茶樹4CL基因家族的全基因組鑒定及表達分析

任衛威,高 婷,邵淑賢,侯炳豪,廖獻盛,葉乃興

(福建農林大學 園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室,福州 350002)

茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]是中國重要的葉用經濟作物[1],4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)是植物苯丙烷代謝途徑中,類黃酮生物合成的第一步,同時也是木質素生物合成特異途徑的關鍵酶[2]。pfam數據庫顯示,它有AMP結合酶(PF00501)和AMP結合酶C端結構域(PF13193)2個保守域。此外,4CL還存在2個高度保守的序列,分別是BOX Ⅰ(SSGTTGLPKGV)和BOX Ⅱ(GEICIRG),負責識別、結合和催化反應底物形成相應的輔酶A[3]。對4CL的研究從20世紀70年代初開始,近30年來植物4CL基因已經被從水稻[4]、擬南芥[5]、煙草[6]、大豆[7]、楊樹[8]、覆盆子[9]、桑樹[10]、黑麥草[10]等40多種植物中相繼克隆出來[12]。有研究表明擬南芥中At4CL1、At4CL2、At4CL4參與了木質素的合成[5],At4CL3和水稻中的Os4CL2參與了類黃酮的生物合成。類黃酮化合物是茶樹重要的次生代謝產物,與茶葉品質形成密切相關[14]。朱晨[15]研究表明類黃酮與烏龍茶滋味密切相關,是茶葉苦澀味形成的主要原因;邵淑賢等[16]研究發現類黃酮含量較低是黃觀音滋味醇和的重要原因;此外,類黃酮對提高植物脅迫的抗性具有重要作用;在茶樹中,類黃酮具有清除自由基[14]、逆境脅迫響應[17]等作用。

茶樹品種‘黃棪’(C.sinensis‘Huangdan’)和‘鐵觀音’(C.sinensis‘Tie-guanyin’)原產于福建省安溪縣,是烏龍茶類茶樹育種的核心種質資源[18]。目前,烏龍茶品種‘黃棪’[19]和‘鐵觀音’[20]的單體型染色體級別基因組于2021年5月和7月相繼發布。前人已從福鼎大白茶[21]和舒茶早[22]茶樹品種中克隆出4CL基因,Rain等研究發現Cs4CL表達與類黃酮含量呈正相關[23]。但目前對4CL基因參與茶樹非生物脅迫響應的研究較少,因此本研究運用生物信息學,在全基因組水平上鑒定‘黃棪’和‘鐵觀音’茶樹4CL基因家族,系統分析茶樹4CL的基本結構特點及系統發育,并利用qRT-PCR技術研究茶樹4CL基因家族在GA、MeJA、ABA、低溫和干旱處理下的表達模式,以期對茶樹4CL基因家族參與非生物脅迫響應的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料處理

試驗材料來源于福建農林大學教學茶場,選取長勢基本一致盆栽‘黃棪’茶樹為試驗材料。將環境溫度下的茶樹放入4 ℃恒溫培養箱進行模擬低溫處理;將‘黃棪’茶樹從盆栽中拔出,根部洗凈后放入10% PEG-6000中模擬干旱處理。用配制好的100 μmol/L的GA、MeJA和ABA溶液進行激素噴施處理。收集5 種處理的0(對照組,CK),3,6,12,24 h后的茶樹新稍頂芽下第二葉,每個處理設置3個生物學重復,用錫箔紙包裹放入液氮中固樣,放入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 茶樹4CL基因家族鑒定

在pfam(http://pfam-legacy.xfam.org/)數據庫中下載PF00501和PF13193的隱馬可夫模型,分別從茶樹‘黃棪’和‘鐵觀音’基因組數據庫中下載蛋白序列,利用HMMER軟件篩選出4CL基因家族的候選序列,去除結構域不完整的基因序列,再利用SMARAT(http://smart.embl-heidelberg.de)和NCBI CCD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)網站進行結構域驗證,滿足2個網站驗證的為‘鐵觀音’茶樹和‘黃棪’茶樹4CL基因家族成員。將得到的‘黃棪’和‘鐵觀音’4CL基因家族成員序列,分別用WOLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)網站和ExPASy(http://www.expasy.org)網站進行亞細胞定位預測和蛋白理化性質進行分析。

