小麥黃矮病及其抗性育種研究進展

李朝陽, 張朝陽, 劉 艷, 孔令讓*

(1. 山東農業大學農學院，小麥育種全國重點實驗室，泰安 271000；2. 中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害綜合治理全國重點實驗室，北京 100193)

由介體蚜蟲傳播的大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf viruses, BYDVs) 是多種禾谷黃矮病毒的統稱,侵染小麥后引起的小麥黃矮病是世界小麥種植區的重要病害,其在20世紀50年代美國加利福尼亞州首次發現并報道,隨后北美洲、歐洲、大洋洲和亞洲等國家也陸續發現[1-3]。感病植株主要表現為葉片失綠、植株矮小、分蘗減少,嚴重時甚至不能結實。據報道,BYDVs發病率每增加1%,小麥產量損失為13～45 kg/hm2,在BYDVs流行年份可造成小麥減產20%～30%,嚴重時可達50%以上[4]。我國華北、東北及西北等冬小麥種植區域由于冬春季干旱少雨,十分有利于該病害的傳播。近年來,隨著全球氣候變暖,蚜蟲寄生性天敵的寄生率明顯降低,使得蚜蟲順利越冬、繁殖,BYDVs毒源保存的幾率大大增加[4]。此外,研究人員通過模擬自然寄主蚜蟲傳毒競爭試驗,發現BYDVs編碼的病毒沉默抑制子發生堿基突變可增強其在高溫環境中的穩定性與沉默抑制子活性,提高其適應氣候變暖的能力,從而導致病毒的持續流行和暴發[5]。因此,當前小麥黃矮病仍具有較大的潛在危害性,尤其在溫帶區域,黃矮病逐漸出現蔓延之勢[2]。深入了解并有效防治黃矮病對于我國乃至世界小麥產業的發展至關重要。

BYDVs通過介體蚜蟲以持久、循回、非增殖方式進行傳播[6]。目前防治黃矮病以化學藥物防治蚜蟲為主,但這種措施會帶來一系列環境與安全問題,通過發掘篩選抗黃矮病基因并選育抗病品種越來越受到人們的重視。

本文將從生物學、致病機理、抗性育種等方面對引起小麥黃矮病的BYDVs進行綜述,旨在為小麥黃矮病防治及抗性育種提供參考。

1 BYDVs的生物學特性及分類地位

1.1 BYDVs對小麥的危害

在田間,BYDVs可在全生育期內侵染小麥并引起根系發育不良、植株不同程度矮化[6];發病葉葉尖出現倒“V”字形黃化,呈現表面光滑似有蠟質層的金黃色,尤其以旗葉發病癥狀最為明顯,全株自上而下發病的病害特征是小麥黃矮病引起的葉片黃化與缺素缺水引起的葉片生理性黃化的主要區別[7]。有研究表明,BYDVs可以限制光合產物的運輸,導致植物韌皮部退化,葉片變色,矮化,分蘗數與穗粒數減少,根系生長和籽粒重量受到顯著影響[8]。小麥感染BYDVs后產量損失可達到5%～80%[2]。同時,感染BYDVs的時期越早,產量損失越大,如果在幼苗期感染BYDVs,平均產量損失將達到30%[9]。目前BYDVs已經成為全球谷物中最具經濟損害性的病毒,加深對BYDVs的了解對小麥生產與糧食安全具有重要意義。

1.2 BYDVs的傳播

蚜蟲是傳播BYDVs的唯一介體[10]。當蚜蟲刺吸帶毒植株的韌皮部時,BYDVs通過蚜蟲食管到達腸道(中腸和后腸),在腸受體蛋白介導的胞吞和胞吐作用下穿過上皮細胞進入血淋巴進行循回,并在血淋巴中與次級共生菌Rickettsia相互作用以保持自身結構與功能的穩定[11-12]。BYDVs隨后到達蚜蟲副唾液腺并穿過唾液腺基底膜進入唾液,并隨著蚜蟲取食繼續侵染其他健康的寄主植物。病毒在蚜蟲體內循回過程中不能自我復制,并且一種BYDVs只能夠特異性地穿過一種或少數幾種介體蚜蟲的基底膜,這也是傳播BYDVs的介體蚜蟲具有特異性的原因[11]。

