薯蕷皂苷對煙曲霉菌性角膜炎的作用及其機(jī)制

綦英合 尹敏 劉桂波 李翠

[摘要] 目的 探究薯蕷皂苷（DS）對煙曲霉菌（AF）性角膜炎的作用及其機(jī)制。方法 通過細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（CCK-8）和Draize眼表毒性實(shí)驗(yàn)分別檢測DS對RAW264.7細(xì)胞和小鼠角膜的毒性作用；應(yīng)用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、碘化丙啶攝取實(shí)驗(yàn)評估DS的抗真菌作用；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測RAW264.7細(xì)胞中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和核因子-紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）mRNA的表達(dá)，評估DS的抗炎作用；在AF性角膜炎小鼠模型中，通過裂隙燈拍照臨床評分評估DS對AF性角膜炎的改善作用；通過平板菌落計(jì)數(shù)和蘇木精-伊紅（HE）染色分別評估DS在體內(nèi)的抗真菌及抗炎作用。結(jié)果Nrf2的mRNA表達(dá)，并抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)（F=40.31～126.81，P<0.001）；臨床評分、平板菌落計(jì)數(shù)和HE染色結(jié)果均表明，16 mg/L的DS可以明顯改善AF引起的角膜炎癥反應(yīng)（F=18.27，P<0.001），降低真菌負(fù)荷（t=8.78，P<0.05）以及減少炎癥細(xì)胞的浸潤。結(jié)論 DS可通過抗真菌和抗炎作用改善AF性角膜炎。

[關(guān)鍵詞] 薯蕷皂苷；煙曲霉菌；抗真菌藥；角膜炎

[中圖分類號(hào)] R379.6;R772.21

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2023）04-0495-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.119

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230920.0938.007;2023-09-21 12：14：15

EFFECTS OF DIOSCIN ON ASPERGILLUS FUMIGATUS KERATITIS AND ITS MECHANISM OF ACTION QI Yinghe， YIN Min， LIU Guibo， LI Cui （Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）＼; [ABSTRACT] Objective To investigate the effects of dioscin （DS） on Aspergillus fumigatus （AF） keratitis and its mechanism of action. Methods The toxicity of DS was tested on RAW264.7 cells and mouse cornea by using Cell Counting Kit-8 assay （CCK-8） and the Draize eye test， respectively. The antifungal activity of DS was assessed by scanning electron microscopy， transmission electron microscopy， and propidium iodide uptake testing. The anti-inflammatory effect of DS was evaluated through mea-suring the mRNA expression levels of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and nuc-lear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） using quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. In a mouse mo-del of AF keratitis， the therapeutic effect of DS for AF keratitis was assessed by slit lamp photography-based clinical scoring. The in-vivo antifungal and anti-inflammatory effects of DS were assessed with plate colony counting and HE staining， respectively. Results CCK-8 and the Draize test demonstrated that DS at 16 mg/L had no significant toxic effects on RAW264.7 cells and mouse cornea （P>0.05）. Under the scanning electron microscope and transmission electron microscope， DS at 16 mg/L shrank and deformed fungal mycelia and damaged fungal organelles and cell membranes. The propidium iodide uptake test demonstrated that DS at 16 mg/L damaged cell membranes integrity. DS at 16 mg/L significantly increased Nrf2 mRNA expression， and significantly inhibited the mRNA expression of IL-1β， IL-6， and TNF-α （F=40.31-126.81，P<0.001）. According to clinical scoring， plate colony counting， and HE staining， DS at 16 mg/L significantly alleviated AF-caused inflammatory response of the cornea （F=18.27，P<0.001）， significantly reduced the fungal load （t=8.78，P<0.05）， and decreased the infiltration of inflammatory cells. Conclusion DS can ameliorate AF keratitis through its antifungal and anti-inflammatory effects.

