阿魏酸在煙曲霉菌誘導人角膜上皮細胞中的抗炎作用

張颯颯,魯葉慧,熊翌宏,楊珊珊,吳媛,彭旭東

(1 青島大學附屬醫院眼科,山東 青島 266003; 2 湖北醫藥學院藥護學院)

煙曲霉菌是一種常見的真菌性角膜炎的致病真菌[1],可黏附于角膜上皮從而免于宿主的免疫清除[1-2]。真菌感染時,各種免疫細胞在真菌清除方面發揮重要防御作用[3-4];但是其引發的過度炎癥反應會加重組織損傷[5-6]。目前臨床除了常用藥物外[7],還需要尋找安全高效的抗炎藥物實現抗真菌聯合免疫治療。阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸, FA)是一種酚類化合物,可溶于二甲基亞砜(DMSO),它具有抗炎[8-9]、抗氧化[10]、肝臟保護[11]等功效。LAMPIASI等[12]研究發現,FA在脂多糖(LPS)刺激的小鼠RAW264.7細胞中發揮抗炎作用。最近CAO等[8]研究發現,FA可降低促炎因子表達,改善肝損傷的預后,在乙醇性肝損傷中起保護作用[13]。本研究旨在探討FA在煙曲霉菌誘導的炎癥中的抗炎作用,為真菌性角膜炎的治療提供新思路?，F將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人角膜上皮細胞(HCEC)由廈門眼科實驗室饋贈,將其接種到10 cm細胞培養皿中,在含有體積分數0.10 胎牛血清的DMEM培養基中培養(37 ℃,含體積分數0.05 CO2培養箱)。煙曲霉菌(CPCC 3.0772)購自中國微生物菌種保藏中心(SGMCC);FA(100 mg,純度98%)由麥克林試劑公司提供,用體積分數0.001的DMSO溶解后以100 mmol/L儲備液存放于-80 ℃;RNAex pro reagent裂解液由艾科瑞生物公司提供;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒由Biolegend公司提供;HiScript Ⅲ RT SuperMix(南京諾唯贊生物公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1煙曲霉菌絲制備 將煙曲霉菌接種到沙氏液體培養基中培養48～72 h(37 ℃,含體積分數0.05 CO2培養箱),待培養基中覆蓋白色絨毛團塊狀菌落,將菌落轉移至玻璃研磨棒中研磨至勻漿狀態,加入體積分數0.75乙醇滅活(4 ℃,48 h)后得到滅活煙曲霉菌絲,使用血細胞計數器計數并調整菌絲濃度至1×1011CFU/L后用于體外細胞實驗。

1.2.2FA溶液制備 用無菌PBS將FA溶液稀釋至實驗需要濃度(0～300 μmol/L)用于后續實驗,FA溶液中DMSO含量低于1‰。

1.2.3CCK-8細胞毒性實驗檢測HCEC存活率96孔板中加入HCEC,達到80%融合時,向細胞中加入新的DMEM細胞培養液或含不同濃度FA(0～300 μmol/L)的DMEM細胞培養液,繼續孵育24 h(37 ℃,含體積分數0.05 CO2培養箱),棄去培養液并加入PBS洗去懸浮細胞及藥物殘留。向96孔板中分別加入100 μL的DMEM細胞培養液和10 μL CCK-8檢測試劑,37 ℃孵育2 h。使用酶標儀檢測各孔450、600 nm波長處吸光度并計算細胞存活率。

1.2.4實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測HCEC中炎癥因子及核因子E2相關因子2(Nrf2)mRNA表達 將細胞加入12孔板或96孔板,隨機分為空白對照組(A組)、單純FA處理組(B組)、單純加菌處理組(C組)和加菌+FA處理組(D組),向HCEC加或不加FA(終濃度250 μmol/L)預處理2 h,并向每孔中加入滅活煙曲霉菌菌絲(1×1011CFU/L)60 μL培養24 h(37 ℃,含體積分數0.05 CO2培養箱)。吸棄培養液并加入PBS洗滌3次,各孔中加入500 μL RNAex pro reagent裂解液,充分研磨并轉移入EP管中提取總RNA。采用RNA紫外線可見光度法(Nanodrop 2000,Thermo Fisher)測定總RNA濃度,應用HiScript Ⅲ RT SuperMix處理RNA樣本并逆轉錄為cDNA。根據產品說明書方法向cDNA樣本中加入DEPC水和SYBR預混液,進行RT-PCR分析(QuantStudioTM5 實時熒光定量 PCR 系統,Thermo Fisher)。RT-PCR的引物及其序列見表1。