1.3 茶樹4CL家族成員染色體定位與系統進化樹構建

利用TBtools軟件將基因文件中在染色體上的分布情況進行可視化處理。從NCBI蛋白數據庫下載楊樹、擬南芥、大豆、水稻、川桑、覆盆子及黑麥草的蛋白序列,利用MEGA 7.0軟件,選擇鄰接法,校驗值Bootstrap設置設為1 000重復,構建進化樹,利用chiopt(https://www.chiplot.online)進行美化。

1.4 茶樹4CL基因家族成員基因結構、保守基序分析及蛋白保守結構域分析

用 GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)網站分析茶樹4CL基因結構,將得到的茶樹4CL蛋白序列上傳到MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)預測其保守基序,利用DNAMAN軟件和WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)網站進行多序列比對分析。

1.5 茶樹4CL基因家族成員啟動子順式元件分析及組織特異性表達

用TBtools提取茶樹HD-Cs4CL和TGY-Cs4CL基因轉錄起始位點上游2 000 bp序列,將得到的序列文件上傳至PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網站預測啟動子順式元件。下載‘黃棪’和‘鐵觀音’的轉錄組數據,參照前人方法[24],使用TopHat2軟件將轉錄組所有可用讀數映射到茶樹基因組,然后通過HTseq軟件計算HD-Cs4CL和TGY-Cs4CL基因在芽、嫩葉、老葉、根和莖上的FPKM值,利用TBtools軟件繪制基因在茶樹不同組織上的特異表達熱圖。

1.6 實時熒光定量PCR分析

根據基因組織特異性表達分析結果,選取在芽和嫩葉中高表達的基因,利用primer3plus網站上進行引物設計(表1),內參基因CsGAPDH登錄號為GE651107[25]。qRT-PCR反應在CFX96 Touch熒光定量PCR儀上進行,反應體系參照Transstart?Tip green qPCR superMix試劑盒方法,反應程序為94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;40個循環。使用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量[26],用prism軟件統計基因表達水平,用SPSS軟件進行顯著性分析(P<0.05)。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 茶樹4CL家族成員鑒定與蛋白理化性質分析

通過‘黃棪’和‘鐵觀音’基因組數據庫的比較鑒定,分別得到8條和9條4CL基因家族成員,繪制其在15條染色體上的分布圖(圖1)。結果顯示,HD-Cs4CL在5條染色體上有分布,分別是Chr02、Chr04、Chr07、Chr13和Chr15,其中在Chr07和Chr15上分布有2條基因,其余均僅有1條基因分布。TGY-Cs4CL則分布在Chr02、Chr06、Chr07、Chr011、Chr12、Chr13、Chr15這7條染色體上,其中在Chr02和Chr07上分布有2條基因,其余均僅有1條基因分布。根據結果將上述基因命名為HD-Cs4CL1～8和TGY-Cs4CL1～9(表2)。

A.HD-Cs4CL染色體定位;B.TGY-Cs4CL染色體定位。

表2 茶樹4CL基因家族的序列特征

茶樹4CL家族的分子量在24.00～143.45 kD,等電點4.91～5.36,茶樹4CL蛋白的等電點小于7,表明該家族基因為酸性蛋白。茶樹4CL除HD-Cs4CL2外均為親水性蛋白。茶樹4CL編碼序列288～1 713 bp,編碼氨基酸數目為542～578。亞細胞定位預測,有12個茶樹4CL家族成員定位在質膜上,3個成員定位在內質網上,細胞核和線粒體上分別定位有1個成員。可以看出,HD-Cs4CL基因定位于線粒體、質膜和細胞核上,而TGY-Cs4CL基因僅定位質膜和內質網上。

