血根堿在小鼠煙曲霉菌性角膜炎中的抗炎作用

魯葉慧,欒軍杰,劉星,吳瑗,林靜

(青島大學附屬醫院眼科,山東 青島 266003)

真菌性角膜炎是一種嚴重的角膜感染性疾病,在亞洲和非洲等發展中國家發病率高[1]。絲狀真菌如煙曲霉菌和鐮刀菌是誘發真菌性角膜炎的主要原因,一旦其分生孢子透過角膜上皮進入到基質,孢子會迅速萌發,誘發癥狀。目前,真菌性角膜炎的一線治療是局部使用那他霉素、伏立康唑、兩性霉素B等藥物[2],但這些藥物存在水溶性差、滲透性差及嚴重的不良反應,因此亟待開發可用于臨床的低毒高效的治療藥物。血根堿(SAN)為一種季銨鹽類苯并菲啶生物堿,是來源于血根草、大白屈菜和博落回的一類重要的天然異喹啉生物堿[3-4]。 SAN具有多種藥理活性,包括抗腫瘤、抗菌、抗炎和改善心血管功能等[5-9]。最近的研究顯示,在大鼠的神經源性疼痛模型中,SAN可以通過抑制白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)等炎癥因子的表達來減輕疼痛[10-12]。SAN在急、慢性炎癥中發揮抗炎作用。但是SAN能否在真菌性角膜炎中發揮抗炎作用尚未見報道。本研究旨在探討SAN對煙曲霉菌感染的巨噬細胞及小鼠角膜炎癥的調節作用,為治療真菌性角膜炎提供一種新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠來源的RAW264.7巨噬細胞系購于中國科學院細胞庫(上海)。實驗所用40只8周大小健康的C57BL/6雌鼠購于山東濟南朋悅有限公司,體質量20～30 g,按照青島大學附屬醫院動物委員會批準的方案飼養。SAN(100 mg,純度98%)由麥克林試劑公司提供,用體積分數0.001的DMSO溶解后以2 g/L儲備液-20 ℃儲存;RNAex pro reagent裂解液(艾科瑞生物工程有限公司);酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(Biolegend公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天,中國);煙曲霉菌(CPCC 3.0772,中國普通微生物菌種保藏管理中心(北京))。

1.2 研究方法

1.2.1煙曲霉菌絲制備 煙曲霉菌絲及滅活煙曲霉菌絲制備方法基于本實驗室原有步驟,進行優化[13]。將煙曲霉標準菌株接種于酵母膏胨葡萄糖培養液(葡萄糖10 g、蛋白胨100 g、酵母5 g溶解于雙蒸水中定容1 L),置35 ℃培養箱孵育4～7 d后于超凈工作臺研磨菌絲至20～30 μm大小,一半經3次離心后重懸,用DMEM稀釋至1×1011CFU/L;另一半浸泡于體積分數0.75乙醇中,24 h后重復前述步驟,獲得滅活煙曲霉菌用于后續實驗。

1.2.2CCK-8實驗檢測SAN對RAW264.7細胞活力的影響 RAW264.7細胞以4×108CFU/L接種于96孔板中,孵育12 h至細胞密度約70%更換含SAN(濃度分別為0、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/L)培養液,繼續孵育24 h后,以無菌PBS洗滌3次,更換含CCK-8的培養液繼續孵育2 h后,使用酶標儀(PerkinElimer, 美國)測各孔450、600 nm波長處的吸光度值。每個樣本設5個復孔,實驗重復3次。

