膨大期果面噴施IAA對桃成熟期果實性狀和相關基因表達的影響

張彥蘋,王 晨,朱旭東

(1 蘇州農業職業技術學院,江蘇蘇州 215008;2 南京農業大學 園藝學院,南京 210095)

植物果實的發育成熟是一個復雜的過程,是由眾多生理生化反應引起的果實結構、質地和風味的改變。其中果實成熟最顯著的代謝變化是細胞壁結構的改變,果實細胞壁物質主要由果膠、纖維素、半纖維素等多糖類物質組成,這些物質的部分或完全的溶解以及淀粉和其他多糖的裂解是引起果實質地品質變化的主要原因[1]。此外,硬度、色澤、香味和糖酸變化也是果實成熟的標志性事件及果實品質構成的核心因素。其中糖是果實風味物質、色素、氨基酸、維生素、芳香物質和其他的營養成分合成的原材料,是判斷果實品質的重要指標。此外,已有研究表明,糖可以作為一個信號在調控果實成熟方面發揮重要作用,如蔗糖可以調控草莓果實的發育成熟[2]。

生長素(auxin)是最早被發現的一類植物激素,在果實發育過程中起著至關重要的作用。其水平的動態時空變化可以精確、快速地觸發基因重編碼,從而精細調控植物生長和發育過程中的多個方面[3-4]。已有研究表明,外源生長素處理可以影響番茄、桃、草莓等果實的硬度、成熟時間[2];生長素還可通過調控乙烯信號途徑參與果實成熟的啟動及調控等[5-8]。Tonutti等發現在桃果實發育成熟時期,乙烯釋放量與果肉IAA含量呈正相關[9]。此后有研究表明人工合成的生長素處理可加速桃果實發育、成熟和乙烯的產生[10]。Tatsuki等比較溶質型桃和硬質型桃成熟軟化的差異時發現二者之間不僅乙烯釋放量存在差異,吲哚乙酸(IAA)的含量也表現出很大的不同[5]。中國市場中以鮮食桃為主,多為溶質型桃,在果實成熟后軟化速度較快,果實品質快速下降,不耐貯藏和運輸,成為限制桃產業發展的一大重要因素。現有研究表明生長素在桃果實成熟及軟化過程中發揮著重要作用,但同一樹種不同品種(基因型)間的軟化機理存在明顯差異,為進一步明確生長素對桃果實發育成熟的調控作用,本研究以水蜜桃品種‘小白鳳’為試驗材料,通過設置不同濃度的外源IAA處理,分析桃果實硬度、糖組分(蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇)、果膠、纖維素含量以及乙烯釋放量的變化,明確顯著影響桃果實成熟的IAA處理濃度,確定外源IAA處理在轉錄組水平的影響,以期為深入認識生長素調控果實成熟的機理以及生長素在桃果實成熟調控中的應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

以蘇州農業職業技術學院合作試驗基地的‘小白鳳’水蜜桃成年樹(8年生)上的果實作為試驗材料。試驗前選取生長勢一致的植株進行掛牌標記,每處理設3個重復,每個重復3株桃樹。在花后60 d(果實第2次快速膨大期)[11]參考Liu等方法分別用 200,10,0.1 μmol/L的外源 IAA(加1% 吐溫80)均勻噴灑整個果實表面[12],對照處理同步噴施蒸餾水。處理后每隔10 d隨機選取不同植株不同方向的果實取樣,共3次。所有樣品取回后分離果皮和果肉,于液氮中速凍并放置在-80 ℃條件下保存。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 果實硬度

果實硬度參考曾文芳等[8]方法采用水果硬度計(GY-3)進行測定。

1.2.2 果實糖組分含量

糖組分含量采用高效液相色譜儀參考Gomez等的方法進行測定[12]。色譜條件為高效液相色譜儀(Agilent 1260 infinity),Hi-Plex Ca (8 μm,300 mm×7.7 mm, Agilent, GB),柱溫為80 ℃,示差檢測器為Agilent 1260,溫度40 ℃,流動相為超純水,流速為0.6 mL/min。外標法定量。

1.2.3 果實果膠和纖維素含量

參考彭勇等的方法[13],果膠含量和纖維素含量分別用咔唑比色法和蒽酮比色法進行測定。

1.2.4 果實乙烯釋放量

參照曾文芳等的方法進行測定[8]。色譜條件為島津GC2010型氣相色譜儀,高鴿手動微量進樣器,氣相毛細管色譜柱:Rtx-5(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm,restek);進樣口(SPL)100.0 ℃,柱溫60 ℃;氫離子火焰檢測器(FID)溫度130 ℃;載氣He,流速 30 mL/min;燃氣H2,流速30 mL/min;空氣流速400 mL/min,分流比35;壓力控制流量,壓力113.5 kPa,進樣時間2.0 min。

