計算毒理學在農藥毒性預測、活性篩查及風險評估中的應用

沈 超, 孫成亮, 郭沛霖, 潘興魯, 吳小虎,徐 軍, 鄭永權, 董豐收*

(1. 植物病蟲害綜合治理全國重點實驗室，中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193；2. 教育部環境修復與生態健康重點實驗室，浙江大學環境與資源學院，杭州 310058)

農藥作為農業有害生物有效防控的重要化學品,廣泛應用于農業生產中。然而,農藥種類繁多,且易發生代謝轉化,因此農藥污染相比于其他化學品污染更加復雜。它們大量不合理使用導致的污染已引發一系列人類健康及環境安全問題。依靠常規試驗手段很難對所有化合物進行有效評估。計算毒理學的出現為解決這一大難題提供了思路,可有效避免高風險農用化學品的投入使用及對人類健康和環境造成的危害。本文主要介紹計算毒理學的發展及其在農藥毒性預測、活性篩查及風險評估中的應用,以期為新時代背景下農藥對人類健康及環境安全的風險評估提供新思路。

1 計算毒理學的發展

20世紀80年代初期,計算機技術飛速發展,為計算毒理學的誕生奠定了良好基礎。計算毒理學的發展要從快速增長的化學品數量說起。由于化學品數量的急速激增,常規的試驗方法已無法為如此多的化學品毒性及風險評估提供測試。高昂的動物實驗費用同樣阻礙了化學品毒性及風險評估的進程,且違背實驗動物的“3R”原則(即減少Reduction、替代Replacement、優化Refinement)。由此“計算毒理學”學科應運而生。這是一門以計算機科學為基礎,通過融合化學、生物信息學、數學及系統生物學等學科而形成的新興學科,其能夠實現對化學品的環境暴露、毒性、活性及風險的高效預測及評價。美國聯邦環保局將其定義為:應用數學及計算機模型來預測、闡明化合物的毒副作用及作用機理[1]。經過了幾十年的發展,計算毒理學已逐漸滲透到多個學科、領域中,在藥物開發、化學品毒性預測、活性篩查及風險評價中扮演著重要角色。進入21世紀以來,以美國和歐盟成員國為主的一些發達國家大力發展計算毒理學,并開發了一系列軟件及模型用于化學品的毒性預測、活性篩查及風險評價[2]。美國聯邦環保局于2005年建立了國家計算毒理學研究中心,并在2年后啟動了宏偉的ToxCast項目[3]。ToxCast項目旨在通過體外細胞高通量篩選的方式一次性大規模地對化學品進行毒性及活性評估,大大減少了實驗動物的使用[3-4]。該項目的啟動不僅縮短了化合物毒性及風險評估的時間,也為計算毒理學的發展提供了大量的數據支持。

我國計算毒理學學科的發展起步較晚。近年來,我國也逐漸開始高度重視計算毒理學的發展[5]。以大連理工大學、南京大學、中國科學院生態環境研究中心等單位為代表的科研團隊逐漸嶄露頭角,并在化合物的環境毒性預測及風險評價等方面取得了重要進展[6-8]。目前,我國已有較多的科研人員將計算毒理學融入到科學研究中,計算毒理學的發展呈現出蒸蒸日上的趨勢。

2 計算毒理學在農藥毒性預測、活性篩查及風險評估中的應用

農業生產離不開農藥的使用,農藥在控制農業病蟲草害中扮演著非常重要的角色。目前,全球登記使用的農藥有效成分超過了1 000種,每年投入使用的農藥總量達到了幾百萬噸[9-10]。農藥在使用過程中約有60%會進入環境中,對非靶標生物及生態系統構成威脅。因對農藥進行環境毒性及風險評價需投入大量的財力、物力及人力,通過實驗動物去評價農藥的生態風險不僅造成了一定的浪費,還會引發公眾對動物福利倫理的不滿。進入21世紀以來,世界各國都在極力探索通過先進的技術手段對農藥進行毒性及風險評估,以期降低和預防農藥對人類及環境產生的負面影響。通過計算毒理學模型可以有效實現農藥的高通量毒性預測、活性篩查及風險評估,對指導農藥的安全生產、科學使用管理具有重要意義[11]。目前國內外針對農藥進行的計算毒理學研究已有較多的報道。截至2023年6月初,通過輸入關鍵詞“computational toxicology”和“pesticide”,從“Web of Science”科學網站資源檢索到相關的文章5 598篇(圖1)。這些文章主要涉及計算毒理學在農藥毒性預測、生物活性篩查及風險評估中的應用。