當BYDVs通過蚜蟲口針進入寄主植物韌皮部后,在最初侵入的細胞內進行復制與組裝,并在運動蛋白的幫助下通過胞間連絲擴散到鄰近的細胞,隨植物韌皮部汁液進入維管組織,再擴散到其他組織中,完成對植物的系統性侵染。雖然BYDVs是一種系統侵染性病毒,但其在感病植株中的自我復制幾乎完全局限于韌皮部組織內[13]。

2012年,Ingwell等發現,蚜蟲獲得BYDVs后更趨向于取食其他未感病的植株,感染BYDVs的小麥植株也可以通過釋放某種揮發性物質吸引未攜帶BYDVs的介體蚜蟲前來取食,由此提出了介體操縱假說(vector manipulation hypothesis,VMH)[14]。Hu等研究發現,BYDVs通過誘導感病小麥釋放反式-2-己烯醛和癸醛來吸引未攜帶病毒的蚜蟲取食,以便自身的廣泛傳播[10]。隨后,越來越多的證據表明,病毒可以通過改變介體的行為促進自身的傳播。Guo等詳細闡明了病毒沉默抑制子對介體蚜蟲行為和植物抗性的調控作用,發現病毒侵染使得植物活性氧(ROS)信號增強,進而增加蚜蟲在不同植物上的轉移擴散頻率與刺吸頻率,從而有利于蚜蟲獲毒及病毒轉移擴散[15]。2021年,Shi等研究發現,當蚜蟲取食寄主植物時,體內初級共生菌Buchneraaphidicola的動態變化介導調節宿主植物體內揮發性物質的改變,使得蚜蟲更偏好取食健康寄主植物[16]。近期,Swayamjit等詳細綜述了寄主植物-病毒-介體之間相互關系的研究進展,指出在分子協同作用中,病毒或介體效應子可能已經進化到改變宿主植物,使雙方在相互作用中受益[17]。因此,在田間小麥生長過程中,由于介體蚜蟲的這種選擇偏好的差異使得BYDVs往往從一個發病中心快速擴散傳播,極大增強了病害控制的挑戰性。

1.3 BYDVs的分類

早期,Rochow等根據介體蚜蟲傳毒的特異性將美國紐約州的BYDVs劃分為PAV、MAV、RMV、RPV、SGV 共 5 個株系[18]。隨后,根據基因組序列結構的差異,MAV、PAV 以及SGV被劃分為亞組Ⅰ,仍被稱為大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf viruses, BYDVs),MAV與PAV在后續分類中被劃入黃癥病毒屬Luteovirus,而RMV與RPV被劃分為亞組Ⅱ,更名為禾谷黃矮病毒(cereal yellow dwarf viruses, CYDVs),后被歸入馬鈴薯卷葉病毒屬Polerovirus,這兩個屬隨后被劃入黃癥病毒科Luteoviridae[19]。2002年,國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)將CYDV-RPV與BYDV-PAV中的強毒株系RPV-Mex1與PAV-129分別調整為CYDV-RPS與BYDV-PAS[20]。2013年,ICTV將RMV(CYDV-RMV)更名為玉米黃矮病毒RMV(maize yellow dwarf virus-RMV, MYDV-RMV),仍屬于馬鈴薯卷葉病毒屬[21]。與此同時,Svanella-Dumas等發現了兩種新的大麥黃矮病毒,分別命名為BYDV-kerⅡ和 BYDV-kerⅢ,后被劃入黃癥病毒屬中[22]。隨著深度測序技術的發展,侵染麥類作物的新的黃矮病毒種類陸續被發現。如2016年在韓國發現侵染大麥的大麥病毒G(barley virus G,BVG)[23]以及在我國發現的通過玉米蚜Rhopalosiphummaidis傳播的玉米黃花葉病毒(maize yellow mosaic virus, MaYMV)(也被稱為MYDV-RMVⅡ)[24]。最新的報道表明MaYMV可侵染小麥[25]。新的技術也催生了新的分類方式。2021年,ICTV使用編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)的結構作為RNA病毒分類的基本單位,由此去除了黃癥病毒科,并把黃癥病毒屬與馬鈴薯卷葉病毒屬分別劃分到番茄叢矮病毒科Tombusviridae及南方菜豆一品紅花葉病毒科Solemoviridae[26]。

