魚類致病熒光假單胞菌外膜蛋白LolB多克隆抗體制備、鑒定與免疫活性分析

晁 嘉,簡思杰,2,孫 薇,3,陳 銳,4,丁 銳,4,陳 琛,3,5,劉 祥,2

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院 中德天然產物研究所,陜西漢中 723001;2.阜陽師范大學 生物與食品工程學院,安徽阜陽 236037;3.陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心,陜西漢中 723001;4.陜西理工大學,秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室(培育),陜西漢中 723001;5.陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中 723001)

隨經濟建設繁榮發展,人們的生活水平不斷提高,魚類消費也在逐年增加,《2021中國漁業統計年鑒》顯示,2020年中國水產品總量達到 6 549.02萬t,漁業災情造成的經濟損失達 1 525 996.46萬元[1],其中病原菌感染是影響漁業發展的重要問題[1-2]。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是魚類感染的主要病原菌[3-4],可感染鯽魚、草魚、鯉魚等常見養殖魚類[5-6],主要的感染癥狀為魚體發炎,鱗片脫落,鰭條充血糜爛,呈現赤皮病。熒光假單胞菌的防治主要為抗生素,但抗生素濫用易出現耐藥性菌株,且存在殘留以及污染壞境等問題[7];中草藥治療的機制暫不明確且效果不明顯;滅活疫苗處于研究初期,在安全性和批量生產上存在不足,水產應用較少,有必要開發新型疫苗。重組亞單位疫苗,是利用基因工程或化學方法生產的可使人或動物激活體內免疫反應的免疫活性片段,具有安全、高效等優點,是目前疫苗研究的熱點領域[8-9]。

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜上的一類蛋白,負責胞外信息的接受以及胞內通路的激活,還具有物質運輸、結構支撐等多種特性,尤其是免疫原性較強[10],在重組疫苗上備受關注。目前已經有一系列基于外膜蛋白免疫原性的魚類疫苗研究,Tang等[11]將魚腸弧菌的5個外膜蛋白進行原核表達,發現rOmpT具有良好的保護性,保護率可達到79.6%;毛然然等[12]將嗜水氣單胞菌外膜蛋白OprM原核表達并進行免疫保護作用評價,發現外膜蛋白OprM的保護率可達89.47%;榮娜等[13-14]構建重組菌株并獲取嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5、TolC,發現外膜蛋白P5對嗜水氣單胞菌的魚類保護率為69%,TolC則在抗血清滴度1∶6 400時仍具有與嗜水氣單胞菌相互結合的能力。外膜蛋白中脂蛋白定位系統(Localization of lipoprotein system,Lol)負責脂蛋白的轉運與定位,其與生物致病力及耐藥性密切相關[15]。Lol系統由LolA-E 5 個蛋白構成,其中脂蛋白定位系統因子B(Localization of lipoprotein B,LolB)在脂蛋白轉運過程中負責轉運的最后一步,將脂蛋白插入到外膜,是一種重要的外膜蛋白[16]。目前外膜蛋白LolB對魚類的保護性研究缺乏,本文選取LolB蛋白進行探究,期望為后續魚類疫苗研發提供可行性參考。

熒光假單胞菌是革蘭氏陰性菌,其表面分布的外膜蛋白暴露在細胞外,更易激活宿主的免疫系統。Sun等[17]制備熒光假單胞菌外膜蛋白ExbB并評價其被動免疫保護作用,發現ExbB對熒光假單胞菌的保護率可達54%,同時對嗜水氣單胞菌具有交叉免疫保護作用,保護率為38.4%;Liu等[18]構建表達的熒光假單胞菌外膜蛋白PF1380同樣具有交叉被動免疫保護作用,對熒光假單胞菌保護率為57%,對嗜水氣單胞菌的保護率為50%。可見熒光假單胞菌外膜蛋白的免疫原性較好,有疫苗候選潛質。