[KEY WORDS] dioscin; Aspergillus fumigatus; antifungal agents; keratitis

真菌性角膜炎（FK）是一種由病原真菌引起的頑固性角膜疾病，如果治療不當(dāng)會(huì)引起角膜潰瘍、穿孔甚至失明^[1]。由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)導(dǎo)致眼外傷、術(shù)后角膜感染、隱形眼鏡的佩戴以及類固醇激素的濫用，F(xiàn)K的發(fā)病率越來越高^[2]。FK的嚴(yán)重程度與真菌病原體的毒力和宿主防御機(jī)制密切相關(guān)^[3]。一方面，真菌病原體的孢子侵入眼表，對角膜組織造成物理損傷，同時(shí)分泌毒力因子進(jìn)一步破壞角膜結(jié)構(gòu)^[4]；另一方面，真菌病原體侵入角膜會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞積累，進(jìn)一步促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致角膜潰瘍的延遲愈合^[5]。因此，抗真菌聯(lián)合抗炎治療是快速改善FK的關(guān)鍵。最近，中藥治療真菌感染引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。薯蕷皂苷（DS）是一種從薯蕷、穿山龍、閉鞘姜等多種植物根莖中分離提取的天然化合物，具有毒性低、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)^[6]。藥理學(xué)研究證明DS具有抗腫瘤、抗炎、抗真菌和降血脂等多種藥理作用^[7-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，DS通過破壞真菌細(xì)胞膜的完整性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子外流、細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)滲透壓發(fā)生改變，對白色念珠菌具有良好的抗菌活性^[11]，然而其是否對煙曲霉菌（AF）有作用目前尚不清楚。RAN等^[12]研究顯示，DS通過激活核因子-紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路，減少炎癥細(xì)胞浸潤，并抑制白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子的表達(dá)和分泌，從而改善炎癥反應(yīng)。本研究擬通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探究DS在AF性角膜炎中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 DS溶液的制備和AF培養(yǎng)

用精密電子天平稱量32 μg的DS加入至1 μL的DMSO中，然后用無菌PBS將該混合物稀釋至1 mL，得到32 mg/L的 DS儲(chǔ)存溶液，之后再用DMEM培養(yǎng)液將其稀釋至所需濃度。參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法^[13]，將AF株（NO3.0772，中國北京微生物中心）接種于沙氏液體培養(yǎng)基中，37 ℃孵育48 h，收集菌絲洗滌、離心、棄上清，將部分真菌活菌絲用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；另一部分用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇處理作為滅活菌絲用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。所有菌絲均用DMEM培養(yǎng)液和無菌PBS稀釋至3×10⁸CFU/L。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將RAW264.7細(xì)胞（購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）接種于12孔板中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)分為溶劑對照組（A組）、DS處理組（B組）、單純加菌組（C組）和加菌DS處理組（D組），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞密度約為80%時(shí)，向溶劑對照組和單純加菌組每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)0.000 1 的DMSO；DS處理組、加菌DS處理組每孔加入16 mg/L的 DS溶液1 mL，刺激1 h，再向單純加菌組和加菌DS處理組每孔加入滅活菌絲60 μL，6 h后收集細(xì)胞用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。

1.3 DS毒性測定

1.3.1 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的DS溶液（1、2、4、8、16和32 mg/L）處理，對照組用體積分?jǐn)?shù)0.000 1 的DMSO處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48 h后，每孔中加入10 μL CCK-8試劑并繼續(xù)在37 ℃條件下培養(yǎng)1 h。使用酶標(biāo)儀（ViCTOR Nivo 5s，PerkinElmer，美國）檢測450 nm波長處的吸光度值，以其作為細(xì)胞存活率的指標(biāo)。

1.3.2 Draize眼表毒性實(shí)驗(yàn) 取12只健康的8周齡C57BL/6雌性小鼠（購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司），隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組小鼠的右眼用16 mg/L的DS溶液點(diǎn)眼處理，對照組則用體積分?jǐn)?shù)0.000 1的DMSO點(diǎn)眼處理，每日4次。于點(diǎn)眼后的第1、3天進(jìn)行角膜熒光素鈉染色，并在裂隙燈下使用鈷藍(lán)光進(jìn)行拍照記錄。觀察小鼠角膜的染色程度。

1.4 體外抗真菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 菌絲形態(tài)及真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察 將濃度為3×10⁸CFU/L的煙曲霉分生孢子接種在6孔板上，37 ℃下培養(yǎng)24 h。應(yīng)用PBS洗滌3次，離心10 min后轉(zhuǎn)移至新的6孔板中，并向每孔中加入16 mg/L的DS或體積分?jǐn)?shù)0.000 1 DMSO溶液培養(yǎng)12 h。PBS洗滌后，用體積分?jǐn)?shù)0.025的戊二醛固定。采用相關(guān)文獻(xiàn)的方法^[14]，通過包埋、脫水、干燥處理固定菌絲。用JSM-840掃描電子顯微鏡（JOEL，日本）以1 000倍和5 000倍的放大倍數(shù)拍攝照片，用JEM-1200EX透射電子顯微鏡（JOEL，日本）以25 000倍的放大倍數(shù)拍攝照片，觀察菌絲形態(tài)以及真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.4.2 碘化丙啶（PI）攝取實(shí)驗(yàn)檢測AF細(xì)胞膜完整性 將濃度為3×10⁸CFU/L的煙曲霉分生孢子接種在6孔板上，37 ℃下培養(yǎng)24 h。PBS洗滌3次，離心10 min后轉(zhuǎn)移至新的6孔板中，并向每孔中加入16 mg/L 的DS或體積分?jǐn)?shù)0.000 1 DMSO溶液培養(yǎng)12 h。PBS沖洗菌絲，向每孔中加入50 mg/L的 PI溶液。隨后將孔板避光靜置15 min。使用Axio-Vert顯微鏡（Zeiss，Oberkochen，德國）在200倍放大倍數(shù)下獲取圖像。觀察不同處理組的熒光強(qiáng)度，以其反映AF細(xì)胞膜完整性。