2.2 茶樹4CL家族成員系統發育與分類分析

為確定茶樹4CL與其他物種4CL基因之間的關系,選取擬南芥、水稻等植物構建系統進化樹(圖2)。結果顯示,9種植物4CL基因被分為A和B兩組,A組中‘黃棪’茶樹有2個成員HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL7、‘鐵觀音’茶樹僅有1個成員TGY-Cs4CL2和擬南芥At4CL1、At4CL2、At4CL4聚類,屬于第Ⅰ亞家族;2個家族成員HD-Cs4CL2和TGY-Cs4CL5與擬南芥At4CL3以及水稻Os4CL2聚類,屬于第Ⅱ亞家族;第Ⅲ亞家族只有單子葉植物水稻和黑麥草4CL聚類,無茶樹4CL家族成員聚類。B組中其余茶樹4CL家族成員聚類在一起。

At.擬南芥;Pto.楊樹;Os.水稻;Gm.大豆;Nt.煙草;Mn.桑樹;Ri.覆盆子;Lp.黑麥草。

2.3 茶樹4CL家族基因結構、保守基序與蛋白保守結構域比較

茶樹4CL基因結構圖(圖3)顯示,除HD-Cs4CL2和HD-Cs4CL6外均含有內含子,其中HD-Cs4CL1基因組序列最長,超過22 kb,HD-Cs4CL2和HD-Cs4CL6基因組序列較短,不足1 kb。除HD-Cs4CL2(2個)、HD-Cs4CL6(1個)、HD-Cs4CL1和TGY-Cs4CL4(4個)、HD-Cs4CL5、HD-Cs4CL7和TGY-Cs4CL6(5個)外,其余基因均有6個外顯子。

A.茶樹4CL家族系統進化樹;B.茶樹4CL家族基因結構。

茶樹4CL保守基序圖(圖4)顯示,HD-Cs4CL1～8和TGY-Cs4CL1～9均含有motif(1～13),BOX Ⅰ存在于motif3中,BOX Ⅱ存在于motif5中,所有基因均含有這2個基序,motif16和motif20僅存在于HD-Cs4CL2/3/7和TGY-Cs4CL2/5;HD-Cs4CL2/6和TGY-Cs4CL5/8含有motif14;motif16僅存在TGY-Cs4CL1/3/9和HD-Cs4CL4中;motif17僅存在于HD-Cs4CL3/7和TGY-Cs4CL2。結合系統發育分析結果,同一分支成員具有相似基序組成及排列順序,這和系統發育分析結果一致。

A.茶樹4CL家族系統進化樹;B.茶樹4CL蛋白保守基序。

茶樹4CL結構域的多序列比對(圖5)顯示,HD-C4CL2、TGY-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、TGYCs4CL5和HD-Cs4CL7這5條基因的蛋白包含保守結構域BOX Ⅰ(SSGTTGLPKGV)和BOX Ⅱ (GEICIRG),其他基因在BOX Ⅰ和BOX Ⅱ上均存在2個氨基酸突變。

A.利用DNAMAN軟件對保守結構域進行對齊;B.序列保守性。

2.4 茶樹4CL家族基因啟動子順式元件分析

對茶樹4CL基因家族啟動子順式元件進行分析,結果(圖6)顯示,參與光響應的有Box4(89個)、G-box(45個)、GT1-motif(27個)、GATA-motif(9個)和MRE(6個)等元件。脫落酸(ABRE,43個)、生長素(AuxRR-core,1個;TGA-element,6個)、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif/TGACG-motif,16個)、赤霉素(GARE-motif,4個;as-1,16個;TATC-box,7個)和水楊酸(TCA-element,11個)等激素響應元件。此外,還發現厭氧誘導(ARE,37個)、低溫應答(LIR,5個)、干旱誘導(MBS,5個)、防御與應激(TC-rich repeats,10個)和機械損傷(WUN-motif,19個)脅迫響應元件,與植物生長相關的元件有分生組織表達調控(CAT-box,5個)、玉米醇溶蛋白代謝調節(O2-site,5個)和胚乳表達調控(GCN4-motif,5個)等。此外,4CL基因中還存在大量的MYB響應元件。

