褐飛虱對環氧蟲啶的抗性選育和遺傳方式

覃 耀, 杜祖儀, 宋璐丹, 馬康生, 萬 虎, 李建洪

(華中農業大學植物科學技術學院，昆蟲資源利用與害蟲可持續治理湖北省重點實驗室，武漢 430070)

褐飛虱Nilaparvatalugens(St?l)(brown planthopper,BPH)屬半翅目Hemiptera飛虱科Delphacidae,是當前水稻上防控壓力最大的害蟲之一[1],亦是全球范圍內抗藥性事件排名第一的糧食作物害蟲[2],因其防控意義重大而被農業農村部列入《一類農作物病蟲害名錄》[3]。目前,褐飛虱田間種群防控主要依賴化學防治,但隨著用藥歷史不斷延長,褐飛虱田間種群已經對眾多常用殺蟲劑產生了明顯的抗性[4-7]。新煙堿類殺蟲劑因其獨特的作用機制及優異的殺蟲活性被廣泛應用于褐飛虱田間防治[8]。盡管我國已經停止使用吡蟲啉防治稻田褐飛虱,但近年來,褐飛虱田間種群對吡蟲啉仍具有極高水平抗性,對噻蟲嗪和呋蟲胺的抗性已達高水平,對噻蟲胺的抗性處于中等至高水平抗性,對氟啶蟲胺腈、烯啶蟲胺和啶蟲脒產生了中等水平抗性,并且抗藥性水平有進一步上升的趨勢[6, 9-10]。褐飛虱對殺蟲劑抗性的持續升高可能會導致防治失敗和水稻生產成本的大幅度增加[11],給新型殺蟲劑的創制及害蟲抗藥性治理帶來嚴峻的挑戰。

環氧蟲啶(cycloxaprid)是由華東理工大學自主研發的一種新煙堿類殺蟲劑,具有獨特的順式硝基構型和七元氧橋雜環結構,而吡蟲啉、呋蟲胺和噻蟲胺等傳統新煙堿類殺蟲劑中的-NO2或者-CN均為反式結構[12]。作為煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)拮抗劑,環氧蟲啶對稻飛虱、蚜蟲和粉虱等刺吸式口器害蟲具有優異的殺蟲活性[12-14],不易與吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑產生交互抗性,能夠有效防治對吡蟲啉具有抗性的褐飛虱[15-16]、棉蚜Aphisgossypii[17]和煙粉虱Bemisiatabaci[14]。目前,我國褐飛虱田間種群對環氧蟲啶處于敏感至低水平抗性階段[18]。

抗藥性的發展受多種因素的影響,其中遺傳因子影響抗性發展速度,研究害蟲抗藥性遺傳方式有助于了解抗性動態及抗性治理策略的選擇,也有助于抗性機理的研究。目前,關于昆蟲和螨類抗性遺傳方式的研究已有大量報道,例如,家蠅Muscadomestica對殘殺威的抗性為單基因控制的常染色體、不完全隱性遺傳[19];棉籽尖長蝽Oxycarenushyalinipennis對氟啶蟲胺腈的抗性為常染色體、多基因控制的不完全顯性遺傳[20];小菜蛾Plutellaxylostella對氰氟蟲腙、朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus對丁氟螨酯的抗性均為多基因控制的常染色體、不完全隱性遺傳[21-22]。已有研究表明,通常多基因控制的抗性比單基因控制的抗性發展更緩慢,但是多基因控制的抗性形成后治理難度較大;隱性或不完全隱性基因控制的抗性有利于藥劑防治和抗性治理[23-24]。目前褐飛虱對許多常用殺蟲劑的抗性遺傳方式已被廣泛報道,但是褐飛虱對環氧蟲啶的抗性遺傳方式卻鮮有報道。因此,明確褐飛虱對環氧蟲啶的抗性遺傳方式對于保護和延長環氧蟲啶的使用壽命具有非常重要的意義,可為褐飛虱的高質量防控和抗性治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

褐飛虱室內敏感品系(CYC-S):2009年采自湖南省長沙市水稻田,在實驗室連續飼養多年且未接觸任何藥劑;褐飛虱環氧蟲啶室內抗性品系(CYC-R):由CYC-S品系經環氧蟲啶連續34代的室內抗性篩選后獲得,兩個品系具有相同的遺傳背景。