1.2.3小鼠分組及處理 32只健康小鼠隨機分為N組、500.0 μg/L SAN處理組(SAN組)、AF處理組及AF+500.0 μg/L SAN處理組(AS組),每組8只,每只小鼠的右眼為實驗眼,左眼為空白對照眼。建模:AF組和AS組小鼠腹腔注射80 g/L水合氯醛約0.08 mL后,用手術無菌刀片刮除中央角膜上皮形成約2 mm×2 mm缺損區域,做井字劃痕、涂抹煙曲霉菌、覆蓋光滑的角膜接觸鏡并縫合眼瞼,24 h后拆除縫線。N組和AF組小鼠以雙蒸水點眼治療,每次5 μL,每天4次;SAN組和AS組小鼠以500.0 μg/L SAN點眼治療,每次5 μL,每天4次。治療第3天,以頸椎脫臼法處死小鼠,獲得小鼠角膜組織。6只健康小鼠隨機分為AF處理組和AS處理組,建模后分別以雙蒸水和500.0 μg/L SAN點眼治療,每次5 μL,每天4次,治療第3天以頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠眼球。

1.2.4細胞刺激 RAW264.7細胞接種于12孔板,孵育至細胞密度約80%后換液。將細胞分為N組、SAN組、AF組、AS組,AF組及AS組每孔加入60 μL滅活煙曲霉菌絲,2 h后SAN組及AS組加入SAN溶液使SAN終濃度為500.0 μg/L,8 h后收集細胞樣本用于細胞RT-PCR實驗(每組6孔); 24 h后收集細胞上清液,離心后取上清液用于細胞ELISA檢測(每組8孔)。

1.2.5HE染色檢測小鼠角膜中炎癥細胞的浸潤AS處理組(n=3)和AF處理組(n=3)的眼球分別在含OCT包埋劑的EP管(2 mL)中調整至合適位置后迅速液氮凍存,使用Leica冷凍切片機切取角膜中央最大截面處8 μm厚的角膜切片。應用HE染色試劑盒染色,按說明書方法進行操作,自然晾干后中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察小鼠角膜中炎癥細胞浸潤情況。

1.2.6實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測細胞因子的mRNA表達 細胞中加入RNAex pro reagent裂解液后,在冰上裂解0.5 h,用無菌的200 μL黃槍頭刮取細胞收集至2 mL的 EP管中,根據RNAex pro reagent試劑說明書進行逆轉錄,建立2 μg逆轉錄反應體系。使用RT-PCR儀進行擴增反應,以β-actin為內參,檢測巨噬細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α及單核細胞趨化蛋白(MCP-1)的mRNA表達。引物及其序列來自GenBank,由艾科瑞生物有限公司設計及合成。見表1。

1.2.7相關蛋白表達檢測 應用ELISA試劑盒檢測小鼠RAW264.7細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1及小鼠角膜組織中TNF-α和COX-2的蛋白表達,根據試劑盒說明書方法進行實驗。使用酶標儀檢測450 nm及570 nm波長處吸光度。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 不同濃度SAN溶液對巨噬細胞活力的影響

不同濃度的SAN(0、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/L)與RAW264.7細胞共孵育24 h后,1 000.0 μg/L SAN溶液處理組巨噬細胞的存活率低于其他各組,差異有統計學意義(F=2.272,P<0.05)。500.0 μg/L濃度以內的SAN處理組的細胞存活率與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。后續實驗選擇500.0 μg/L作為研究濃度。

與其他濃度組比較,*F=2.272,P<0.05。

2.2 煙曲霉菌對小鼠角膜組織中炎癥細胞浸潤的影響

HE染色觀察結果顯示,感染煙曲霉菌3 d后,500.0 μg/L SAN組和AF組相比,小鼠角膜基質層水腫明顯減輕,炎癥細胞數量顯著減少,組織病理結構更為有序(圖2)。

A:AF組;B:500.0 μg/L SAN組。HE染色, 400倍。

2.3 各組細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1 mRNA 表達水平比較

析因設計的方差分析結果顯示,滅活菌絲處理產生的單獨效應(FAF=131.211～253.824,P<0.01)、SAN處理產生的單獨效應(FSAN=28.794～119.300,P<0.01)、不同滅活菌絲處理組間(F=141.468～360.577,P<0.01)和不同SAN處理組間(F=10.373～18.560,P<0.01)差異均有統計學意義,滅活菌絲處理與SAN處理之間存在交互作用(FAF×SAN=10.566～18.536,P<0.01)。與N組和SAN組相比較,AF組細胞炎癥遞質IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表達水平明顯升高;與AF組相比,AS組炎癥遞質IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表達水平明顯下降,差異均有統計學意義(F=20.939～37.097,P<0.01)。見表2。