圖1 農藥研究中與計算毒理學相關的文章發表情況Fig.1 Publications related to computational toxicology in pesticide studies

2.1 計算毒理學在水生生物毒性預測及風險評估中的應用

許多農藥水溶性高、環境遷移力強,在降雨豐富和水系發達的地區,這些具特殊理化性質的農藥會經雨水沖刷、地表徑流、土壤淋溶等途徑進入水生生態系統[12-13]。長時間的水體積累易導致農藥殘留濃度超過水體環境所能容許的最大安全閾值,進而對水體生態系統的種群繁殖及物種多樣性造成一定破壞。評估水體農藥殘留污染對水生生態系統的影響對維護生態系統的穩定具有重要意義。通常需要確定目標農藥對不同水生生物的毒性閾值,以此為基準設定農藥環境安全閾值。目前較為普遍的做法是通過模式生物測定農藥對生物的半數致死濃度、半數有效濃度、無觀察效應濃度、無觀察作用濃度等閾值,并結合物種敏感性分布曲線(species sensitive distribution curves, SSDs)及風險熵值(risk quotient, RQ)評估農藥的水體風險[14]。

農藥的毒理學數據是農藥風險評估的基礎,ECOTOX(https:∥cfpub.epa.gov/ecotox/search. cfm)、PPDB(Pesticide Properties DataBase, https:∥sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/)及OpenFoodTox(https:∥www.efsa.europa.eu/en/microstrategy/openfoodtox)等數據庫搜集了大部分農藥對水生生物的毒理學數據。研究人員通過數據庫可了解農藥對水生生物的潛在毒性[15-17],但當前仍有一部分農藥的毒理學數據是缺失的,而通過預測模型可以彌補該空缺。定量構效關系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)和定量結構-毒性關系(quantitative structure-toxicity relationship, QSTR)是使用最廣泛的計算毒理學方法,可通過農藥的化學結構和性質的相似性分析來有效預測單個農藥對水生生物的毒性[18]。美國環保局和歐盟已相繼開發出專門用于農藥水生生物毒性預測的軟件(EPI Suite和QSAR Toolbox套件),其原理是基于QSAR和QSTR模型算法實現化合物和測試物種的毒性之間的對應聯系,通過公式算法預測化合物的毒性。當前,QSTR和QSAR模型已被廣泛應用于農藥及其轉化產物對水生生物的毒性預測[19-20]。例如,通過QSTR模型可有效預測不同農藥對糠蝦Americamysisbahia的毒性[21]。通過5種機器學習算法建立的639種農藥對大型溞Daphniamagna急性毒性的QSTR模型,可有效預測不同農藥對大型溞的毒性[22]。Toropov等[23]通過QSAR建模的方法構建了農藥對虹鱒Oncorhynchusmykiss的毒性預測模型,該模型能用于農藥對水生生態系統的風險評估。此外,Yang等[24]基于遺傳算法和多元線性回歸方法,建立了農藥對羊頭魚的毒性預測QSAR模型,可有效用于殺蟲劑、殺菌劑及除草劑對羊頭魚的毒性預測,且具有較高的準確性。種間相關估算(interspecies correlation estimation, ICE)是實現水生模式物種到瀕危物種毒性換算的常用預測模型,其作用在于補充農藥毒理學數據的缺失,有助于構建更具說服力的SSDs[25]。早在21世紀初期,美國聯邦環保局便開始嘗試使用ICE模型對一些污染物進行瀕危物種毒性預測,并證實了該模型的可靠性[26-28]。ICE模型已被廣泛用于水質監測及污染物的環境風險評估,特別是在農藥對水生生態系統的風險評估中[29-31]。另外,近些年越來越多的模型軟件陸續被開發,通過農藥的簡化分子線性輸入規范來預測農藥的理化性質及對水生生物的毒性的研究更加流行[11]。