綜上所述,本研究選擇熒光假單胞菌外膜蛋白LolB對其進行分子克隆原核表達,免疫紅鯽(Carassiusauratus),評價免疫原性,為后續重組蛋白疫苗研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株及供試動物 熒光假單胞菌 ATCC 13525、EscherichiacoliDH5a、BL21菌株及pET-32a質粒由陜西理工大學中德天然產物研究所保存;紅鯽購自漢中市水族館,體表健康,平均體質量約18 g,身長平均約10 cm,試驗前在90 L水箱中飼養兩周,每天換水1/3,飼養用水經過處理,平均水溫(22 ± 2) ℃,飼料(上海傲滋水族科技有限公司)每日供給魚體質量的1%,使用氣泵不間斷供給空氣。

1.1.2 主要試劑 rTaq聚合酶、T4-DNA連接酶、限制性核酸內切酶BamH Ⅰ 及XhoⅠ 購自日本TaKaRa 公司;細菌基因組提取試劑盒購自北京天根試劑公司,質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自杭州博日公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、氨芐西林(Ampicillin,AMP)購自北京索萊寶;TMB顯色液為上海生工公司產品;酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)、免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM,IgM)、過氧化氫酶(Catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自MP生物醫療公司;動物總RNA抽提試劑盒購自上海生物工程有限公司;Evo M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR Green ProTaqHS預混型qRT-PCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;引物合成、基因測序由西安奧科生物公司提供;大鼠抗魚血清為實驗室自制;HRP標記山羊抗大鼠IgG(免疫球蛋白G,Immunoglobulin G)購于Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析 從NCBI(美國國家生物技術信息中心,National center of biotechnology information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲取不同菌株外膜蛋白LolB序列,利用GeneDoc 3.2軟件繪制不同菌株外膜蛋白的氨基酸序列比對圖進行同源性分析,以MEGA 5.0軟件繪制不同菌株系統發育樹,比較不同菌株親緣關系。

1.2.2 重組質粒的構建 NCBI數據庫中查找熒光假單胞菌 ATCC 13525 全基因組,根據全基因組設計lolB的擴增引物。lolB基因登錄號為SNY09892.1,大小為618 bp,上游引物:5′-ACCGGATCCATGTTTTTGCGCCACGTT-3′,下游引物:5′-CCACTCGAGTTATTGCCCCAG CTTGCG-3′,下劃線處為酶切位點。擴增模板為熒光假單胞菌基因組;利用rTaq聚合酶進行擴增,擴增體系為50 μL,預變性溫度、退火溫度與退火時間分別為94 ℃、55 ℃、90 s;對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠純化;使用BamH Ι 與XhoⅠ 對PCR回收產物與pET-32a雙酶切,再對酶切產物(目的片段和載體)進行切膠回收;通過T4-DNA 連接酶將目的片段與載體進行連接,16 ℃連接16 h。將連接后的產物進行E.coliDH5α轉化,轉化成功后提取質粒,即得構建成功的重組質粒。利用雙酶切與基因測序技術鑒定重組質粒,準確無誤后將重組質粒轉化入E.coliBL21中,進行蛋白的原核表達。

1.2.3 重組蛋白的表達與純化 挑取重組單菌落培養8 h,以1∶100轉接至新的含氨芐青霉素液體培養基,培養至OD600=0.5后用0.1 mol/L的IPTG誘導8 h。完成后取1 mL菌液并離心收菌,加入300 μL的2×SDS上樣緩沖液后于沸水中煮5 min,通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測目的蛋白的表達;重組菌株成功構建后,吸取重組菌液以1∶100轉接至新的600 mL含氨芐青霉素的液體培養基,培養至OD600=0.5后用0.1 mol/L的IPTG誘導8 h,結合包涵體洗滌和SDS-PAGE蛋白電泳切膠法純化目的蛋白,凍干后-80 ℃保存,備用。