表1 RT-PCR基因引物及其序列

1.2.5ELISA法檢測HCEC炎癥因子IL-6及單核細胞趨化蛋白(MCP-1)蛋白表達水平 根據1.2.4方法將HCEC分組并處理,4 ℃、5 000 r/min離心后取上清液并轉入新的EP管中,應用ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法檢測各組IL-6和MCP-1蛋白表達水平,按試劑盒說明進行操作。酶標儀檢測450 nm及570 nm波長處吸光度,以其表示IL-6和MCP-1蛋白表達水平。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 不同濃度FA溶液對HCEC活力的影響

不同濃度的FA(0、50、100、150、200、250及300 μmol/L)與HCEC共孵育24 h后,300 μmol/L FA溶液處理組HCEC存活率低于其他各組,差異均有統計學意義(n=6,F=5.390,P<0.05)。250 μmol/L及以下濃度FA溶液處理組的HCEC存活率與正常對照組(N組)相比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。后續實驗選擇250 μmol/L作為研究濃度。

圖1 不同濃度FA處理組HCEC存活率比較

2.2 FA對煙曲霉菌誘導的HCEC炎癥因子以及Nrf2 mRNA表達的影響

RT-PCR法檢測結果顯示,FA處理(FFA=7.195～18.560,P<0.01)、滅活菌絲處理(FAF=23.130～141.468,P<0.001)、FA與滅活菌絲處理產生的交互效應(FFA×AF=8.731～18.536,P<0.01)對HCEC炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達的影響均有統計學意義。單獨效應結果顯示,不用滅活菌絲處理時,FA處理和不處理對mRNA的表達均無影響(P>0.05);用滅活菌絲處理時,FA處理組的IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達較不處理組明顯降低(F=15.889～47.471,P<0.001)。不用FA處理時,滅活菌絲處理和不處理對IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達的影響均有統計學意義(F=30.141～94.603,P<0.001);用FA處理時,滅活菌絲處理和不處理相比,各因子mRNA表達水平差異均有統計學意義(F=4.720～23.860,P<0.05)。雙因素析因方差分析還顯示,FA處理(FFA=4.860,P<0.05)及滅活菌絲處理(FAF=37.652,P<0.05)對Nrf2mRNA表達影響有統計學意義;但FA與滅活菌絲處理無交互效應(FFA×AF=2.757,P>0.05)。見表2。

表2 FA對IL-1β、IL-6、TNF-α和Nrf2 mRNA表達的影響

2.3 FA對煙曲霉菌誘導的HCEC中IL-6以及MCP-1蛋白表達的影響

ELISA方法檢測結果顯示,FA處理(FFA=299.155、388.573,P<0.01)、滅活菌絲處理(FAF=421.591、809.406,P<0.01)、FA與滅活菌絲處理產生的交互效應(FFA×AF=258.206、298.778,P<0.01)對IL-6及MCP-1蛋白表達的影響均有統計學意義。單獨效應結果顯示,不用滅活菌絲處理時,FA處理和不處理對IL-6及MCP-1蛋白的表達均無影響(P>0.05);用滅活菌絲處理時,FA處理較不處理IL-6及MCP-1蛋白表達均明顯降低(F=556.608、684.406,P<0.01)。不用FA處理時,滅活菌絲處理和不處理對IL-6及MCP-1蛋白表達的影響差異均有顯著性(F=715.097、990.964,P<0.01);用FA處理時,滅活菌絲處理和不處理相比,IL-6及MCP-1蛋白表達水平差異均有統計學意義(F=5.273、76.648,P<0.05)。見表3。

表3 FA對IL-6及MCP-1蛋白表達的影響

3 討 論

真菌性角膜炎是導致病人眼部潰瘍、穿孔甚至失明的一種嚴重的眼部感染性疾病[14]。在亞洲發展中國家的真菌感染中,絲狀真菌感染占據主導地位[15]。植物性角膜損傷、角膜接觸鏡的使用及局部類固醇的使用已被公認為真菌性角膜炎的主要危險因素[15]。真菌侵入宿主角膜組織后,真菌細胞壁上的病原體相關分子模式受體通過釋放毒素攻擊受損的角膜組織,并被宿主先天免疫細胞表達的模式識別受體識別[16]。這一相互作用誘導細胞因子和趨化因子的產生及釋放[17],并招募中性粒細胞及巨噬細胞向感染灶聚集[18],真菌釋放的細胞毒性物質及免疫細胞聚集引發的過度炎癥反應使得真菌性角膜炎潰瘍愈合緩慢、預后不良。真菌性角膜炎的發病率逐年增高,亟待找到新的治療藥物。