在我國,周廣和等首次鑒定出4個BYDVs株系,分別是GPV、GAV、PAV與RMV[27]。早些年間,BYDV-GAV一直被認為是我國發生最普遍的小麥黃矮病病原[28-29],但近期研究表明,BYDV-PAV逐漸取代BYDV-GAV成為我國最為流行的黃矮病病原[30-32]。2020年,Khine等對我國及捷克共和國的BYDV-PAV的遺傳多樣性進行了分析,發現我國的BYDV-PAV群體具有更多的核酸變異性和差異性,因此,BYDV-PAV-CN很可能是黃癥病毒屬的新種[33]。除上述病毒外,近年來我國學者又陸續發現與BYDVs相似的小麥黃葉相關病毒(wheat leaf yellowing-associated virus, WLYaV)和小麥黃矮病毒(wheat yellow dwarf virus, WYDV)等兩種侵染小麥的馬鈴薯卷葉病毒屬新種[34-35]。

如前文所述,隨著ICTV新報告的發布,BYDVs的很多名稱可能會有所改變,但為了方便描述,我們在這里仍使用BYDVs代指原黃癥病毒科的多種病毒,即黃癥病毒屬的BYDV-PAV、BYDV-PAS、BYDV-MAV、BYDV-kerⅡ和BYDV-ker Ⅲ,馬鈴薯卷葉病毒屬的CYDV-RPV、CYDV-RPS和MYDV-RMV,以及尚未正式歸屬的BYDV-GPV和BYDV-SGV[26,36]。被ICTV正式承認的BYDVs相關病毒分類及相應的傳毒介體蚜蟲種類如下表所示(表1)。

表1 BYDVs分類及優勢介體蚜蟲Table 1 Classification of BYDVs and dominant vector aphids

1.4 BYDVs的病害循環

在我國冬麥區、春麥區以及冬春麥混種區,BYDVs引起的小麥黃矮病的發生受到種植制度與麥蚜生活習性的影響。在冬麥區6月份左右,小麥成熟前,帶毒有翅麥蚜遷飛至諸如小畫眉草Eragrostisminor、野燕麥Avenafatua等越夏寄主上取食、繁殖并傳播BYDVs。在成功越夏后,隨著秋麥苗的生長,有翅帶毒麥蚜從越夏寄主遷飛回麥苗上取食并傳毒,BYDVs侵染麥苗后隨麥苗越冬,而麥蚜以若蟲、成蟲或卵的形式在土壤縫隙、小麥莖基部等處藏匿越冬。次年春季,隨著溫度回暖,麥蚜大量繁殖并以冬前感病小麥為發病中心將病毒傳播至整個麥田。一般情況下,小麥生育期內會出現返青拔節期及抽穗期兩個發病高峰。而在春麥區,麥蚜無法正常越冬,因此會轉移至利于越冬的冬麥區越冬,翌年再遷回春麥區傳播病毒。在冬、春麥混種區,有翅麥蚜從冬麥區回遷至春麥區越夏,待秋季冬麥區小麥出苗后遷飛至冬小麥上取食并傳播BYDVs[37]。

綜上所述,BYDVs是經由介體蚜蟲傳播,病原眾多,極具破壞力的病毒,該病毒在經由介體蚜蟲傳播至易感植株后會形成發病中心,并誘導感病植株釋放相關揮發物質從而促進自身的傳播。

