大柴胡湯組豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯低于模型組,表明大柴胡湯可以降低結石性膽囊炎豚鼠血清TNF-α、IL-1β水平,調控炎癥反應,減輕膽囊炎癥。膽囊動力的變化與膽囊疾病密切相關。膽囊收縮運動功能異常,排空延遲,使得膽囊內過飽和膽固醇膽汁形成的膽固醇結晶不能被及時地排入腸道,聚集成石,這是膽石形成的動力學機制[23]。CCK為人體分泌的腦腸肽激素,能促進膽囊的收縮運動,促進膽汁排泄;當體內CCK水平降低時,膽囊運動受到抑制,膽汁排泄障礙,容易在膽囊內淤積形成膽囊結石[24]。Cav-3為膽囊平滑肌上的一種結構性蛋白質,可以抑制膽囊收縮素受體(CCK-AR)的表達,從而抑制膽囊運動,導致膽汁淤滯,促進膽固醇結晶析出、聚集,進而形成膽囊結石[25]。本實驗結果顯示,與模型組和消炎利膽片組比較,大柴胡湯組血清CCK水平明顯升高,血清Cav-3水平明顯降低,膽汁量和膽囊肌條的收縮頻率明顯增加,提示大柴胡湯可以促進結石性膽囊炎豚鼠膽囊收縮而發揮利膽功效,且其利膽功效明顯優于消炎利膽片,分析其促進膽囊收縮運動作用可能與調節血清CCK、Cav-3的表達相關。

綜上所述,炎癥因子誘導趨化、膽囊收縮運動障礙在結石性膽囊炎的發生過程中扮演了重要角色;大柴胡湯可通過下調血清TNF-α、IL-1β水平發揮抗炎作用,通過上調血清CCK水平、下調血清Cav-3水平發揮利膽作用,從而減輕炎癥反應,促進膽汁分泌和膽囊運動。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。