FA為從當歸、川芎、赤芍等中草藥中提取的一種酚酸類化合物,相關研究發現它具有抗氧化[19]、抗炎[20]、抗凋亡[9]、抗菌[21]、心肌保護[22]及神經保護[23]等藥理作用。ERMIS等[24]研究發現,在吲哚美辛誘導的大鼠胃潰瘍模型中,FA通過抑制中性粒細胞浸潤及降低炎癥因子IL-6及TNFα的表達,減輕胃黏膜充血、出血及潰瘍的嚴重程度,從而改善大鼠胃潰瘍的預后。而FA在真菌性角膜炎中的作用尚未見報道。本文研究結果顯示,250 μmol/L FA對HCEC的活性沒有影響,因此250 μmol/L FA可作為安全濃度用于后續實驗。

真菌性角膜炎早期通過招募固有免疫細胞產生炎癥反應,發揮對真菌的清除作用,但持續的炎癥反應會加重組織的損傷[25]。中性粒細胞等免疫細胞的持續激活和招募會進一步導致更多的炎癥因子及趨化因子的產生和釋放[26],這不利于真菌性角膜炎的預后。本文RT-PCR檢測結果表明,加菌刺激組炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達顯著,即在真菌感染早期炎癥因子如IL-1β、IL-6及TNF-α等表達增加,從而誘導炎癥細胞的浸潤及釋放多種炎癥遞質進一步放大炎癥反應來抵御真菌;而加菌處理后給予FA治療可以顯著抑制HCEC中IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA的表達,從而減輕相關炎癥反應。LI等[27]研究發現,在LPS誘導的人HMC3小膠質細胞的神經炎癥模型中,FA通過抑制IL-1β、TNF-α及一氧化氮的產生及表達發揮抗神經炎癥作用。本文研究結果與其相一致。為了進一步確認FA在煙曲霉菌刺激的HCEC中的抗炎作用,本研究應用ELISA方法檢測IL-6及MCP-1蛋白表達,結果顯示,250 μmol/L的FA能夠顯著抑制煙曲霉菌刺激的HCEC炎癥反應中IL-6及MCP-1蛋白表達上調。有研究顯示,在乙醇誘導的C57BL/6小鼠肝損傷模型中,FA可以顯著降低丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶的血清酶活性,減少乙醇刺激后小鼠肝臟細胞細胞質的空泡性壞死及炎癥細胞的浸潤,抑制MCP-1和IL-6的表達,減輕乙醇對小鼠肝臟的損害[13]。本文研究結果與其相一致。提示FA可以通過下調真菌性角膜炎炎癥因子及趨化因子的過度表達來改善真菌性角膜炎的炎癥反應。

在真菌性角膜炎病程中,在控制真菌感染后期炎癥反應的同時可以著力促進角膜上皮的修復,從而改善真菌性角膜炎的預后。已有研究顯示,Nrf2不僅可以抑制促炎因子及炎癥標志物的過表達,還可以通過與血紅素氧合酶(HO-1)啟動子抗氧化反應元件結合上調HO-1的表達,從而進一步抑制促炎因子的過表達,提示Nrf2/HO-1信號通路在炎癥反應中發揮負調控作用[28-29]。我們實驗室早先的研究發現,萜類化合物紫蘇醛、衣康酸二甲酯及沒食子酸可通過增加Nrf2和HO-1的表達,抑制IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等炎癥因子的表達,在真菌性角膜炎中發揮強大的抑炎作用[26,30]。而FAN等[26]的研究結果顯示,紫蘇醛通過Nrf2/HO-1信號通路下調IL-1β、IL-6及TNF-α的表達水平從而發揮強大的抗炎作用。其研究還發現,在煙曲霉菌感染的早期Nrf2表達水平上調,參與煙曲霉菌感染的免疫應答,且Nrf2/HO-1信號通路可通過抑制下游炎癥因子的表達水平發揮抗炎作用。本文研究結果顯示,單純加菌處理組Nrf2mRNA的表達增加,而加菌加FA處理組Nrf2mRNA表達相較于單純加菌處理組顯著上調。由此我們認為,在煙曲霉菌刺激的HCEC中,FA通過增加Nrf2的表達水平發揮抗炎作用。

綜上所述,FA能夠通過增強Nrf2的表達和調控炎癥因子及趨化因子的表達,減輕煙曲霉菌感染后HCEC的炎癥反應。以后的研究可能傾向于探討FA在體內外煙曲霉菌感染模型中發揮抗炎作用的多種機制,以期推進FA用于真菌性角膜炎治療的臨床研究。