2 BYDVs的致病機理

BYDVs為正義單鏈RNA,病毒粒子為球狀正二十面體(T=3),直徑25～30 nm,基因組全長5.7 kb,無3′端多聚腺苷酸Poly(A)尾巴和5′端帽子等特殊結構[38-39]。分屬于黃癥病毒屬與馬鈴薯卷葉病毒屬的BYDVs與CYDVs的基因組結構如圖1和圖2所示。這種高精簡的基因組結構是長期進化選擇的結果,既保障了遺傳信息的完整性又為表達調控提供了可能[4,26]。加強基因組結構與致病機理研究有助于通過生物育種選育優良抗病品種及實施靶標藥物的研制。

圖1 BYDVs基因組結構示意圖Fig.1 Diagram of the genome organization of BYDVs

圖2 CYDVs基因組結構示意圖Fig.2 Diagram of the genome organization of CYDVs

ORF1與ORF2分別編碼P1與P2蛋白,其被證實與BYDVs基因組的復制有關。P2蛋白包含RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)活性區域,然而,目前研究表明P2蛋白只能與P1蛋白形成融合蛋白發揮作用[40]。此外,值得注意的是,與BYDVs不同,CYDVs的5′端ORF0編碼一種病毒沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing, VSR),可以與宿主體內E3-泛素連接酶相互作用,使得植物免疫應答反應體系中的重要元件AGO1(argonaute protein 1)泛素化后通過自噬途徑降解,進而導致寄主體內RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)的形成受到抑制[41-44],即對寄主的抗病毒防御系統進行破壞,這可能是CYDVs具有更強致病力的原因[45-47]。

ORF3編碼分子量約20 kD的BYDVs外殼蛋白(coat protein, CP),ORF5編碼分子量約70 kD的外殼蛋白C端通讀區域(the readthrough protein, RTP),在相關蛋白酶剪切后形成截短的蛋白,與外殼蛋白融合形成CP-RTP。因此,CP是病毒粒子外殼的基本單位。眾多研究表明,在蚜蟲特異性傳播的過程中,完整的CP-RTP蛋白賦予了高度特異性的蚜蟲傳播特性,使用點突變對CP-RTP蛋白進行破壞后,病毒粒子雖然可以在蚜蟲血淋巴中循回,但卻無法穿過蚜蟲副唾液腺基底膜進入寄主植物[48-49]。此外,RTP的N端可以與蚜蟲體內的共生菌互作從而達到穩定病毒粒子的作用,并且可能在促進蚜蟲獲得病毒粒子方面發揮作用[50],RTP的C端則參與限制病毒在韌皮部的移動[51]。總之,完整的CP-RTP蛋白對維持寄主植物體內BYDVs形態結構穩定和BYDVs積累及擴散具有重要作用[26]。

ORF4編碼的P4蛋白約17 kD,是BYDVs運動蛋白(movement protein, MP),研究表明,MP在病毒特異性穿過細胞胞間連絲完成細胞間運動過程中發揮重要作用[52-53]。近期,研究者篩選鑒定出12個與GAV的P4蛋白相互作用的宿主蛋白,這些蛋白主要包括促進ROS產生的蛋白、控制光形態建成和應激反應的蛋白相關的轉錄因子[54]。ROS是植物針對病原體的非特異性防御機制,因此,P4可能是誘導多個宿主防御反應的關鍵效應子;與此同時,P4還有一個功能,即破壞植物有絲分裂,引起細胞分裂的延遲,從而導致植株矮化癥狀[54]。除此之外,對于缺乏P0蛋白的BYDVs,P4蛋白還具備VSR功能,可以充當病毒毒力因子[55]。近期,Jin等闡述了大麥可以通過磷酸化“誘降”病毒P4蛋白來增強抗病毒RNAi的新機制,并提出了可以通過降低與P4蛋白相關的核酸酶基因SDN1的表達來增強植物抗病毒能力[56],暗示P4蛋白作為BYDVs毒力因子在靶標藥物研制及轉基因抗性育種方面的巨大潛力。

