蓖麻RcbZIP11基因克隆及表達特性

李艷肖,朱貴爽,張宏宇,向殿軍*,劉 鵬

(1 內蒙古民族大學 農學院,內蒙古通遼 028000;2 內蒙古民族大學 科爾沁沙地生態農業國家民委重點實驗室,內蒙古通遼 028000;3 通遼市農業技術推廣中心,內蒙古通遼 028000)

轉錄因子(transcription factors,TFs)作為調控基因表達的蛋白質分子,在動植物體內通常有著重要的功能,例如在調控植物的生長發育、逆境脅迫響應、信號傳導和生理代謝等過程[1-2]。而1個結構完整的TFs編碼蛋白質通常由4部分組成:DNA結合域(DNA binding domain)、轉錄調節域(transcription regulation domain)、寡聚位點(oligomerization site)和核定位域(nuclear localization signal)[3]。一般情況下,TFs并不是獨立發揮作用的,而是通過DNA結合域的作用,與其轉錄起始上游的啟動子區域的順式作用元件結合,并通過與其他蛋白質的相互作用共同調控植物的生長[4]。

目前,在植物中至少已鑒定出64種轉錄因子家族[5]。其中,堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)基因家族是TFs家族中成員數量最多的[6]。其特征在于高度保守的bZIP結構域,該結構域由60～80個氨基酸殘基組成,包括堿性區域和亮氨酸拉鏈(Leu)區域,這2個功能區域由鉸鏈區域連接[3]。其中堿性區域是高度保守的,大約由16個氨基酸殘基組成,高度保守的N-x7-R/K-x9基序的功能是負責核定位和DNA結合[7];Leu拉鏈區域則主要由Leu的幾個重復序列或其他疏水性氨基酸(如Ile、Val、Phe或Met)組成,具有控制轉錄激活或轉錄抑制的功能[8]。bZIPTFs編碼基因目前已在植物中被廣泛鑒定,包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、水稻(Oryzasativa)[10]、大麥(Hordeumvulgare)[11]、高粱(Sorghumbicolor)[12]、蓖麻(Ricinuscommunis)[13]和葡萄(Vitisvinifera)[14]等植物。

研究表明,bZIP基因參與植物生長發育的重要調控過程,如調節根系發育[15]、促進花青素積累[16]、整合脫落酸和葡萄糖信號[17]。同樣,bZIP基因也參與調節植物在脅迫下的生理反應[18-23]。bZIP基因影響許多物種的耐鹽性和耐旱性,例如番茄(Solanumlycopersicum)[18]、大豆(Glycinemax)[19]和人參(Panaxginseng)[20]等植物。朱蕓曄等[21]研究發現番茄在鹽、干旱和細菌等脅迫條件下,43個SlbZIP基因能夠被誘導表達,積極參與番茄的逆境反應;才華等[22]發現野生大豆(Glycinesoja)GsbZIP33基因響應干旱、低溫和鹽脅迫,并且在根和葉片組織中有著不同的表達模式;人參的157個bZIP基因中,PgbZIP99和PgbZIP78在鹽脅迫下被誘導表達,PgbZIP131在干旱脅迫下表達值最高[23]。

目前,在蓖麻中共發現了49個RcbZIP基因[13],但僅對少數基因的功能進行了研究。其中RcbZIP11基因參與非生物脅迫應答的研究鮮見報道。鑒于蓖麻優良的抗旱和耐鹽堿能力及bZIP基因在植物逆境脅迫中的作用,對蓖麻bZIP基因資源的挖掘是必要的。本研究基于‘通篦5號’葉片轉錄組信息,克隆出1個蓖麻的RcbZIP家族成員,對其編碼氨基酸進行生物信息學分析和蛋白質亞細胞定位分析,研究基因在不同逆境脅迫下的表達特性,包括干旱、鹽、低溫和脫落酸脅迫,以期為蓖麻RcbZIP11基因響應環境脅迫壓力的分子機制和對基因功能的研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料及處理

‘通篦5號’由通遼市農牧研究所提供;野生型擬南芥種子(Columbia生態型)保存于實驗室。蓖麻種子經75%的酒精消毒后于28 ℃催芽,發芽后均勻地擺放在發芽盒中進行水培,2片子葉展開后澆灌1/2霍格蘭營養液,至四葉齡對其分別進行干旱脅迫(10% PEG 6 000)、高鹽脅迫(300 mmol/L NaCl)、冷脅迫(4 ℃)和脫落酸脅迫(100 μmol/L ABA);擬南芥種子消毒后種植在3∶1比例的花土∶蛭石的花盆中。培養條件是(25±1) ℃/16 h光照和(20±1) ℃/8 h暗處理交替培養。