農藥的轉化產物是近些年農藥研究領域的熱點,轉化產物主要包括了代謝產物及降解產物。許多農藥轉化產物被證實比其母體具有更強的水生生物致死毒性,且頻繁在水生環境中檢出[32-34]。例如新煙堿類殺蟲劑被廣泛應用于農業生產中,該類殺蟲劑及其轉化產物在水生環境中被頻繁檢出,其造成的水生生態風險受到了國內外環境領域專家的重點關注[35-37]。因部分轉化產物本身存在不穩定性,當前通過儀器鑒定的方式仍無法對新煙堿類殺蟲劑轉化產物進行全面鑒定,這有可能忽略了部分新煙堿類殺蟲劑轉化產物潛在的環境風險。通過模擬預測的方法能更快、更準確、更便捷地對新煙堿類殺蟲劑轉化產物進行毒性預測及潛在風險評估。我們前期通過預測的方法分析了國內外7種常用的新煙堿類殺蟲劑及其轉化產物對水生生物的毒性及潛在的風險。結果表明,吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、烯啶蟲胺和呋蟲胺可能分別存在21、19、80、16、47、17和86種有氧轉化產物,且部分轉化產物比其母體具有更強的水生生物毒性;進一步研究發現含有6-氯吡啶環結構的轉化產物具有較強的生物富集能力,可在水生生物體內蓄積并通過食物鏈傳遞和累積,因此其在水體生態系統中的潛在風險不容忽視[38]。此外,我們預測分析了2種國內創制的新煙堿類殺蟲劑及其轉化產物對水生生物的毒性及潛在的風險。結果顯示,哌蟲啶和環氧蟲啶可能存在428和113種有氧轉化產物,近50%的哌蟲啶轉化產物及近41%的環氧蟲啶轉化產物對水生溞類或魚類具有毒性;且有80種哌蟲啶或環氧蟲啶轉化產物對水生生態系統具有潛在風險。進一步的研究發現這些具有風險的轉化產物均含有6-氯吡啶環結構,這可能是導致毒性風險的主要原因[39]。

2.2 計算毒理學在蜜蜂毒性預測及風險評估中的應用

傳粉昆蟲是重要的植物傳粉媒介,通過昆蟲傳粉可以保證植物完成生命周期。蜜蜂作為最重要的傳粉昆蟲之一在自然界中扮演著重要的角色[40]。過去十幾年間,全球蜜蜂種群密度在急劇下降,其中農藥(特別是殺蟲劑)的大量使用是致使蜜蜂種群數量下降的重要原因之一[41-42]。農藥的蜂毒問題一直是農藥行業關注的問題。在新農藥研發或投入使用前,對其進行蜂毒評估是必不可少的步驟。傳統的蜂毒評估是以蜜蜂接觸農藥后半數死亡的濃度來判斷該農藥對蜜蜂的毒性強弱,將毒性劃分為低毒、中毒、高毒和劇毒4級[43]。然而,通過蜂毒試驗評估農藥對蜜蜂的毒性需要耗費大量的蜜蜂個體,該做法有違實驗動物的“3R”原則。通過計算毒理學的方法可有效解決這一問題。近些年,基于機器學習算法的蜜蜂毒性預測模型被廣泛應用于農藥對蜜蜂的毒性評估[43-45]。例如,趙曉等[43]構建了農藥對熊蜂Bombusspp.和意大利蜜蜂Apismellifera急性接觸毒性分類預測模型,預測準確率分別達到86.7%和80.0%。Como等[44]構建了基于256種農藥對蜜蜂急性接觸毒性的QSAR模型,該模型精確度為70%,有望用于預測不同結構的農藥對蜜蜂的急性接觸毒性。此外,Wang等[45]利用深度學習機器算法構建了基于810種農藥的蜜蜂毒性預測模型,該模型的精確度達到83.72%,可用于評估農藥暴露對蜜蜂的毒性風險。模型準確性與充足的毒理學數據密不可分,隨著農藥對昆蟲毒理學數據的不斷積累,計算毒理學在農藥對昆蟲的毒性預測及風險評估中的應用前景將會更加廣闊。