ORF6編碼的P6蛋白是根據相關基因組的序列信息推測得到的,在BYDVs上特異性存在,然而時至今日還未在感病植株中檢測到P6蛋白的存在[26]。2012年,Liu等證明BYDV-GAV的P6蛋白具有VSR功能[57]。然而,2017年,Fusaro等發現BYDV-PAV與BYDV-PAS的P4蛋白具備更強的RNA沉默抑制的功能,這表明相較于P6,一些BYDVs的P4蛋白更有可能具有毒力因子的功能[55]。因此,ORF6編碼的P6蛋白的存在與相關功能仍然是一個謎,值得進一步探索。此外,與ORF6不同,通過生物信息學手段預測分析出的ORF3a編碼的P3a蛋白目前已經通過血清學方法在寄主植物及原生質體中檢測到,后通過研究證實,P3a協助P4蛋白促進細胞內和細胞間的運動,從而與P4蛋白及RTP蛋白C端部分共同在病毒粒子在植物韌皮部運輸及擴散方面發揮重要作用[58]。

3 小麥黃矮病抗性育種

目前,對小麥黃矮病的防控主要采用化學藥劑,例如通過藥劑拌種以及田間噴施殺蟲劑等方法控制田間介體蚜蟲種群數量[39]。然而,使用化學藥劑雖然可以有效控制黃矮病的發生,但我國小麥種植面積較大,大規模使用化學藥劑防治黃矮病不僅需要付出較高的經濟成本,而且還會產生眾多環境問題。因此,通過將抗性基因導入培育優良抗性品種并加以推廣是防治黃矮病的最優策略。

3.1 小麥及大麥中的BYDVs抗性資源

目前為止,尚未在小麥的初級基因庫中發現對BYDVs具有顯著抗性的基因。Bdv1是迄今為止報道的小麥中唯一的BYDVs耐病基因,該基因位于巴西春小麥品種‘Frontana’的7D染色體短臂上[59],但是經過表型鑒定發現其只對BYDV-MAV存在一定的耐病性,對其他BYDVs并未有明顯的耐病性,反映出育種應用的局限性[60]。隨后,對335份已知對BYDVs具有抗性或感病性的小麥材料進行了全基因組關聯研究(genome-wide association studies, GWAS),發現了4個與BYDVs抗性顯著相關的QTL位點[61],但由于連鎖累贅等原因,尚未得到有效應用。

在大麥中陸續發現了4個BYDVs耐病基因,分別為Ryd1、Ryd2、Ryd3與Ryd4Hb。其中,位于3H染色體長臂上的Ryd2提供了對BYDV-PAV、BYDV-MAV和BYDV-SGV的耐病性[62-63],并培育出多種不同類型的大麥品種,譬如,在法國推廣應用的‘Amistar’和‘Domino’冬性大麥品種[64]。但是,關于Ryd2的克隆與抗病機理仍處于探索階段,暫未實現突破。Ryd3定位于大麥 6H 染色體短臂靠近著絲粒區域[65],目前已轉移至春、冬大麥品種中[62]。2009年,在四倍體野生球莖大麥‘A17’中發現對BYDV-PAV具有完全抗性的Ryd4Hb[66],隨后的研究表明,Ryd4Hb可能通過干擾介體蚜蟲對植物韌皮部的取食而不是通過對BYDVs本身的耐病性實現對病毒的抗性,這充分體現了BYDVs抗性基因抗病機制的復雜性[67]。

3.2 小麥近緣物種中的BYDVs抗性資源

研究表明,在小麥野生近緣植物中存在著許多優良的黃矮病抗源材料,其中以中間偃麥草Thinopyrumintermedium研究最為廣泛深入[60],研究表明中間偃麥草至少存在3個BYDVs抗性基因,分別為Bdv2、Bdv3與Bdv4。