1.2.4 蛋白誘導表達條件的優化 采用L9(34)正交試驗模型探究目的蛋白的最佳表達條件。主要分為以下步驟:將過夜培養的蛋白表達菌液以1∶100的比例接入600 mL培養液中,按照要求(表1)加入不同濃度的IPTG,按照不同溫度與時間培養至設定的OD600值,每組進行3次重復。取1 mL誘導菌液,離心收菌后菌體加入300 μL 2×SDS 蛋白上樣緩沖液,沸水浴5 min,SDS-PAGE電泳獲得不同誘導條件下的LolB蛋白表達圖譜。通過軟件Phoretix 1D和SPSS 22.0分別對表達圖譜光密度和因子進行顯著性分析。

表1 蛋白表達條件正交試驗Table 1 Factors and levels of orthogonal test for protein expression condition

1.2.5 紅鯽LolB多克隆抗體制備、特異性與效價檢測 試驗組與對照組各15條紅鯽,試驗組按照2 μg/g體質量的LolB蛋白劑量進行免疫,蛋白溶液與福氏不完全佐劑按照1∶1的比例混合,置于搖床中過夜乳化,腹腔注射免疫紅鯽(每尾40 μL),對照組注射無菌水;14 d后進行第2 次免疫,21 d后進行第3 次免疫,操作同上,免疫完成后7 d,紅鯽尾靜脈取血,血液4 ℃靜置2 h, 4 ℃、3 000 r/min離心10 min獲取血清。免疫印跡(Western blotting)夾心法驗證LolB紅鯽血清抗體特異性,步驟如下:將熒光假單胞菌全蛋白進行SDS-PAGE電泳;將硝酸纖維素(Nitrocellulose membrane,NC)膜置于電轉槽中,80 V電轉1 h,隨后將NC膜于脫脂牛奶中充分封閉;將封閉好的NC膜在不同稀釋倍數的紅鯽血清(1∶100, 1∶200)中于37 ℃中孵育40 min,隨后用TBST溶液洗滌3 次,每次10 min;隨后于 1∶400的大鼠抗魚血清中孵育,具體步驟同上;再于1∶3 000山羊抗大鼠抗體中孵育,完成后TBST溶液10 min洗滌3 次,利用DAB進行顯色并確定抗原-抗體的結合。

1.2.6 紅鯽免疫活性及抗氧化指標的檢測 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后7 d,尾靜脈取血,對血清中ACP、AKP、LZM和IgM進行測定,免疫因子對機體免疫功能的激活具有參考意義。第3 次免疫后7 d對紅鯽攻毒熒光假單胞菌,3 d后取血,血清中SOD、CAT、GSH-Px和MDA的含量測定對機體抗氧化自由基的能力具有參考意義。本試驗采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定,按說明書步驟進行。

1.2.7 細胞吞噬試驗 紅鯽第3次免疫LolB蛋白后7 d,尾靜脈取血,魚血漿(加抗凝劑)200 μL和1%甲醛生理鹽水滅活的金黃色葡萄球菌(6×108cfu/mL)200 μL混合,25 ℃水浴60 min(每10 min振蕩混勻1 次);隨后制作血涂片,用快速姬姆薩染色試劑盒(上海生工)進行染色,油鏡下觀察吞噬細胞,計數吞噬細胞中金黃色葡萄球菌,SPSS 22.0檢測顯著性。吞噬百分數(PP)=(發生吞噬的吞噬細胞數/所觀察的吞噬細胞)×100%;吞噬指數(PI)=(巨噬細胞吞噬的金黃色葡萄球菌數/參與吞噬的吞噬細胞數)×100%[19]。

1.2.8 體外模擬魚血清對熒光假單胞菌的免疫識別作用 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后7 d,尾靜脈取血。酶聯免疫吸附測定法[20](Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測魚血清與熒光假單胞菌的相互作用。步驟簡述如下:將熒光假單胞菌培養至OD600約1.0后將菌體離心并洗滌;生理鹽水調整OD600至1.0(菌濃度109cfu/mL),分裝菌體每管150 μL,再與不同稀釋倍數的血清(1∶100,1∶200,1∶400,1∶800, 1∶1 600,1∶3 200),對照為陰性血清,37 ℃條件下孵育90 min,再與1∶400的大鼠抗魚血清(實驗室自制)孵育90 min;最后與1∶3 000羊抗大鼠抗體孵育1 h。將洗滌好的菌體與20 μL PBS混合后加入酶標板,再加入200 μL的TMB顯色液;再用50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應,450 nm讀數。