1.2.5 果實轉錄組測序

依據前面取得的結果,選取200 μmol/L的外源IAA 處理后30 d果實的果肉部分進行轉錄組測序。總RNA 用TRIzol試劑盒 (Invitrogen, CA, USA)提取,構建2個樣品的文庫,送北京諾禾致源進行單末端(50 bp)測序,測序平臺為Illumina Hiseq 2500(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)。通過FDR(false discovery rate)設定閾值的方法來篩選差異基因[14]。兩組比對中,P<0.05 被認為是差異表達。

1.2.6 實時熒光定量RT-PCR

以mRNA反轉錄合成的cDNA為模板,以桃RPII基因為內參進行qRT-PCR擴增[15]。

試驗重復3次,采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列見表1。

表1 試驗中所用引物序列

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0、Excel 2016進行數據處理,采用單因素方差分析進行顯著性檢驗(a=0.05)。

2 結果與分析

2.1 膨大期IAA處理對桃果實成熟及硬度的影響

圖 1 顯示,不同濃度IAA處理后至果實成熟時,桃果實表型及硬度出現了不同程度的差異。在處理后30 d時,桃果實在200 μmol/L IAA處理組比對照組平均延遲5 d成熟,而在10,0.1 μmol/L IAA 處理組與對照組無顯著差異(圖 1,A)。同時,桃果實的硬度在不同處理組中均隨著果實成熟而逐漸顯著下降。其中,在IAA處理后10 d和20 d時,桃果實硬度在同期各IAA處理組與對照組間均無顯著差異;至處理后30 d時,桃果實硬度在10,0.1 μmol/L IAA處理組與同期對照組間仍無顯著差異,而在200 μmol/L IAA處理組中顯著高于同期對照組(圖 1,B)。

不同小寫字母表示處理間在0.05 水平顯著差異(P <0.05)。下同。

2.2 膨大期IAA處理對桃果肉中糖組分含量的影響

果實糖含量的變化與果實的成熟密切相關,本研究采用高效液相色譜法測定了桃果肉中蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇的含量。結果(圖 2)表明,桃果實中蔗糖含量在0.1 μmol/L IAA 處理后10 d與對照組無顯著差異,在處理后20 d顯著高于對照組,在處理后30 d顯著低于對照組;蔗糖含量在10 μmol/L IAA 處理后10 d顯著低于對照組,在處理后20 d和30 d 時與對照組均無顯著差異;蔗糖含量在200 μmol/L IAA處理后10 d、20 d 和30 d均顯著低于同期對照組。說明200 μmol/L 的外源IAA處理可以顯著降低桃果肉中蔗糖含量。同時,桃果實中葡萄糖和果糖含量在對照組和IAA處理組中都呈現一致的逐漸降低趨勢,且在各濃度IAA處理后10 d 和20 d 時均高于對照組,各濃度處理的果糖含量及200 μmol/L IAA處理葡萄糖含量增幅在20 d時均達到顯著水平,在各濃度IAA處理后30 d 時多與對照組間無顯著差異。另外,桃果實中山梨醇含量在各濃度IAA處理后10 d 時均顯著低于對照組,處理后20 d和30 d時均與對照組無顯著差異(圖 2)。可見,外源IAA處理對桃果肉中蔗糖含量影響最為顯著,其次是果糖和葡萄糖含量,各處理濃度中又以 200 μmol/L IAA 處理表現最為突出。

圖2 不同濃度IAA處理后桃果肉中蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量的變化

2.3 膨大期IAA處理對桃果實中果膠和纖維素含量的影響

植物細胞壁結構是決定果實硬度的關鍵因素,細胞壁是由纖維素、果膠和蛋白質組成的復雜結構,桃果肉中可溶性果膠、不可溶性果膠、總果膠和纖維素含量的測定結果如圖3所示。其中,桃果肉中可溶性果膠含量在0.1 μmol/L IAA處理后10 d和30 d均與同期對照組無顯著差異,處理后20 d顯著高于對照;在 10 μmol/L IAA處理后10 d和20 d與對照組均無顯著差異,處理后30 d顯著低于對照組;在200 μmol/L IAA處理10 d和30 d后均比對照顯著下降,處理后20 d與對照無顯著差異(圖3,A)。即桃果肉中可溶果膠含量在200 μmol/L IAA處理后整體低于對照組,在0.1 μmol/L IAA處理后均不同程度高于對照組。