試驗用褐飛虱均在人工氣候培養箱中,采用未經過任何藥劑處理的‘Taichung Native 1’(‘TN1’)水稻稻苗飼養,飼養條件為:溫度(27±1)℃,相對濕度70%～80%,光周期L∥D=16 h∥8 h。

1.2 供試藥劑

97.5%環氧蟲啶(cycloxaprid)原藥由華東理工大學饋贈。

1.3 試驗方法

1.3.1生物活性測定

參照《水稻褐飛虱抗藥性監測技術規程》(NY/T 1708-2009)中的稻苗浸漬法進行褐飛虱毒力測定。選取生長健康、長勢一致的10 cm高稻苗,15根一組,洗凈,于蔭涼處晾干。將供試藥劑的母液用0.1% Triton X-100水溶液稀釋成6～9個系列濃度。將供試稻苗置于藥液中浸30 s后取出晾干,并用浸水的脫脂棉包裹住稻苗根部后放入一次性塑料杯中,每杯接入15頭健康一致的褐飛虱3齡中期若蟲后用尼龍細紗布封口,以0.1% Triton X-100水溶液處理作為空白對照,每處理3個重復。將處理后的稻苗放入溫度(27±1)℃,相對濕度70%～80%,光周期為L∥D=16 h∥8 h的人工氣候培養箱中。處理后96 h統計各處理的若蟲死亡數,以小毛筆輕觸蟲體,不能協調運動的個體視為死亡。利用POLO-Plus軟件處理數據計算毒力回歸方程的斜率(slope)、標準誤、卡方值(χ2)、自由度(df)、LC50及其95%置信限。抗性倍數(resistance ratio, RR)=抗性品系褐飛虱的LC50/敏感種品系褐飛虱的LC50。抗性水平分級標準:RR ≤ 5為敏感;5 100為高水平抗性[5]。

1.3.2抗性品系選育

由于褐飛虱田間種群的用藥背景較為復雜,不宜作為抗性遺傳方式研究的材料,故采用室內選育的抗環氧蟲啶褐飛虱品系作為試驗材料。將室內敏感品系(CYC-S)作為抗性選育的出發種群,一部分試蟲進行抗性篩選,獲得抗環氧蟲啶褐飛虱品系(CYC-R),另一部分試蟲(CYC-S)不接觸任何藥劑,于相同條件下繼續飼養。在抗性篩選過程中,每一代都采用稻苗浸漬法進行毒力測定。根據上一代的毒力測定結果,選用環氧蟲啶LC70濃度浸泡新鮮稻苗(每30根一組)30 s后取出晾干,以浸水的脫脂棉包住稻苗根部后放入一次性塑料杯中,每杯接入30頭生長一致的3齡中期若蟲后用尼龍紗布封口,放入人工氣候培養箱中。每代篩選約3 000頭試蟲,處理后96 h,將存活試蟲轉移至未接觸藥劑的新鮮水稻苗上繼續飼養、繁殖,供下一代篩選。

1.3.3雜交、回交試驗

分別選取120頭CYC-S和CYC-R品系5齡若蟲,于玻璃試管中單頭飼養。待若蟲發育為成蟲后,抗、敏品系進行正反交(CYC-R♀ × CYC-S♂;CYC-S♀ × CYC-R♂),后代為F1代(F1RS;F1SR)。在抗性不存在性連鎖遺傳的情況下,F1代與敏感父本CYC-S回交,后代為F2BC。F1代自交產生F2代(F2RS;F2SR)。每個雜交組合確保雌雄比例1∶1,雌雄蟲各50頭。

采用稻苗浸漬法分別測定環氧蟲啶對親本(CYC-R和CYC-S)、F1RS、F1SR、F2RS、F2SR、F2BC代褐飛虱3齡若蟲的毒力,并繪制濃度對數-死亡率幾率值線(LC-P線)。

1.3.4抗性遺傳方式分析

根據Stone[25]的Falconer公式計算抗性顯性度(D):

公式中X1、X2、X3分別為親本抗性品系(CYC-R)、正反交F1(F1RS和F1SR)和親本敏感品系(CYC-S)的LC50的對數值。當D=-1時,抗性為完全隱性遺傳;當-1