表2 SAN對RAW264.7細胞各種炎癥遞質mRNA表達影響

2.4 各組細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1 蛋白表達水平比較

析因設計的方差分析結果顯示,滅活菌絲處理產生的單獨效應(FAF=1 765.400～6 636.850,P<0.01)、SAN處理產生的單獨效應(FSAN=98.002～3 070.111,P<0.01)、不同滅活菌絲處理組間(F=1 490.936～9 367.445,P<0.01)和不同SAN處理組間(F=63.775～1 347.574,P<0.01)差異均具有統計學意義,滅活菌絲處理與SAN處理存在交互作用(FAF×SAN=61.187～1 342.599,P<0.01)。與N組和SAN組相比,AF組中炎癥遞質IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的蛋白表達水平明顯上調;AS組與AF組相比,炎癥遞質IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的蛋白表達水平明顯降低,差異有統計學意義(F=124.949～2 690.170,P<0.01)。見表3。

表3 SAN對RAW264.7細胞炎癥遞質蛋白表達影響

2.5 各組小鼠角膜中TNF-α和COX-2 蛋白表達水平比較

析因設計的方差分析顯示,滅活菌絲處理產生的單獨效應(FAF=1 207.798、1 569.370,P<0.01)、SAN處理產生的單獨效應(FSAN=75.086、260.364,P<0.01)、不同滅活菌絲處理組間(F=942.588、1 554.091,P<0.01)和不同SAN處理組間(F=295.009、356.222,P<0.01)的差異均有顯著性,滅活菌絲處理與SAN處理有交互作用(FAF×SAN=275.643、340.296,P<0.01)。與N組和SAN組相比較,AF組小鼠感染煙曲霉菌3 d后,炎癥遞質TNF-α和COX-2蛋白表達水平明顯升高;AS組與AF組相比,小鼠感染煙曲霉菌3 d后,炎癥遞質TNF-α和COX-2的蛋白表達水平明顯降低,差異有顯著性(F=570.488、696.427,P<0.01)。見表4。

表4 SAN對小鼠角膜中炎癥遞質蛋白表達的影響

3 討 論

真菌性角膜炎是由致病真菌誘導的嚴重眼部感染性疾病,其致病因素中植物劃傷引起的角膜損傷約占40%～60%[14],另外隱形眼鏡的使用[15]、長期使用抗生素或類固醇[16]、既往眼部手術史[17]都是重要的致病因素。當煙曲霉菌首次攻擊宿主時,其毒力決定簇誘發宿主發生強烈的固有免疫反應[10],固有免疫系統包括巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等,是抵御真菌感染的第一道防線;它能夠快速啟動并消除入侵的煙曲霉菌[11]。這種防御機制涉及特異性受體的識別、指示信號通路的激活和多種炎癥遞質的產生,從而加強炎癥反應。但是大量的炎癥遞質可引發嚴重的炎癥反應,會加重感染組織的損傷,使真菌感染的病程延長,產生一系列危險的并發癥如角膜穿孔甚至患眼失明[12]。真菌性角膜炎的發病率逐漸增高,且臨床缺乏有效治療藥物,迫切需要找到新的高效低毒治療藥物。