1.5 qRT-PCR檢測Nrf2及細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)

使用RNAiso Plus試劑盒（Takara Biotechno-logy，中國大連）提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，并使用分光光度計(jì)對結(jié)果進(jìn)行定量。以提取的mRNA為模板，使用PrimeScript RT試劑盒（Vazyme）通過兩步法合成cDNA。按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法^[13]，使用梯度熱循環(huán)儀（Eppendorf MasterCycler）和TB Green預(yù)混物（Vazyme）進(jìn)行qRT-PCR，檢測細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Nrf2的mRNA表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參照。根據(jù)循環(huán)數(shù)計(jì)算基因的相對表達(dá)量。PCR所用引物及其序列見表1。

1.6 小鼠AF性角膜炎模型的建立及角膜感染情況的觀察

將24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為DMSO溶劑對照組（對照組）和DS組，每組12只。用80 g/L的水合氯醛對小鼠腹腔注射麻醉后，刮除小鼠右眼直徑約2 mm的中央角膜上皮，將5 μL AF活菌絲涂于刮除處，然后放置直徑為3 mm的角膜接觸鏡，縫合眼瞼。24 h后通過裂隙燈顯微鏡確認(rèn)小鼠AF性角膜炎模型建立成功后，在右眼結(jié)膜下注射體積分?jǐn)?shù)0.000 1 DMSO或16 mg/L的DS溶液，每天2次。建立模型后的第1天和第3天通過裂隙燈顯微鏡觀察小鼠角膜情況，按照相關(guān)文獻(xiàn)方法評估角膜炎的嚴(yán)重程度^[15]，分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)。于感染后的第3天處死小鼠，每組收集6只小鼠角膜進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)^[16]，收集另外6只小鼠眼球進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色^[5]，觀察小鼠角膜的真菌存活數(shù)量及炎癥細(xì)胞浸潤程度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析、兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DS對RAW264.7細(xì)胞和小鼠角膜的毒性

CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，DS濃度為0、1、2、4、8、16、32 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率分別為（100.00±4.19）%、（96.25±5.53）%、（94.32±7.85）%、（94.43±9.34）%、（93.93±7.32）%、（92.81±5.67）%和（45.76±9.03）%，DS濃度≤16 mg/L不會(huì)影響RAW274.7細(xì)胞的活力（P>0.05），而32 mg/L的DS溶液處理組細(xì)胞存活率與其他處理組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.01，P<0.01）。Draize眼表毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用16 mg/L的 DS點(diǎn)眼處理第1天和第3天小鼠角膜均無著染（圖1）。因此，選用16 mg/L 的DS溶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 DS對AF的影響

掃描電子顯微鏡觀察顯示，與DMSO組相比，DS組的菌絲皺縮、卷曲、質(zhì)地粗糙（圖2A～D）。透射電子顯微鏡觀察顯示，與對照組相比，DS組真菌細(xì)胞質(zhì)變得透明、細(xì)胞器和核膜溶解（圖2E、F）。PI攝取實(shí)驗(yàn)顯示，DS組的熒光強(qiáng)度明顯高于DMSO組（圖2G、H）。

2.3 DS對AF誘導(dǎo)的炎癥因子及Nrf2 mRNA表達(dá)的影響

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，DS處理（F_DS=20.06～56.13，P<0.001）、滅活菌絲處理（F_AF=467.65～1 355.97， P<0.001）、DS與滅活菌絲處理產(chǎn)生的交互效應(yīng)（F_DS×AF=23.44～71.12， P<0.001）對各因子mRNA表達(dá)的影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，不經(jīng)滅活菌絲處理時(shí)，DS處理和不處理對各因子mRNA的表達(dá)均無影響（P>0.05）；經(jīng)滅活菌絲處理時(shí)，DS處理較不處理各因子mRNA表達(dá)水平明顯降低（F=40.31～126.81， P<0.001）。見表2。