1.1.2 主要試劑及儀器

2 x KOD MasterMix高保真酶和DNA提取試劑盒購買于庫萊博;第一鏈cDNA合成試劑盒購自莫納生物公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒和SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購買于生工公司;T-載體、載體連接試劑盒、SacⅠ和XbaⅠ內切酶購自Takara公司;pCAMBIA2300-GFP載體和大腸桿菌感受態(TOP10)購于青島艾迪特生物科技公司。植物原生質體分離試劑盒Plant Protoplasts Isolation Kit和轉染試劑盒Plant Protoplasts Transfection Kit購買于Beyotime生物公司。儀器設備由內蒙古民族大學農學院和生命科學與食品學院提供。本試驗所需引物均使用Snapgene軟件設計,生工公司合成,序列見表1。

表1 引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取

將蓖麻真葉放入滅菌后提前預冷的研缽中,加入液氮研末至粉末狀。使用TransZol法提取總RNA作為模板,使用第一鏈cDNA合成試劑盒合成模板cDNA。

1.2.2RcbZIP11基因全長的克隆及驗證

參考蓖麻轉錄組數據中RcbZIP11基因的序列信息,設計特異性引物(表1)。使用上述模板cDNA進行PCR擴增,擴增體系包括酶25 μL,上下游引物各2 μL,模板5 μL和dd H2O定容至50 μL,輕柔吹打混勻后,按照95 ℃ 6 min;95 ℃ 15 s,53 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s,35個循環;72 ℃ 7 min進行反應,將擴增產物經1%電泳檢測,符合目標片段后進行膠回收、末端加A及純化。使用載體連接試劑盒將純化產物連接至T載體,熱擊轉化大腸桿菌感受態細胞中,經菌液PCR檢測合格后進行保菌,并將菌液送至生工公司進行測序。

1.2.3RcbZIP11基因的生物信息學分析

在ExPASy(https://web.expasy.org/translate/)網站推導RcbZIP11基因的編碼氨基酸序列;并將氨基酸序列提交至NCBI conserved domain search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測其結構域;借助ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)在線工具預測RcbZIP11蛋白質的基本理化性質和親疏水性;用SOPMA(https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)工具預測蛋白質的二級結構;在Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)網站預測RcbZIP11蛋白質的三級結構,并對預測結果在SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)網站進行打分,下載拉式構象打分圖。將RcbZIP11蛋白質序列作為探針,使用在線工具NCBI-Protein Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進行序列對比并下載,使用GENEDOC軟件進行蛋白質多序列比對分析,在MEGA 11.0軟件上進行進化樹繪制。

1.2.4 RcbZIP11啟動子序列的克隆及分析

使用DNA提取試劑盒提取蓖麻葉片組織的DNA,1%瓊脂糖電泳檢測合格后將其作為模板,按照1.2.2節中的擴增體系對RcbZIP11基因轉錄表達上游2 000 bp的啟動子序列進行擴增,條帶符合預期大小后,對其進行膠回收、末端加A、純化、連接T載體并轉化大腸桿菌感受態,操作步驟同1.2.2節,測序由生工公司完成。測序比對結果正確后,將序列提交至Plant CARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網站預測啟動子區域中可能存在的順式作用元件。

1.2.5 RcbZIP11蛋白質亞細胞定位分析

對1.2.2節中測序正確的菌液進行質粒提取,以其作為模板進行PCR擴增(引物見表1),將產物進行膠回收及純化,片段檢測正確后克隆至pCAMBIA2300-GFP載體的SacⅠ和XbaⅠ酶切位點處,構建重組質粒pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11,熱擊轉化大腸桿菌感受態細胞,測序正確后提取重組質粒。

使用Plant Protoplasts Isolation Kit制備擬南芥原生質體,按照Plant Protoplasts Transfection Kit操作步驟分別將pCAMBIA2300-GFP空載體和融合表達載體pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11轉化至原生質體中,使用DAPI(4′,6二脒基-2-苯吲哚)對細胞核進行染色,在22 ℃培養箱中培養16 h。使用激光共聚焦顯微鏡(FV1000)觀察RcbZIP11蛋白質的亞細胞位置。