圖6 茶樹4CL基因家族啟動子順式元件分析

2.5 茶樹4CL家族基因組織特異性表達

為探究茶樹4CL基因各成員在茶樹不同組織中的作用,繪制出組織表達譜(圖7)。如圖7所示,HD-Cs4CL1、TGY-Cs4CL4和TGYCs4CL9在根中的表達量明顯高于其他組織;HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL7、TGY-Cs4CL2和TGY-Cs4CL8主要在莖中表達;HD-Cs4CL8、TGY-Cs4CL3和TGY-Cs4CL6主要在老葉中表達;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL5和TGY-Cs4CL1主要在嫩葉中表達;HD-Cs4CL7主要在芽中表達;HD-Cs4CL6主要在老葉和嫩葉中表達;HD-Cs4CL4和TGY-Cs4CL5主要在芽和嫩葉中表達。綜上,‘黃棪’和‘鐵觀音’茶樹4CL基因在不同組織中表達量存在差異。

圖7 HD-Cs4CL和TGY-Cs4CL基因在5個組織中的表達譜

2.6 茶樹4CL基因在不同激素和逆境下的表達模式

篩選出7個在芽和幼葉中表達量較高的茶樹4CL基因,并對其進行GA、MeJA、ABA、低溫和干旱處理下的表達量進行分析(圖8、圖9),進而探究茶樹4CL基因家族在逆境下的作用。

2.6.1 茶樹4CL基因在GA、MeJA和ABA激素作用下的表達模式

在GA激素處理下,HD-Cs4CL6表達量顯著上升,在6 h表達量達到峰值,達到120.9倍;HD-Cs4CL8在12 h達到峰值,為140.8倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL5表達量下降;HD-Cs4CL3表達量先下降后略有上調;HD-Cs4CL7僅在3 h表達量降低。

在MeJA激素處理下,HD-Cs4CL6表達量在12 h達到最高峰,為91.9倍;HD-Cs4CL8表達量在6 h達到峰值,達到69.3倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL7表達量均表現為下調趨勢;HD-Cs4CL5在0～6 h為下調趨勢,6～12 h表達量為上調。在ABA激素處理下,HD-Cs4CL6和HD-Cs4CL8表達量在6 h時達到峰值,它們分別達到225.9,208.4倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL7表達量均于6 h達到峰值,分別是1.9,3,1.7倍;HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL5表達量呈現下調的趨勢。

2.6.2 茶樹4CL基因在低溫和干旱脅迫作用下的表達模式

在低溫處理下,HD-Cs4CL6表達量呈現先上調后下降的趨勢,在3 h達到峰值,達到19.9倍;HD-Cs4CL7總體上呈現先下降后上調再下降的趨勢,在6 h達到峰值達1.03倍;HD-Cs4CL8表達量持續上調在24 h達到峰值,達到61.9倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL5表達量呈現下降趨勢。

在干旱處理下,HD-Cs4CL6和HD-Cs4CL8在3 h表達量顯著上調,3～6 h顯著下降,6～24 h表達量持續上升,均在24 h達到峰值,分別達50倍和142.8倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL4的表達量呈現先下降后上升趨勢,表達量總體上變化不明顯;HD-Cs4CL5和HD-Cs4CL7表達量均在24 h達到峰值,分別為1.7倍和1.6倍。