1.2.9 實時熒光定量法檢測紅鯽炎癥因子 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌, 3 d后取組織(腎、脾、鰓),液氮靜置30 min預冷,研磨至粉碎,TRIzol法提取總RNA,Evo M-MLV反轉錄試劑盒反轉為cDNA,利用SYBR Green ProTaqHS試劑盒和實時熒光定量基因擴增儀(CFX96)進行熒光定量檢測,具體設置如下。預變性溫度95 ℃,30 s(初始1 個循環);變性95 ℃,5 s,退火-延伸60 ℃,30 s(40 個循環)。實時熒光定量基因擴增儀上查看炎癥因子IL-1β和TNF-α表達情況,SPSS 22.0分析顯著性。

1.2.10 組織病理學觀測 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌,3 d后取組織(腎、脾、腸)。病理切片主要分為3 個步驟,即組織包埋、組織切片與H&E染色。組織包埋:將取出的組織立即浸泡在改良的Davidson’s[21]固定液中,固定18～24 h后轉入10%甲醛溶液中繼續固定;將固定好的組織于梯度濃度(80%,90%,95%,100%)的乙醇中脫水,放入二甲苯中透明;將透明好的組織于60 ℃的石蠟中浸泡,再將組織包埋于折疊好的模具中。切片:將包埋好的組織修正成約1 cm3的立方體,石蠟切片機切成厚度為4 μm的切片,將其附著于載玻片上,烘干。H&E染色:使用蘇木素與伊紅進行染色。首先將烘干的切片放入二甲苯中脫蠟;再于梯度濃度的乙醇中復水,復水結束后蘇木素染色30 s,使細胞核上色,伊紅染色20 min,使細胞質著色。繼續于梯度濃度的乙醇中脫水,在二甲苯中透明,最后用中性樹脂封片,完成后置于37 ℃恒溫箱過夜,以備觀察。

2 結果與分析

2.1 同源性與系統發育分析

在NCBI上獲取不同菌種的外膜蛋白氨基酸序列,利用GeneDoc 3.2軟件繪制同源分析圖,對氨基酸序列進行BLAST比對,結果顯示,熒光假單胞菌的LolB蛋白序列作為母本,乳酸假單胞菌的LolB蛋白序列相似度達到94.63%,卡尼斯假單胞菌為94.63%,奧加拉假單胞菌為 87.32%,大腸桿菌為28%,嗜水氣單胞菌為 28.16%,副溶血弧菌為28.85%,奧奈達希瓦氏菌為26.24%,可見,假單胞菌蛋白質序列相似度明顯高于其他菌(圖1);利用MEGA 5.0軟件繪制菌株進化樹,結果顯示假單胞菌屬間親緣關系較近(圖2)。結合同源分析圖、BLAST序列比對、菌種發育樹,發現熒光假單胞菌外膜蛋白LolB可能對不同假單胞菌具有交叉免疫保護作用。

圖1 氨基酸同源性分析Fig.1 Amino acid homology analysis

圖2 系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree

2.2 重組質粒的構建及蛋白的純化

PCR擴增獲得lolB基因,在600 bp左右處有單一且清晰的條帶(圖3-A),與NCBI公布的理論值相同;重組質粒pET-32a-lolB經過BamH Ι 與XhoΙ 雙酶切鑒定,在600 bp左右獲得條帶,與理論值相同(圖3-B),證明重組質粒構建成功。重組質粒經E.coliBL21轉化,IPTG誘導后,利用包涵體洗滌與SDS-PAGE切膠法純化后在42 ku處獲得LolB蛋白(圖3-C)。