1.2.6RcbZIP11基因的時空表達特性分析

在1.1.1節中,取未處理幼苗的根、莖、真葉和子葉組織進行RcbZIP11的組織表達模式分析;取脅迫處理0,6,12,24,36 h的真葉和根組織檢測RcbZIP11在脅迫處理下的表達模式。同1.2.1節操作步驟提取植物組織的總RNA并反轉錄合成cDNA,RcbZIP11-Q-F和RcbZIP11-Q-R為基因的熒光表達擴增引物(表1)。反應體系為正反向引物各0.2 μL,模板1 μL,SybrGreen qPCR Master Mix 5 μL和ddH2O定容至10 μL。每組處理進行3次生物學和技術性重復以保證結果準確。根據公式2-ΔΔCT計算RcbZIP11的相對表達量[24],并使用SPSS和Excel軟件對數據進行處理,使用TBtools軟件的fancy heatmap程序繪制圖片。

2 結果與分析

2.1 RcbZIP11基因的克隆

RcbZIP11基因全長的克隆結果如圖1所示,擴增片段大小在500～750 bp之間,符合預期片段,測序后發現其cDNA全長643 bp,其中CDS有492 bp,CDS區內無內含子的存在,共編碼163個氨基酸,序列信息見圖2。將序列提交至GenBank,將其命名為RicinuscommunisbZIP11(RcbZIP11),登錄號為OQ506490。

2.2 RcbZIP11基因的生物信息學分析

2.2.1 RcbZIP11蛋白質的保守域分析

如圖3,經NCBI-CD Search預測后發現,RcbZIP11蛋白質有1個保守的bZIP_plant_GBF1結構域,是bZIP超家族的一員。

圖3 RcbZIP11蛋白質的保守域分析

2.2.2 RcbZIP11蛋白質的基本理化性質及親疏水性分析

RcbZIP11蛋白質的分子式為C787H1271N243O262S10,相對分子質量是18.65 kD,理論總原子數是2 573個,理論等電點是6.14。

組成RcbZIP11蛋白質的163個氨基酸殘基中,Ser和Leu含量最高,分別有13.5%和10.4%,含量最低的是Phe,有1.8%;帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)少于帶負電的氨基酸殘基(Asp+Glu),分別為15個和18個。脂肪系數是77.24,總平均疏水性是-0.722,說明RcbZIP11是1個親水性蛋白質(圖4)。

圖4 RcbZIP11蛋白質的親疏水性分析

2.2.3 RcbZIP11蛋白質的序列分析

將RcbZIP11蛋白質同其他植物的bZIP氨基酸序列進行比對(圖5),發現不同物種的bZIP氨基酸的序列一致性是68.37%,在bZIP_plant_GBF1結構域內氨基酸的一致性較高,而C端保守性很弱。在NCBI數據庫種下載了銀白楊(Populusalba,XP_034931683.1)、毛果楊(Populustrichocarpa,XP_002306888.1)、麻風樹(Jatrophacurcas,XP_012071923.1)、可可樹(Theobromacacao,XP_007017624.1)、桃(Prunuspersica,XP_007223601.1)、黃瓜(Cucumissativus,XP_004152685.1)、葡萄(Vitisvinifera,XP_003634372.1)、番木瓜(Caricapapaya,XP_021905988.1)、擬南芥(NP_195185.1)和水稻(XP_015622690.1)等10個物種的bZIP蛋白質序列文件,并與蓖麻RcbZIP11蛋白質進行進化樹構建,發現RcbZIP11與麻風樹JcbZIP11因緣關系最近(圖6)。

顏色越深代表序列一致性越高;AtbZIP11.擬南芥(NP_195185.1); CcbZIP11.黃瓜(XP_004152685.1); GmbZIP11.大豆(KAH1220101.1); CabZIP11.辣椒(XP_016539772.1); NtbZIP11-like.煙草(XP_009619503.1)。黑色橫線是bZIP_plant_GBF1結構域。