2.4 DS對AF小鼠模型角膜炎的作用

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裂隙燈觀察顯示，感染后的第1天，DS組與對照組的角膜炎嚴(yán)重程度無明顯差異（圖3A、B）；感染后的第3天，與對照組相比，DS組小鼠角膜混濁面積減小，潰瘍程度減輕（圖3C、D）。HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，DS組的炎癥細(xì)胞明顯減少，組織結(jié)構(gòu)更加有序（圖3E、F）。重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析顯示，時(shí)間、組別、時(shí)間和組別的交互作用對小鼠角膜炎癥臨床評分的影響差異有顯著性（F_時(shí)間=51.05，F(xiàn)_組別=11.99，F(xiàn)_{時(shí)間×組別}=8.39，P<0.001）；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，兩組小鼠感染第1天臨床評分差異無顯著性（P>0.05），感染后的第3天DS組小鼠較對照組臨床評分顯著降低（F=18.27，P<0.001），對照組和DS組感染后第3天較第1天臨床評分均有所升高（F=50.41、9.02，P<0.001）。見表3。平板菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，DS組感染角膜中的AF數(shù)量較對照組顯著減少（圖3G、H）；對照組和DS組的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果分別為411.40±29.59、76.00±7.14，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.78，P<0.05）。

3 討論

FK是一種致盲性角膜疾病，其難治性可能與致病真菌毒力和機(jī)體過度的免疫反應(yīng)有關(guān)^[17]。真菌分生孢子黏附于角膜上皮后，孢子開始萌發(fā)并且逐漸形成菌絲，發(fā)育中的菌絲通過自身的生長穿過上皮層并進(jìn)入基質(zhì)層，對角膜造成物理損傷^[18]。此外，真菌還能夠產(chǎn)生毒性因子（如磷脂酶和蛋白酶等），這些因子可以通過降解角膜組織提高真菌的侵襲性^[19]。真菌侵襲角膜激活了由免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以清除病原體^[20]。既往研究顯示，過度的免疫反應(yīng)不僅對病原體的清除沒有幫助，反而會(huì)導(dǎo)致感染部位炎癥細(xì)胞和細(xì)胞毒性物質(zhì)的大量積累，從而造成組織損傷、預(yù)后不良^[21]。因此，抗真菌聯(lián)合抗炎治療尤為重要。

DS是一種廣泛存在于薯蕷科植物根莖中的天然甾體皂苷，具有抗真菌和抗炎作用^[8-9]。本研究結(jié)果顯示，16 mg/L的DS對RAW264.7細(xì)胞和小鼠角膜無毒性作用；體外抗真菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DS通過破壞AF細(xì)胞膜、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，對真菌細(xì)胞造成不可逆的傷害，從而對AF起到明顯的抑制作用。CHO等^[11]研究顯示，DS侵入真菌細(xì)胞膜后破壞膜內(nèi)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮抗真菌活性。本文研究結(jié)果與其一致。為探究DS的體外抗炎作用，本文采用qRT-PCR方法檢測了DS對AF誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，DS可以顯著抑制TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表達(dá)。TNF-α、IL-1β及IL-6是參與角膜抗真菌免疫反應(yīng)的重要促炎細(xì)胞因子，主要由活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，促使免疫細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥因子，從而對角膜組織造成更嚴(yán)重的破壞^[22-23]。DS抑制這些促炎因子的基因表達(dá)，說明其可以抑制炎癥、縮短病程。Nrf2是重要的抗氧化調(diào)節(jié)因子，它可以通過阻斷TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的基因表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)^[24]。既往研究表明，Nrf2在促進(jìn)角膜傷口愈合中起重要作用，激活的Nrf2在外傷性角膜疾病中可以發(fā)揮良好的保護(hù)作用^[25]。本研究結(jié)果顯示，DS組Nrf2 mRNA水平相較于對照組明顯升高，說明DS可能通過提高Nrf2的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，減輕角膜受到炎癥反應(yīng)的傷害。

為進(jìn)一步驗(yàn)證DS的作用，本文建立了AF性角膜炎小鼠模型并進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與對照組相比，DS組小鼠角膜炎嚴(yán)重程度明顯得到改善，臨床評分顯著降低，說明DS可以有效降低小鼠角膜炎癥指數(shù)，改善感染所引起的角膜潰瘍。此外，HE染色結(jié)果也表明，DS可以減少炎癥細(xì)胞的浸潤、減輕小鼠角膜的炎癥反應(yīng)。WANG等^[26]研究顯示，DS可以減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，本研究結(jié)果與其一致。本文平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，DS組菌落數(shù)明顯少于對照組，表明DS在體內(nèi)可發(fā)揮抗真菌作用，抑制AF的生長。

綜上所述，DS通過抗真菌和抗炎作用改善AF性角膜炎。其可能機(jī)制為：①DS通過破壞菌絲結(jié)構(gòu)、減少真菌負(fù)荷抑制AF的生長，減弱AF的毒力作用；②DS通過增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)、調(diào)控促炎因子水平以及抑制炎癥細(xì)胞浸潤起到抗炎作用。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）