2.3 計算毒理學在農藥活性篩查中的應用

核受體是后生動物中非常重要的轉錄因子,在生物體生殖發育、性別決定與分化,細胞新陳代謝、穩態維持及基因表達調控等方面發揮重要作用[46-47]。許多核受體是外源小分子配體的重要靶點,在介導細胞信號轉導及代謝途徑激活中扮演重要角色[48-49]。農藥等外源小分子在進入細胞后都會經歷一系列代謝轉化及生理調控反應,這一系列反應與核受體的調控密切相關[50-51]。比較典型的農藥靶標核受體包括芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)、雌激素受體(estrogen receptor, ER)、雄激素受體(androgen receptor, AR)、甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor, TR)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors, PPARs)等[49,52-55]。絕大部分農藥會通過靶向核受體發揮生理功能,激活或抑制核受體信號通路,調控下游基因表達。目前對農藥進行核受體活性篩查的常規方法主要是通過體外細胞高通量篩查的方式。例如,Tox21項目已經檢測了超過10 000種針對各種受體和其他蛋白質的化學物質[56]。但常規的核受體活性篩查方法仍存在投入費用昂貴、對儀器及操作人員的要求極高等諸多不足,在篩查效率上也無法滿足科研人員的需求。近些年,通過機器學習構建篩查模型用于農藥核受體活性篩查的案例層出不窮。例如,Zhu等[52]通過隨機森林及深度神經網絡2種機器學習算法,構建了用于農藥AhR激動活性篩查的模型,其篩查準確率高達96%;利用該模型篩查發現,國內外常用的700多種農藥中有77種表現出AhR激動活性。同時,Shen等[53]通過機器學習的方法構建了用于農藥ER激動活性篩查的模型,準確率為70%。篩查結果顯示,國內外使用的1 000多種農藥中有70多種展現出ER激動活性。此外,Piir等[54]基于1 688種AR激動劑或拮抗劑的化合物分子(小分子中包括了一部分農藥),通過機器學習的方法構建了用于化合物AR活性篩查的模型,其在預測AR激動劑和拮抗劑中的準確度分別為80%和72%。通過機器學習算法篩查農藥核受體活性不僅方便、快捷、低成本,且符合實驗動物的“3R”原則。隨著農藥體外細胞活性篩查數據的不斷積累,計算毒理學在未來農藥活性篩查中將會發揮更加重要的作用。

2.4 有害結局路徑用于農藥暴露風險評估

現實生活中,人類接觸及暴露于農藥的方式是多樣化的,皮膚接觸、呼吸吸入、飲水及食物攝入等途徑都是人類暴露農藥的方式[57-59]。據報道,包括水體、土壤、空氣等在內的與人類生存相關的環境及食物中均頻繁檢測到不同種類農藥殘留[60-61]。農藥的廣泛持續使用可能會導致環境及食品污染,對人類的健康具有潛在危害,該風險已引起廣泛的關注[62-63]。盡管科研人員已通過大量的實驗動物研究來評估農藥暴露可能產生的人體健康風險,但當前研究的重點在于單種農藥暴露引發的健康風險及相關致害機理。而實際人體往往同時暴露于多種農藥,其誘發的健康風險可能比單種農藥暴露更加復雜。因此,研究多種農藥同時暴露可能產生的人類健康風險是當前科學家重點關注的內容。

農藥混合暴露不同于單種農藥暴露,不僅要考慮不同農藥暴露劑量差異的問題,也要考慮不同農藥誘發的毒性效應及機理的差異。同時,部分農藥混合暴露還存在毒性疊加或增強的可能性[64-65]。因此,通過常規毒性評估往往無法準確闡明農藥混合暴露誘導的毒性風險。歐洲食品安全局在2019年提出了通過有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架評估農藥混合累積產生的風險,該方法的提出使農藥多元暴露毒性研究變得更簡單[66]。AOP框架的概念最早于2010年提出,它是一個由分子起始事件引發的有害結局產生的概念框架,主要涵蓋了4個要素:分子起始事件、關鍵事件、關鍵事件關系及有害結局(圖2)。AOP框架構建的動機是為了將體內測定的毒理學數據與體外、化學及計算機信息相聯系,以支持化合物的風險評估[67]。AOP框架已被廣泛應用于農藥的風險評估,在農藥的神經毒性、發育毒性、遺傳毒性、內分泌干擾作用及致癌性等評估中發揮著重要作用[68]。例如,Leung等[69]提出了一種產前同時接觸大麻素和有機磷農藥毒死蜱的AOP框架,并闡明了產前接觸農藥污染的大麻可能導致后代神經發育毒性。Gou等[70]開發了一種名為ScoreAOP的框架用于預測包括農藥在內的11種化合物對斑馬魚胚胎發育的毒性,該研究對深入了解化學物質誘導魚類發育毒性的潛在機理具有積極作用。Lichtenstein等[71]通過AOP框架評估了農藥誘導人的肝癌細胞肝脂肪變性的作用方式,該研究對二元或多元農藥混合暴露誘導的肝脂肪變性發生過程及產生的有害結局評估具有重要意義。AOP框架的提出對深入理解農藥混合暴露過程中誘導的毒性風險來源具有重要意義,在今后農藥混合暴露的風險評估研究中將會產生積極作用。