圖6 RcbZIP11蛋白質的系統發育進化樹分析

2.2.4 RcbZIP11蛋白質的二級和三級結構預測

RcbZIP11蛋白質的二級結構預測結果(圖7)顯示,其包含98個α螺旋、2個β折疊、57個隨機線圈和6個延伸鏈,分別占總氨基酸殘基的60.12%、1.23%、34.97%和3.68%。二級結構進一步卷曲折疊形成了RcbZIP11蛋白質的三級結構(圖8,A),與模型c1gd2G的一致性高達99.3%(一致性>60%為準確),c1gd2G模型是pop1蛋白bZIP結構域的典型結構,再次在結構上驗證了RcbZIP11蛋白質屬于bZIP家族;此外,RcbZIP11蛋白質的拉式構象圖預測結果(圖8,B)顯示,氨基酸殘基在最佳允許區(紅色區域:A、B和L區)的數量占比是100%,說明RcbZIP11蛋白質的三級結構預測結果是非常可靠的。

藍色.α螺旋;綠色.β折疊;紫色.隨機線圈;紅色.延伸鏈。

A. RcbZIP11蛋白質的三級結構;B.拉式構象圖。

2.3 RcbZIP11啟動子序列的克隆及分析

如圖9,經PCR法克隆出RcbZIP11的啟動子片段,測序結果與RcbZIP11啟動子預測序列結果一致,表明成功克隆出RcbZIP11啟動子序列。

M. DL 2 000 DNA 分子量標準; 1. RcbZIP11啟動子克隆產物。

Plant CARE數據庫預測結果(表2)顯示,該序列除了核心元件(TATA-box和CAAT-box)外,還存有光響應元件(GT1-motif和G-box)、激素響應類元件(GARE-motif、TCA-element、CGTCA-motif和TGACG-motif)和脅迫響應類元件(GC-motif、MBS和CCAAT-box),說明RcbZIP11啟動子可能受到非生物脅迫和激素脅迫的誘導,參與植物的逆境脅迫響應。

2.4 RcbZIP11蛋白質亞細胞定位分析

如圖10,激光共聚焦顯微鏡下的空載體(對照,pCAMBIA2300-GFP)綠色熒光在細胞核和細胞膜均有顯示,而轉入融合表達載體pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11的擬南芥原生質體的綠色熒光與細胞核特意標記位置重疊,說明RcbZIP11蛋白質定位在細胞核,可能在細胞核中發揮作用。

2.5 RcbZIP11基因的時空表達特性分析

2.5.1 組織表達模式

圖11顯示,在蓖麻的不同組織中RcbZIP11基因的表達量不同,RcbZIP11基因在各個組織中均有表達,其中在子葉中RcbZIP11基因的表達量最高,其次是真葉組織;在根中表達量最低,其次是莖組織;RcbZIP11基因在子葉中的相對表達量是根中表達量的3.28倍。

圖11 RcbZIP11基因的組織表達模式

2.5.2 非生物脅迫表達模式

圖12顯示,RcbZIP11基因的時空表達模式會受到干旱脅迫(PEG)、高鹽脅迫(NaCl)、冷脅迫(4 ℃)和脫落酸脅迫(ABA)的誘導,且每個時段RcbZIP11基因的表達量均高于0 h。

組織內不同字母表示脅迫時間之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)。

在干旱脅迫下(圖12,A),RcbZIP11基因在真葉和根中均呈現雙峰表達模式,并且分別在第12 h和第6 h首次出現表達峰值;在高鹽脅迫下(圖12,B),RcbZIP11基因在真葉和根中呈現出先上升后下降的表達趨勢,除在第12 h時RcbZIP11基因在根中的表達量高于真葉組織,在其余時間點RcbZIP11基因均在葉片中高表達;在低溫脅迫下(圖12,C),RcbZIP11基因在真葉組織中呈現出雙峰表達模式,且分別在第6 h和第36 h出現表達峰值,在根中呈現出先上升后下降的表達模式,且在第24 h出現表達峰值;在ABA脅迫下(圖12,D),RcbZIP11基因在根和葉片中表現出相似的時空表達模式,但RcbZIP11基因在葉片中的表達量要遠高于根組織。