圖3 不同濃度IAA處理后桃果肉中可溶性果膠、不可溶果膠、總果膠及纖維素含量的變化

圖4 不同濃度IAA處理后桃果實乙烯釋放量的變化

FC.差異倍數。

圖6 IAA處理組和對照組中差異表達基因在GO分類中富集程度高的30個條目

圖7 IAA處理組與對照組差異基因富集程度較高的20個代謝通路圖

圖8 響應IAA處理的桃果實成熟相關基因差異表達熱圖

同時,桃果肉中不可溶果膠含量在各處理組中均隨果實發育成熟呈下降趨勢,在處理后10 d表現為200,10 μmol/L IAA處理顯著高于對照組和0.1 μmol/L 處理組,在處理后20 d和30 d時各IAA處理組與對照組之間均無顯著差異(圖3,B)。桃果肉中總果膠含量在處理后10 d時也表現為200,10 μmol/L 處理顯著高于對照組和0.1 μmol/L 處理組,在處理后20 d時各處理組及對照之間均無顯著差異,在處理后30 d時0.1 μmol/L 處理顯著高于其他3組(圖3,C)。

另外,隨著桃果實發育成熟,各處理組桃果肉中纖維素含量均顯著下降,在不同處理時間之間存在顯著差異,說明纖維素含量與果實成熟軟化負相關。圖3,D顯示,在IAA處理后10 d和30 d時,桃果肉中纖維素含量在各處理組及對照組之間均無顯著差異;在處理后20 d時,各處理組均顯著高于對照組,但處理組之間無顯著差異。以上果膠和纖維素含量的變化表明,外源IAA處理對桃果肉中可溶性果膠含量的影響較大,而對不可溶果膠含量、纖維素含量多無顯著影響;可溶性果膠含量與果實的成熟軟化正相關,不可溶性果膠、總果膠和纖維素含量與果實的成熟軟化負相關。

2.4 膨大期IAA處理對桃果實中乙烯釋放量的影響

乙烯與果實的成熟密切相關,有必要了解不同濃度IAA處理對桃果實乙烯釋放量的影響。圖 4顯示,隨著IAA處理時間的增加,各處理組和對照組桃果實中乙烯釋放量的變化趨勢一致,在處理后20 d時均升至最高,至處理后30 d果實成熟時又均顯著下降;在IAA處理后10 d、20 d和30 d時,桃果實中乙烯釋放量均表現為0.1,10 μmol/L 處理與對照組無顯著差異,而200 μmol/L 處理組顯著低于對照組。這進一步表明200 μmol/L的外源IAA處理能夠延緩桃果實的成熟。

2.5 膨大期IAA處理對桃果實成熟相關基因表達的影響

為探討外源IAA在基因水平上對桃果實發育成熟的影響,本研究對200 μmol/L IAA處理后30 d的果實和對照組果實進行了轉錄組測序分析。結果表明,IAA處理組和對照組中共存在86個差異表達基因(DEG),其中60個基因表達量上調,26個基因表達量下調(圖 5)。

將篩選出來的差異表達基因進行GO 分析發現,所有差異表達基因均能夠得到注釋,圖 6 展示了富集最顯著的30個GO 條目,其中生物學過程分類中包含有植物激素響應條目。圖 7 顯示了86個差異表達基因在 KEGG 分類中富集最顯著的20條代謝途徑,其中包括植物激素信號轉導途徑。

進一步對KEGG代謝途徑分析發現其中有6個與果實發育成熟密切相關(圖 8),包括色氨酸代謝(Prupe.6G157500/YUCCA10、Prupe.5G011400/CAT1)、類黃酮生物合成(Prupe.1G376400/DFR、Prupe.I005800/PKS5)、戊糖和葡萄糖醛酸轉換(Prupe.4G261900/Endo-PG、Prupe.4G262200/Endo-PG、Prupe.7G192800/PME1)、植物激素信號轉導(Prupe.2G317100/SAUR32、Prupe.8G153800/PR1、Prupe.6G332500/AHP1、Prupe.5G035400/MYC2)、淀粉和蔗糖的代謝(Prupe.4G261900/Endo-PG、Prupe.4G262200/Endo-PG、Prupe.7G192800/PME1、Prupe.1G099000/GAE1)、類胡蘿卜素生物合成(Prupe.4G082000/NCED5)。轉錄組數據顯示外源IAA處理后,催化吲哚丙酮酸生成生長素的類黃素單加氧酶編碼基因(YUCCA10)的表達量顯著下降;與果實成熟軟化密切相關的多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲酯酶(PME1)基因的表達量均顯著下降。另外,與果實成熟密切相關的乙烯代謝途徑中4個ERF家族基因(Prupe.4G051400/ERF80、Prupe.4G176200/ERF78、Prupe.7G194400/ERF17、Prupe.8G125100/ERF109)的表達量在IAA處理后均顯著上升。以上對照和處理組中與果實成熟相關基因表達量的變化進一步表明一定濃度的外源IAA處理能夠影響桃果實發育成熟的過程。