A.PCR擴增lolB基因; B.重組質粒pET-32a-lolB的雙酶切; C.LolB蛋白的表達純化.M1.DNA Marker; M2.蛋白Marker; 1.lolB基因; 2.重組質粒pET-32a-lolB; 3.BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切; 4.未誘導菌株; 5.誘導菌株; 6.純化的LolB蛋白

2.3 蛋白表達條件的優化

設計L9(34)正交試驗模型,探索熒光假單胞菌外膜蛋白LolB的最佳誘導表達條件,每組條件3個重復,結果顯示,不同誘導條件下蛋白質的表達有差異(圖4),利用Phoretix 1D軟件進行光密度分析(表1),再利用SPSS 22.0軟件極差分析數據,最終獲得最佳表達條件:A3B2C1D3(誘導溫度37 ℃,菌液濃度OD600=0.8,IPTG終濃度0.1 mmol/L,誘導時間12 h);顯著性分析顯示,誘導溫度、誘導時間對蛋白表達影響顯著(表1)。

A,B,C為3 次重復;M.蛋白質Marker;1.未誘導菌株;2～4.誘導溫度為28 ℃,OD600分別為0.5,0.8,1.0; 5～7.誘導溫度30 ℃,OD600分別為0.5,0.8,1.0;8～10.誘導溫度為37 ℃,OD600分別為0.5,0.8,1.0; 2,7,9.IPTG濃度為0.1 mmol/L; 3,5,10.IPTG濃度為0.3 mmol/L;4,6,8.IPTG濃度為0.5 mmol/L; 2,6,10.誘導時間為3 h;3,7,8.誘導時間為8 h;4,5,9.誘導時間為12 h

2.4 紅鯽抗血清的特異性、效價檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后,獲取血清進行特異性、效價檢測,Western blotting試驗結果發現在22 ku處具有特異性條帶,且LolB抗血清的效價可達1∶200(圖5)。

M.蛋白質 Marker; 1.陰性對照; 2.血清稀釋倍數為 1∶100; 3.血清稀釋倍數為1∶200

2.5 紅鯽抗血清與熒光假單胞菌的免疫識別作用

ELISA試驗結果表明,LolB抗血清與熒光假單胞菌在體外具有相互識別作用,且抗體滴度在1∶3 200仍具有識別作用(圖6)。

圖6 紅鯽抗血清與熒光假單胞菌體外相互識別Fig.6 Mutual recognition between C.auratusserum and P.fluorescens in vitro

2.6 紅鯽免疫相關因子檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后,獲取血清檢測免疫因子(AKP、ACP、LZM、IgM),結果顯示均呈上升趨勢(圖7),大多數達到顯著性(P<0.05),表明LolB蛋白激活了紅鯽的非特異性免疫。

*表示P<0.05; **表示P<0.01; NC表示對照組; 圖8,9同

2.7 紅鯽細胞吞噬作用

紅鯽免疫后獲取血漿,細胞吞噬作用結果(表2)顯示免疫后吞噬百分數和吞噬指數呈上升趨勢,且吞噬百分數達到極顯著升高(P<0.01)。

表2 紅鯽免疫血漿細胞吞噬作用Table 2 Phagocytosis of immune plasma cell in C.auratus

2.8 熒光假單胞菌攻毒紅鯽抗氧化因子檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌,獲取血清檢測抗氧化因子(CAT、SOD、MDA、GSH-Px),結果(圖8)顯示血清抗氧化指標較對照組大部分呈降低趨勢,表明免疫LolB蛋白對熒光假單胞菌感染具有一定的抗氧化保護作用。

圖8 熒光假單胞菌攻毒紅鯽后血清抗氧化因子指標檢測Fig.8 Detection of serum antioxidant factor in C.auratu after challenge with P.fluorescens

2.9 熒光假單胞菌攻毒紅鯽炎癥因子檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌, 3 d后取組織(腎、脾、鰓),采用熒光定量PCR法進行檢測,結果顯示炎癥因子均呈下降趨勢,脾臟的IL-1β下降趨勢達到顯著性,腎臟的TNF-α下降趨勢達到極顯著性(圖9)。