綜上,RcbZIP11基因能夠迅速響應非生物脅迫,積極地參與蓖麻的非生物脅迫調控模式。

3 討 論

bZIP基因在高等植物中普遍存在,積極參與調節著植物的生物和非生物脅迫應答及生長發育[1-2,25]。本研究從蓖麻品種‘通篦5號’中克隆到RcbZIP11基因,并對該基因或其所編碼的氨基酸序列進行了理化性質分析、表達特性研究和亞細胞定位分析,還克隆了RcbZIP11轉錄起始上游2 000 bp的啟動子序列,分析該區域的順式作用元件。RcbZIP11蛋白質的理化性質分析結果顯示,與橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)[26]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[27]和白桑(Morusalba)[28]的bZIP11蛋白質的理化性質不同,說明bZIP11蛋白質在不同物種間的進化存有差異,這可能與其編碼基因響應不同的逆境有關[26-28]。研究表明,蓖麻的49個RcbZIP蛋白質共分為9個亞簇,分別是A～I簇,其中E、G和H亞簇所含蛋白質數量最多,分別有11,9,7個[13]。RcbZIP30/4/16/37/48/11/44/17/19隸屬于G亞簇,該簇的特征結構域是bZIP_plant_GBF1結構域[7,13,18]。本研究結果顯示,RcbZIP11基因所推導的氨基酸序列中擁有bZIP_plant_GBF1結構域,推測其屬于GBF1類bZIP轉錄因子,與蓖麻G亞簇的RcbZIP30/4/16/37/48/44/17/19蛋白質可能存在功能上的冗余[13]。研究發現,bZIP轉錄因子的在細胞中的位置主要定位于細胞核[29]。辣椒(Capsicumannuum)的CAbZIP1-GFP融合蛋白瞬時轉化擬南芥原生質體,結果顯示該蛋白定位于細胞核[30];小麥(Triticumaestivum)的TabZIP1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞中瞬時表達也得了相同結論,TabZIP1蛋白質同樣是1個核蛋白[31]。筆者構建了RcbZIP11蛋白質的融合蛋白pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11,在擬南芥原生質體中瞬時表達,得到的結果與前人研究結果一致。

啟動子作為研究基因表達及功能的重要作用元件,可以與bZIP轉錄因子的堿性區域結合,進而調控下游基因的表達[4]。一般地,bZIP轉錄因子會優先結合以ATGC為核心的順式作用元件,如A-box、C-box、G-box和ABRE元件[32-33]。甘薯(Pomoeabatatas)的IbbZIP22啟動子區域中就有多個G-box和MBS元件,還有多個茉莉酸甲酯(MeJA)和ABA誘導元件,說明IbbZIP22轉錄因子可能會受到MYB的調控,基因的表達會受到MeJA和ABA激素的誘導[34]。RcbZIP11啟動子中也同樣有G-box核心元件(CACGTC)、MYB結合位點(CAACTG)、水楊酸誘導元件(CCATCTTTTT)、MeJA誘導元件(CGTCA和TGACG)和赤霉素誘導元件(TCTGTTG),說明RcbZIP11基因的表達可能會受到激素和干旱誘導的調控,RcbZIP11基因在干旱脅迫(圖12,A)下的表達模式也驗證了這一猜想,但是該基因在植物應對干旱脅迫過程中的潛力需進一步驗證。研究表明,bZIP轉錄因子在植物應對不利環境的應答過程中扮演著重要的角色,包括鹽、干旱、低溫、滲透脅迫和機械損傷等多種環境壓力[21,25,35],bZIP通常情況下是通過基因的過量表達來應對上述非生物脅迫的。例如,MtbZIP2和MtbZIP26基因的過量表達可提高蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)植株在鹽脅迫下的適應能力[36];蘋果(Maluspumila)的MdbZIP2/8/10/39/46/60/69/72/78/79/94/96/99/104/109基因在干旱脅迫下的根和葉片組織中特異性表達,說明這16個基因對蘋果植株應對干旱脅迫有重要意義[37];大豆的GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78基因在冷脅迫下表達量攀升,促進了大豆葉片脯氨酸的合成,提高了植物在冷脅迫中的存活能力[38]。蓖麻RcbZIP11基因時空表達模式顯示,RcbZIP11基因表達受非生物脅迫的誘導,在干旱、鹽、低溫和ABA脅迫下的基因表達量攀升,均高于0 h,說明RcbZIP11基因積極參與蓖麻植株對非生物脅迫的應答,這與前人研究結果[13]一致。

綜上,本研究對‘通篦5號’RcbZIP11基因和啟動子進行克隆,對其進行生物信息學分析和基因的表達模式分析,探討了RcbZIP11蛋白質的結構與功能,再通過構建RcbZIP11蛋白質的熒光表達載體,明確其亞細胞定位,為蓖麻RcbZIP11基因在應對非生物脅迫過程中的功能奠定了基礎,后續可構建RcbZIP11基因的過表達載體,通過轉化模式植物進一步明確該基因的具體功能。