根據Tsukamoto[26]提出的抗性遺傳方式分析方法,假設褐飛虱對環氧蟲啶的抗性遺傳方式為單基因控制的遺傳,則回交后代F2BC的濃度對數-死亡率幾率值線在死亡率50%處、自交后代F2RS和F2SR在死亡率為25%和75%處會出現明顯平坡。若以上相應位置沒有出現明顯平坡,表明褐飛虱對環氧蟲啶的抗性由2個或2個以上基因控制。根據Georghiou等[27]提出的公式計算單因子遺傳假定的自交后代F2RS、F2SR和回交后代F2BC在一系列藥劑濃度下的期望死亡率:

E(F2RS或F2SR)=W1× 0.25 +W2× 0.5 +W3× 0.25;

E(F2BC)=(W1或W3)× 0.5+W2× 0.5;

其中E(F2RS)、E(F2SR)和E(F2BC)分別代表F2RS、F2SR和F2BC在相應濃度下的期望死亡率;W1、W2、W3分別為CYC-S、F1RS(或F1SR)、CYC-R在相應濃度下的實際死亡率。

為進一步確定控制抗性基因的數目,根據Sokal等[28]提出的單基因遺傳假設的適合性測驗,對F2RS、F2SR和F2BC的實測值和理論值進行適合性檢驗,公式如下:

2 結果與分析

2.1 抗環氧蟲啶褐飛虱品系選育

采用稻苗浸漬法以褐飛虱敏感品系為出發種群進行室內抗性選育,以獲得對環氧蟲啶高抗的褐飛虱品系。通過連續34代的藥劑篩選,獲得了一個抗性倍數為102.42倍的抗性品系(CYC-R)。如表1和圖1所示,前5代抗性上升較慢,LC50從2.20 mg/L上升為8.66 mg/L,處于敏感至低水平抗性階段;隨后G6至G23代抗性水平逐漸上升,抗性倍數從10.11倍上升為30.88倍,處于中等水平抗性;從G23代到G29代抗性上升較快,在G29代達到高水平抗性(RR=112.14倍),在此過程中,抗性水平存在較大的波動,G28代抗性急劇下降,但仍處于中等水平抗性,之后在G29代快速上升至高抗水平;第29代后抗性維持在高抗水平。

圖1 褐飛虱對環氧蟲啶抗性室內選育動態Fig.1 Dynamics of cycloxaprid-resistance in Nilaparvata lugens during resistance selection

表1 褐飛虱對環氧蟲啶抗性選育1)Table 1 Selection for cycloxaprid-resistance in Nilaparvata lugens in laboratory

2.2 褐飛虱對環氧蟲啶抗性遺傳方式

2.2.1抗性顯性度分析

敏感品系CYC-S與抗環氧蟲啶褐飛虱品系CYC-R經正反交后,得到F1RS和F1SR兩個子代,由表2可知,環氧蟲啶對F1RS和F1SR的LC50分別為38.67(32.21～47.01)mg/L和39.60(32.87～48.41)mg/L,二者數值較為接近,且95%置信區間基本重疊,即環氧蟲啶對F1RS和F1SR的LC50無顯著差異,表明褐飛虱對環氧蟲啶的抗性基因位于常染色體上。通過Stone公式計算兩個F1代的抗性顯性度,顯性度D值分別為0.33和0.34,二者均大于0小于1,表明褐飛虱對環氧蟲啶的抗性為不完全顯性遺傳。為進一步驗證上述結果,根據4個種群的毒力測定結果繪制了濃度對數-死亡率幾率值線(LC-P線),由圖2可知,雜交后代F1RS和F1SR的LC-P線處于兩個親本的中間位置,基本重疊,且更靠近抗性品系的LC-P線,這也進一步證實了褐飛虱對環氧蟲啶的抗性為不完全顯性遺傳。

圖2 環氧蟲啶對CYC-S、CYC-R、正反交F1RS和F1SR代褐飛虱的毒力回歸線Fig.2 Toxicity regression lines of cycloxaprid for CYC-S, CYC-R, and their reciprocal cross offspring of F1RS (CYC-R♀ × CYC-S♂) and F1SR (CYC-S♀ × CYC-R♂)

表2 環氧蟲啶對抗性品系、敏感品系、雜交F1代、自交及回交F2代褐飛虱3齡若蟲的毒力1)Table 2 Responses of parental, reciprocal crosses and backcross populations of Nilaparvata lugens to cycloxaprid