SAN是一種以苯并菲啶結構為特征的生物堿類天然小分子,具有高效抗炎[18-19]、抗菌[4,7,20]、抗腫瘤[21]等藥理活性。已有研究表明,在大鼠LPS介導的H9c2心肌細胞炎癥反應中,SAN可以通過抑制大鼠H9c2心肌細胞釋放炎癥遞質IL-1β、IL-6和TNF-α發揮抗炎作用[22]。此外有研究顯示,在LPS誘導的小鼠巨噬細胞內毒性休克模型中,SAN通過抑制小鼠巨噬細胞釋放TNF-α及NO發揮抗炎作用[18]。然而,SAN在真菌性角膜炎中是否發揮抗炎作用尚未有報道。炎癥從本質上說是機體的防御反應,在初期往往起到積極作用,例如炎性充血可增加局部組織血流量,使組織得到更多的氧氣、營養物質等,增加組織代謝和抗擊力[23]。但持續的炎癥反應使得巨噬細胞產生過量的炎癥遞質,可能加重角膜損傷;還會導致角膜蛋白沉積,造成角膜水腫甚至角膜穿孔。本研究首先探究SAN在小鼠巨噬細胞中的安全濃度,結果表明500.0 μg/L SAN對小鼠巨噬細胞沒有影響,可作為安全濃度用于后續實驗。本文研究感染第3天的小鼠角膜組織HE染色結果顯示,500.0 μg/L SAN組和AF組相比,小鼠角膜基質層水腫明顯減輕,炎癥細胞數量顯著減少,組織病理結構更為有序。ZHENG等[24]研究顯示,在LPS誘導的小鼠乳腺炎模型中,SAN通過顯著減少LPS引起的中性粒細胞浸潤、減輕腺泡結構的破壞,進而修復血-乳屏障發揮抗炎功能。本文研究結果與其一致。因此,SAN可能通過抑制炎癥反應中的免疫細胞過度激活,對煙曲霉菌性角膜炎起到治療作用。

在真菌性角膜炎中,炎癥細胞過度激活會導致大量的炎癥遞質釋放加重炎癥反應[25]。已有研究證實,IL-1β是參與角膜抗真菌免疫應答的重要炎癥因子,主要由激活的單核細胞產生,介導急性炎癥應答[26]。在右旋糖酐硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型中,SAN通過阻斷NLRP3-(Caspase-1)/IL-1β通路,降低炎癥因子IL-1β的表達,對小鼠結腸炎具有治療作用[27]。本研究結果顯示,SAN能夠明顯抑制小鼠RAW264.7細胞中煙曲霉菌刺激引起的IL-1β基因及蛋白表達升高。提示SAN可能通過抑制IL-1β的表達發揮抗炎作用。炎癥因子TNF-α、IL-6及趨化因子MCP-1為反映角膜炎癥的重要指標,TNF-α、IL-6和MCP-1的表達升高可以介導白細胞募集和巨噬細胞遷移及浸潤[28]。LIN等[29]研究顯示,在吲哚美辛誘導的大鼠腸道炎癥模型中,SAN可以通過降低大鼠腸道組織中TNF-α和IL-6的水平發揮抑炎作用。有研究顯示,在LPS刺激的人單核細胞白血病THP-1細胞系中,SAN可以通過下調炎癥遞質IL-1β、MCP-1和IL-6的基因表達發揮保護作用[30]。本文實驗結果顯示,SAN能顯著減少煙曲霉菌刺激的小鼠巨噬細胞中IL-6、TNF-α和MCP-1的表達。另有研究顯示,在真菌感染宿主后,宿主體內的單核巨噬細胞等會迅速誘導COX-2的表達增加,導致下游的抑炎因子表達被抑制,對角膜炎的預后造成不利影響[31]。本文對真菌性角膜炎小鼠模型研究顯示,SAN能顯著下調COX-2及TNF-α的表達。LI等[19]研究顯示,在LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中,SAN通過抑制COX-2的表達抑制炎癥細胞因子的釋放,進而抑制炎癥反應,降低急性肺損傷小鼠的致死率。本文研究結果與其相一致。因此,應用SAN治療也可以通過減輕真菌性角膜炎中炎癥遞質的過度表達,從而改善真菌性角膜炎的預后。

綜上所述,SAN可以通過減少炎癥細胞的浸潤和下調炎癥遞質的表達,減輕小鼠角膜煙曲霉菌感染后的炎癥反應,有望成為治療真菌性角膜炎的新型藥物。但SAN在真菌性角膜炎中的具體抗炎機制還需要進一步研究。