圖9 熒光假單胞菌攻毒紅鯽后炎癥因子檢測Fig.9 Detection of inflammatory factor after invasion of C.auratu by P.fluorescens

2.10 熒光假單胞菌攻毒紅鯽病理切片觀測

紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌, 3 d后取組織(腎、脾、腸)進行病理學切片;對照組腎臟結構不完整,腎小球退化、組織間隙增大;脾臟細胞密度減少、細胞核損傷、細胞凋亡;腸道結構松散、細胞游離、細胞邊界界限不規則。紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌組織形態較為完好(圖10)。

3 討 論

熒光假單胞菌是魚類養殖的主要病原菌之一,生物信息分析發現熒光假單胞菌外膜蛋白LolB在假單胞菌屬間同源性較高,進化樹圖譜也發現假單胞菌屬間親緣關系較近。史姿聰等[22]生物信息預測鴨源雞桿菌tolC基因多菌種間同源性較高,最后發現鴨源雞桿菌TolC蛋白是具有交叉免疫保護性的抗原;康超等[23]生物信息學分析嗜水氣單胞菌外膜蛋白AH6169,發現AH6169在氣單胞菌間有較高同源性,最后得出AH6169可為不同種類的氣單胞菌提供交叉免疫保護作用的結論。因此LolB蛋白也可能對不同假單胞菌有交叉保護作用。

分子克隆技術是獲取重組蛋白的一種常見方法。伍娜娜等[24]利用分子克隆成功構建重組菌株獲取大腸桿菌外膜蛋白OmpF。趙亮等[25]利用原核表達系統構建大腸桿菌重組菌株,獲取馬鈴薯V病毒外殼蛋白。筆者也采用分子克隆技術構建熒光假單胞菌外膜蛋白LolB的重組表達菌株,通過SDS-PAGE電泳檢測重組外膜蛋白的誘導表達情況,采用包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法純化獲得純度較高的重組蛋白。本文通過分子克隆成功構建pET-32a-lolB重組菌株,發現最佳誘導表達條件為:OD600=0.8,IPTG=0.1 mmol/L,溫度為37 ℃培養12 h,為LolB蛋白的批量獲取奠定基礎。

多克隆抗體制備常采用動物免疫法,因其具有操作簡便和制備周期短的優點而被廣泛使用。劉望等[26]用嗜水氣單胞菌外膜融合蛋白免疫斑馬魚,成功制備魚抗血清;Khushiramani等[27]純化Omp48蛋白并免疫兔子,成功獲得兔抗血清。本文也采用動物免疫法制備多克隆抗體,通過對紅鯽免疫LolB蛋白,成功制備紅鯽LolB抗血清,可為后續免疫學試驗奠定基礎。

魚體的非特異性免疫應答可防御外界入侵[28-29],魚類血液是機體進行免疫反應的重要場所,血清相關指標的檢測可間接解釋不同免疫原對魚體的影響情況[30]。趙林輝等[31]對鯉魚免疫OmpA、FlaA重組蛋白,發現血清中AKP、IgM等指標上升;馬少鴻[32]對魚體免疫flgE蛋白,發現血清中lZM、IgM等指標上升,說明激活了魚體的非特異免疫。本文對紅鯽抗血清進行免疫因子檢測,發現免疫組均高于對照組,且AKP、LZM、IgM達到顯著水平。江葉舟等[33]對鼠類過表達miR-223進行研究,發現細胞吞噬是機體非特異性免疫的重要指標;趙娜等[34]對牙鲆進行海豚鏈球菌胞外產物免疫后,其吞噬指標上升。本文也發現紅鯽免疫LolB蛋白組相較未免疫蛋白組,其吞噬百分比和吞噬指數均存在上升趨勢,且吞噬百分數達到極顯著水平。孫薇等[35]利用 Western blotting 發現免疫外膜蛋白的動物血清和熒光假單胞菌具有特異性結合;榮娜等[13]利用Western blotting和ELISA對P5魚抗血清進行評價,顯示P5抗血清可與嗜水氣單胞菌特異性結合,ELISA顯示P5抗血清與嗜水氣單胞菌存在識別作用。本文也對紅鯽LolB抗血清與熒光假單胞菌全蛋白進行Western blotting,結果發現LolB抗血清與熒光假單胞菌全蛋白特異性結合,效價比達到 1∶200。紅鯽LolB抗血清與熒光假單胞菌進行ELISA模擬體外相互識別,結果識別滴度達1∶3200。免疫因子、吞噬指數和吞噬百分數的上調確定LolB蛋白具有增強機體免疫力的效果,Western blotting確定紅鯽LolB抗血清和熒光假單胞菌可以特異性結合,結合ELISA試驗確定紅鯽LolB抗血清和熒光假單胞菌可以相互識別,表明魚體的非特異免疫已被激活。