2.2.2遺傳基因控制數量分析

圖3 環氧蟲啶對CYC-S、CYC-R、F2SR(a)、F2RS(b)和F2BC(c)代褐飛虱的濃度對數-死亡率幾率值線Fig.3 Logarithm concentration-mortality probit lines of cycloxaprid for susceptible CYC-S, resistant CYC-R, F2SR (a), F2RS (b) and F2BC (c)

表3 褐飛虱對環氧蟲啶抗性單基因遺傳適合性檢驗1)Table 3 Chi-square (χ2) analysis for monogenic or polygenic inheritance of cycloxaprid-resistance in Nilaparvata lugens

3 結論與討論

近年來,褐飛虱田間種群已經對吡蟲啉、烯啶蟲胺、氟啶蟲胺腈、噻蟲胺、毒死蜱、吡蚜酮和噻嗪酮等多種殺蟲劑產生了不同程度的抗性[4, 6-7],抗性形勢日益嚴峻,但關于褐飛虱對環氧蟲啶的抗性鮮有報道。在靶標害蟲還未對新型殺蟲劑產生抗性前,室內抗性選育及抗性遺傳方式研究可為該藥劑的合理使用和高質量抗性治理策略的制定及實施提供重要的理論依據。

本研究使用環氧蟲啶對室內敏感品系褐飛虱(CYC-S)進行抗性選育,經過29代篩選后,獲得對環氧蟲啶產生112.14倍的高水平抗性的褐飛虱抗性品系(CYC-R),之后繼續對其進行抗性篩選,使其抗性穩定在高抗水平。由此可知,即使環氧蟲啶具有獨特的作用機制,但連續、單一的藥劑選擇同樣會迫使褐飛虱產生較高的抗性,表明褐飛虱對環氧蟲啶存在產生高水平抗性的風險。類似地,室內連續篩選導致灰飛虱Laodelphaxstriatellus對環氧蟲啶產生了10.24倍的中等水平抗性[29];棉蚜Aphisgossypii經環氧蟲啶室內篩選20代后,其對環氧蟲啶的抗性達到了69.50倍[30]。因此,為預防或延緩褐飛虱田間種群對環氧蟲啶抗性的產生,亟須明確其對環氧蟲啶抗性的遺傳方式,用以指導田間合理用藥并延長環氧蟲啶的使用壽命。

遺傳雜交試驗表明,抗環氧蟲啶褐飛虱品系(101.27倍)對環氧蟲啶的抗性為常染色體、不完全顯性遺傳,該遺傳方式理論上更有利于抗性的發展。本文的研究結果與褐飛虱對吡蟲啉、噻蟲胺、烯啶蟲胺和呋蟲胺的抗性遺傳方式的研究結果類似,均為常染色體控制的不完全顯性遺傳[31-34]。然而,褐飛虱對氟啶蟲胺腈抗性為常染色體、不完全隱性遺傳[35],對三氟苯嘧啶抗性為常染色體、共顯性遺傳[36]。抗性遺傳方式的差異可能是不同的藥劑選擇壓、殺蟲劑類型和遺傳背景等所導致。另外,濃度對數-死亡率幾率值線分析及適合性檢驗表明,褐飛虱對環氧蟲啶的抗性由多個等位基因決定,可能與褐飛虱代謝酶以及靶標受體煙堿型乙酰膽堿受體基因的變化有關。在室內篩選的褐飛虱抗性種群中,褐飛虱對吡蟲啉、噻蟲胺、烯啶蟲胺和呋蟲胺等新煙堿類殺蟲劑的抗性均受多個基因控制[31-34]。已報道的研究表明,雖然多基因遺傳抗性的發展速度比單基因遺傳抗性慢,但產生的抗性譜較寬,一旦抗性形成后通常比單基因遺傳更難控制,且抗性治理難度較大[24, 32, 35, 37]。因此,針對褐飛虱對環氧蟲啶的抗性問題,可采用預防性抗性治理策略,在抗性未明顯產生前就應限制環氧蟲啶的使用次數,與具有不同作用機制的藥劑混用或輪用,避免單一藥劑的大量連續使用,以延緩褐飛虱對環氧蟲啶的抗性演化,保持環氧蟲啶在褐飛虱防治過程中的良好防效。