3 討 論

4CL基因家族已在40多種植物中被鑒定[12],其中番茄6個[27]、龍眼43個[28]、煙草20個[6]、辣椒8個[29]和桑樹4個成員[10],這表明不同物種間4CL家族成員數目有較大的差異。前人從福鼎大白茶和舒茶早中分別鑒定出1個和2個4CL家族成員[21-22],本研究從‘黃棪’和‘鐵觀音’基因組中分別篩選出8個和9個茶樹4CL基因。前人研究表明,在4CL蛋白序列中BOX Ⅰ絕對保守,BOX Ⅱ絕對保守[3],前人在福鼎大白茶和舒茶早中鑒定出的4CL蛋白序列也是絕對保守。茶樹4CL家族蛋白序列多序列比對分析發現,HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL7、TGY-Cs4CL2和TGY-Cs4CL5具有共同的保守結構域BOX Ⅰ和BOX Ⅱ。結合系統發育分析,保守結構域中氨基酸突變的基因均屬于B組,而B組基因與現已知Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類亞家族均有較遠的親緣關系,進而推測它們可能屬于4CL類似蛋白,這和桑樹的研究[10]一致。本研究中B組4CL基因在BOX Ⅰ和BOX Ⅱ保守結構域中均有2個氨基酸突變,推測它們可能在進化進程中功能發生了分化,會識別與結合其他不同的產物[30]。

茶樹在種植過程中可能會受到各種生物與干旱、低溫等非生物脅迫,會影響茶樹的生長發育,進而影響茶葉的品質與產量[31]。PEG模擬干旱、MeJA處理和ABA處理都會導致植物細胞中ROS大量積累[32-33],ROS大量積累是導致植物非生物脅迫的重要原因[34],類黃酮類物質對ROS有很強的清除能力[35],木質素是次生壁的主要成分之一,對植物的生物與非生物脅迫抵抗具有重要影響[29]。已有研究證實擬南芥At4CL3、桑樹Mn4CL3參與類黃酮的生物合成。本研究中,HD-Cs4CL2和TGY-Cs4CL5與擬南芥At4CL3聚類在一起,推測其可能參與茶樹類黃酮的生物合成。擬南芥At4CL1/2/4、桑樹Mn4CL1/2/4參與木質素生物合成[5,10]。HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL7、TGY-Cs4CL2和擬南芥At4CL1、At4CL2及At4CL4聚類,推測其可能參與茶樹木質素的生物合成。

研究發現在基因啟動子順式元件分析中,存在許多抗逆、防御及應激相關的順式作用元件,與植物抵抗非生物脅迫具有直接或間接的關系[34]。結合實時熒光定量PCR分析發現,證實茶樹4CL基因參與了對多種非生物脅迫的響應。Nie等[36]研究發現土豆St4CL6和St4CL8在MeJA、ABA和PEG脅迫中表達量上調,Rain等[23]研究發現ABA處理Cs4CL表達量上調,本研究中HD-Cs4CL6和HD-Cs4CL8表現與其一致,HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL7在ABA處理和干旱處理下表達量上調,而HD-Cs4CL2僅在ABA處理下表達量上調。焦健青[37]研究發現獼猴桃Ac4CL3/4/5/7在低溫處理下基因表達量上調,李小蘭等[38]研究發現桃中4CL基因也在低溫處理下表達量上調,本研究中Cs4CL6和HD-Cs4CL8在低溫處理下基因表達量上調。由此可見,4CL基因可能在茶樹響應非生物脅迫中發揮重要作用。

4 結 論

本研究對茶樹4CL基因家族進行茶樹全基因組范圍內的鑒定,系統進化樹將茶樹4CL分為2個組別,并將A組分為3個亞家族,分析其結構和功能發現茶樹4CL基因與木質素及類黃酮物質合成相關;通過順式作用元件分析及實時熒光PCR分析發現茶樹4CL基因家族與茶樹非生物脅迫響應緊密相關。本研究結果為進一步探究4CL基因家族參與茶樹非生物脅迫的響應提供參考依據。