蛋白保護原對動物感染致病菌的保護效果可以通過抗氧化因子、炎癥因子以及病理學切片來綜合評價。抗氧化因子是轉化機體自由基的一類抗氧化關鍵酶,其代謝水平可以間接反應機體損傷程度,Liu等[36]對小鼠免疫大腸桿菌外膜蛋白OmpA后對后攻毒大腸桿菌,發現小鼠MDA、SOD等因子下調,減輕大腸桿菌對小鼠肝臟和腎臟的損傷;劉嬌等[37]對鴨糧添加葡萄糖氧化酶后攻毒大腸桿菌,發現MDA、DAO活性和D-LA含量呈下降趨勢,減少了細菌內毒素的產生。本文對攻毒紅鯽血清中進行檢測,抗氧化因子多數呈降低趨勢,其中MDA、GSH-Px達到極顯著水平。炎癥因子是機體炎癥反應中出現的一類炎癥介質,黃瑞玲等[38]對白羽雞人工感染禽腺病毒血清4型,IL-1β等因子呈上升趨勢,攻毒會促進外周血炎癥因子的釋放,炎癥因子水平的高低可反應機體炎癥的嚴重程度;楊光等[39]通過蒼術內酯Ⅱ對骨關節炎大鼠軟骨損傷的研究,發現蒼術內酯Ⅱ可降低炎癥因子IL-1β、TNF-α等水平,得出蒼術內酯Ⅱ降低氧化應激及炎癥反應從而緩解OA模型大鼠軟骨損傷的結論。本文對紅鯽攻毒組織采用實時熒光定量PCR法進行檢測,發現魚體試驗組中的IL-1β、TNF-α表達量均低于對照組,表明蛋白保護原對感染熒光假單胞菌起到降低炎癥的效果。研究人員普遍認為組織病理學切片可區分出患病和正常的組織細胞[40],蘭蕾等[41]對艾煙染毒后大鼠的心、肝、脾、肺等臟器組織進行組織病理學切片觀察,發現染毒后均有損傷;王振軍等[42]建立貂細小病毒病動物模型,通過組織病理學切片發現感染致病菌后貂的內臟有損傷。本文通過組織病理學切片觀測到,與對照組相比,蛋白免疫組攻毒后細胞形態較為完好,表明免疫LolB蛋白對感染熒光假單胞菌具有一定的保護功能。

綜上所述,本文通過分子克隆構建重組菌株獲取LolB蛋白,正交試驗探索蛋白表達優化條件。紅鯽免疫LolB蛋白制備多克隆抗體,通過免疫因子和吞噬活性發現LolB蛋白可以激活紅鯽的非特異性免疫,通過Western blotting和體外模擬識別發現熒光假單胞菌可以與LolB抗血清特異性識別與結合,通過切片和炎癥因子發現其對魚體有保護臟器和降低炎癥的效果,故LolB蛋白對感染熒光假單胞菌有一定的保護作用,有作為防治水產病害疫苗的潛力。