為驗證轉錄組數據中基因表達譜的準確性和可重復性,從上述與果實發育成熟密切相關的代謝途徑中隨機選擇6個差異表達基因進行qRT-PCR驗證分析,包括Prupe.5G011400/CAT1、Prupe.1G376400/DFR、Prupe.7G192800/PME1、Prupe.5G035400/MYC2、Prupe.4G082000/NCED5和Prupe.4G051400/ERF80,含上調和下調基因。結果 (圖9)顯示,對于所檢測的6個候選基因,qRT-PCR結果與RNA-seq的轉錄豐度表達譜變化趨勢一致,表明RNA-seq數據的準確性和可靠性。

圖9 qRT-PCR 驗證6個差異表達基因的相對表達量

3 討 論

已知植物激素在果實的發育過程中發揮著重要的作用,且越來越多的研究發現生長素在果實發育中起著非常關鍵的作用,與果實坐果、生長密切相關[16-17]。外源生長素處理未成熟的果實可以延緩果實成熟,同時導致單性結實[3],也有研究發現生長素在果實成熟啟動時起重要作用[5],表明生長素在不同樹種以及同一樹種不同品種(基因型)間的作用機理存在差異,因此有必要開展進一步的研究。

果實的生長和成熟是復雜的發育過程,果實成熟時的風味是鮮食桃重要的育種性狀,其中糖是起決定作用的因素之一[18],其種類、含量和比例是衡量桃果實風味的重要指標[19-20]。桃果實的甜味主要是由可溶性糖含量決定的,包括蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇[21],其中蔗糖占可溶性糖的73%[22]。本研究發現 在200 μmol/L 生長素處理組中,桃果肉中蔗糖含量在處理后10 d、20 d 和30 d均顯著低于對照組,而其葡萄糖和果糖含量變化不顯著。已有研究顯示蔗糖含量與果實成熟度呈正相關[23-24],因此200 μmol/L 的外源IAA處理可能通過降低蔗糖含量延緩桃果實的成熟。桃果實中果膠-纖維素-半纖維素(P-C-H)結構的破壞,細胞壁中果膠和纖維素的部分或完全溶解以及淀粉和其他多糖的裂解是果實軟化的原因[1],本研究測定了IAA處理后桃果肉中果膠和纖維素含量的變化,結果顯示200 μmol/L IAA處理后果肉中不可溶果膠含量整體低于對照組,纖維素含量略高于對照組。已知可溶性果膠含量與桃果實帶皮硬度呈顯著負相關,纖維素含量與果實硬度呈正相關[25],因此,200 μmol/L IAA處理延緩了桃果實的軟化。

果實的成熟軟化始于細胞壁結構的破壞[26],細胞壁中果膠和纖維素的溶解以及多糖的裂解引起果實質地的變化,而細胞壁多糖的解聚大多是通過細胞壁修飾酶催化的,一般包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基酯酶(PME)、果膠裂解酶(PL)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶和甘露糖酶。已知PG是降解細胞壁中果膠的最主要酶[27],它的活性與果實軟化啟動正相關,在果實成熟時其活性快速增加,加速果膠降解,導致果實軟化,其可分為外切酶(Exo-PG)和內切酶(Endo-PG),已知桃果實的溶質階段伴隨著Endo-PG基因表達和酶活性的明顯增加[6,28]。本研究結果顯示IAA處理組與對照組的差異表達基因中存在多個與果實成熟密切相關的基因,涉及多個代謝途徑,其中參與戊糖、葡萄糖醛酸轉換和淀粉、蔗糖的代謝途徑的Prupe.4G262200/Endo-PG的表達量在IAA處理組中顯著低于對照組,表明200 μmol/L 的IAA處理后,桃果實中Endo-PG表達量降低,細胞壁中果膠降解變緩。此外同樣參與2個代謝途徑的PME能夠使多聚糖醛酸去酯化,參與細胞壁降解,其編碼基因表達水平在溶質型桃中明顯高于硬質型桃[29]。本研究中200 μmol/L IAA處理后PME1表達量也顯著低于對照組,以上結果與測得的果膠數據結果相對應。可見,利用200 μmol/L 的IAA噴施處于第2次快速膨大期的‘小白鳳’桃果實能夠延緩其發育成熟進程。