圖2 有害結局路徑框架圖Fig.2 Structure of adverse outcome pathway framework

3 計算毒理學在農藥毒性預測、活性篩查及風險評估應用中所面臨的挑戰

計算毒理學的發展已直接或間接影響著科學研究的進展,其對解放科研人員勞動力及減少實驗動物投入具有積極作用。盡管計算毒理學已被廣泛應用于農藥毒性預測、活性篩查及風險評估,但仍面臨許多挑戰,主要包括以下幾個方面:1)毒理學數據的可靠性存疑。人員操作間存在差異及實驗條件差異是影響實驗結果的主要因素,因此,針對同一化合物毒性評估,可能產生不同的試驗結果,需要進行甄別。2)毒理學數據體量仍然不足。大數據是計算毒理學模型構建的基礎,毒理學數據樣本體量不足會影響模型構建的精確度及可靠性。當前的農藥毒理學數據還遠遠無法滿足用于多方位模型構建的要求,毒理學數據的不斷累積將有助于破解這一難題。3)預測結果與人體暴露的真實關聯度無法完美匹配。毒理學研究的最終目的是服務于人體健康及環境安全的風險評估,通過動物實驗及體外細胞實驗測試獲得的實驗結果存在對保護人體健康的毒性外推問題。實驗動物與人體之間存在種屬差異,人類細胞與個體之間存在組織、器官及內周系統相互作用的差異,都是影響測試結果與人體暴露相互匹配的因素。因此,基于動物實驗及體外細胞實驗測試結果構建的預測模型用于人類健康風險評估仍無法完美匹配農藥暴露對人體的真實健康風險。4)專業人才缺乏,不同背景的多學科人才合作需要加強。計算毒理學是一門多學科交叉的新興學科,對研究人員的要求極高。研究人員需要精通多學科知識(包括數學算法、統計學、物理化學、生物學、計算機科學等),并能熟練掌握計算機操作、會使用若干編程語言及軟件。目前,我國開展計算毒理學研究的人員仍然缺乏,專業人才的培養需要不斷加強。此外,單個人或單個研究團隊往往難以獨立完成整個項目的研究,因此,需要加強不同領域研究人員之間的合作,確保合理分工和聯合攻關破解難題[6]。

4 結論與展望

農藥的使用在對農作物病蟲害有效防治的同時帶來的環境污染及人類健康風險問題已日趨嚴重。通過傳統的動物實驗評估農藥的毒性及人類健康風險不僅耗時、耗力、耗成本,且違背了動物實驗“3R”原則,引發了公眾的不滿。雖然基于體外細胞實驗的農藥毒性與風險評估及活性篩查避免了實驗動物的大量投入,但仍需要較高的經費用于支撐高端儀器運作及所需材料與試劑的消耗。計算毒理學科的出現為農藥的毒性預測、活性篩查及風險評估提供了一個嶄新的研究方向,它的出現不但節約了開展實驗所需的成本和時間,而且減少了實驗動物的投入,其對未來農藥的環境安全性及人類健康風險評估具有非常重要的意義。盡管計算毒理學在農藥毒性預測、活性篩查及風險評估的應用中仍面臨眾多挑戰,隨著農藥毒理學數據積累的增加,開展計算毒理學研究人才數量的增多,不同領域研究人員間合作的加深,相信在不久的未來,計算毒理學科在農藥安全性及風險評估中的應用前景將更加廣闊。