Bdv2定位于中間偃麥草的第七同源群7X染色體長臂上,對BYDV-GAV、BYDV-PAV 以及BYDV-GPV 均具有很好的抗性[68]。眾多研究者通過組織培養、‘中國春’(Chinese spring, CS)ph1b突變體誘導、γ射線照射等方式實現小麥背景下外緣染色質中靶基因的導入,從而創制出一系列可用于后續小麥抗黃矮病育種的種質材料。例如利用細胞組織培養技術創制出包括‘TC5-TC6’‘TC8-TC10’‘TC14’等7D-7Ai#1易位系,以及‘TC7’類型的7B-7Ai#1易位系[69-70]。利用ph1b突變體成功誘導小麥-中間偃麥草二體附加系L1的7X染色體與普通小麥染色體發生重組,從而培育出一批具有Bdv2的7DL-7Ai#1L易位系,如‘Yw642’‘Yw443’和‘Yw243’等[71-72]。Ayala-Navarrete等利用ph1b突變體成功將Bdv2與Lr19進行聚合,創制出一批既抗葉銹病又對BYDVs具有耐病性的種質材料[73]。2021年,Anderson等利用‘TC14’培育了新的抗黃矮病品種‘MN-Washburn’[74]。

Bdv3首次報道發現于小麥-中間偃麥草7E/7D代換系‘P29’中,隨后被定位于中間偃麥草7E染色體上,對CYDV-RPV具有完全抗性,對BYDV-PAV和BYDV-MAV具有中等抗性[75-76]。前人將‘P29’與普通小麥品種‘Caldwell’雜交后代經γ射線進行照射處理后,產生了‘P961341’‘P98134’等一系列對BYDVs具有抗性的小麥-中間偃麥草7D-7E易位系[77-78]。Bdv4首次報道發現于小麥-中間偃麥草部分雙二倍體‘無芒中4’中,被定位于中間偃麥草 2Ai-2 染色體上[60]。Lin 等進一步利用普通小麥‘中8601’ 與高抗 BYDVs 的小麥-中間偃麥草二體異附加系‘Z6’進行雜交并通過對雜種F1代進行組織培養,從中培育出攜帶Bdv4的抗BYDVs的小麥-中間偃麥草2Ai-2/2D 代換系‘N431’和‘N452’,2Ai-2/2B 代換系‘N420’ 和 ‘N439’,以及一個易位系‘Y5579’[79],極大地豐富了我國小麥抗黃矮病育種的種質資源。雖然前人取得了一系列成果,遺憾的是,除上述基因位點外,目前沒有發現其他新的黃矮病抗性位點,而且這些已知抗性基因的克隆與機理解析也未取得重大突破,因此進一步擴大黃矮病抗性基因挖掘與克隆勢在必行。

4 展望

由BYDVs侵染引起的小麥黃矮病是一種重要的植物病害,對小麥產量具有重要影響。多年來,眾多研究者們對BYDVs傳播、致病機理、抗性育種等方面進行了大量的研究,產生了一系列研究成果,在黃矮病防治及抗性品種培育方面做出了重要貢獻。但是,依然存在一系列問題有待解決。

首先,有大量研究證實了寄主植物-BYDVs-介體蚜蟲之間的相互作用關系,但相關研究還未在介體蚜蟲群體控制及相關藥劑開發方面得到充分應用,未來可以通過進一步加強對相關藥劑的研發,從而對蚜蟲進行綜合治理,實現對黃矮病的綠色防治。

其次,多年來,科學家致力于BYDVs相關致病機理的研究并取得一定進展,但仍存在一些亟須探究的問題,例如ORF6的存在與具體功能,CP-RTP影響介體蚜蟲特異性的確切原因等,此外,由于ORF4完全位于ORF3內部且編碼如此重要的功能蛋白,因此關于兩者的進化關系及趨勢值得深入研究。闡明這些問題將有助于完善BYDVs致病機理,推動基于RNA沉默等手段應用于抗性育種,從而培育出抗黃矮病小麥新品種。

至目前為止,將相關抗性基因導入擬定小麥品種中從而培育抗性品種是黃矮病抗性育種的重要手段之一。但是,近期相關研究成果較少。因此,有關黃矮病抗性育種,建議可以從以下幾個方面展開。首先,加強黃矮病抗性基因挖掘,進一步豐富抗病基因資源。其次,加快對已知抗病基因Bdv2、Bdv3等的克隆及機理解析,從而更好地實現抗性基因的有效利用。最后,有研究表明,Bdv2與Bdv4之間存在加性效應[80],暗示將相關抗性基因進行聚合可能會產生更強的抗病效果,從而培育出更具廣譜抗性的優良品種。