基于m⁷G相關miRNA的肝癌風險預后模型構建

邱康 朱謙 金晨 孫傳東

[摘要] 目的 探討N7-甲基鳥苷（m⁷G）相關miRNA對肝癌病人預后的影響。方法 從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫中獲取肝癌組織375例、癌旁組織50例miRNA表達數據和371例臨床數據，應用與肝癌預后相關的m⁷G基因篩選相關miRNA并構建預后模型，計算風險評分；基于風險評分對肝癌病人預后和免疫浸潤進行預測評估。結果 基于TCGA數據庫的miRNA差異表達和Cox回歸分析，最終得到11個m⁷G相關miRNA，分別為miR-4661-5p、miR-301a-3p、miR-760、miR-9-3p、miR-7156-5p、miR-561-5p、miR-3911、miR-513c-5p、miR-4652-3p、miR-346、miR-548aq-5p。用它們構建風險模型預測結果顯示，高風險組的整體生存水平顯著低于低風險組（HR=2.23，P<0.001），且風險評分作為獨立預后風險因素評價病人預后效果良好（CI=0.611（0.563～0.658））。根據預后風險模型獲得6個與免疫相關的差異表達基因，其中S100A8、KRT4、FCGBP與免疫浸潤呈正相關，而SOHLH1、CRISP2、CTSV與免疫浸潤呈負相關。結論 基于m⁷G相關miRNA構建的風險模型對于肝癌病人預后評價具有指導意義。

[關鍵詞] 肝腫瘤；N7-甲基鳥苷;比例危險度模型；微RNAs;預后

[中圖分類號] R735.7

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0541-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.135

[網絡出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230926.1407.002;2023-09-27 09：47：02

A PROGNOSTIC RISK MODEL FOR HEPATOCELLULAR CARCINOMA BASED ON M⁷G-RELATED MIRNAS QIU Kang， ZHU Qian， JIN Chen， SUN Chuandong （Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266071， China）＼; [ABSTRACT] Objective To explore the value of N7-methylguanosine （m⁷G）-related miRNAs for the prognosis of hepatocellular carcinoma. Methods Through The Cancer Genome Atlas （TCGA） database， we obtained the miRNA expression data of hepatocellular carcinoma tissues （375 cases） and paracancerous tissues （50 cases） as well as the clinical data （371 cases）. Based on the hepatocellular carcinoma outcome-associated m⁷G gene， related miRNAs were selected to construct a prognostic model and calculate the risk score. The risk score was used to predict the outcome and immune infiltration of patients with hepatocellular carcinoma. Results Through the TCGA-based differential expression and Cox regression analyses， 11 m⁷G-related miRNAs were determined： miR-4661-5p， miR-301a-3p， miR-760， miR-9-3p， miR-7156-5p， miR-561-5p， miR-3911， miR-513c-5p， miR-4652-3p， miR-346， and miR-548aq-5p. The risk model was established using these miRNAs. The model prediction results showed that the overall survival of the high-risk group was significantly lower than that of the low-risk group （HR=2.23，P<0.001）， and the risk score performed well when evaluating the outcome of patients as an independent prognostic risk factor （CI=0.611（0.563-0.658））. Six differentially expressed immune-related genes were determined according to the risk model： S100A8， KRT4， and FCGBP were positively correlated with immune infiltration， while SOHLH1， CRISP2， and CTSV were negatively correlated with immune infiltration. Conclusion The risk model based on m⁷G-related miRNAs is a helpful tool to predict the prognosis of patients with hepatocellular carcinoma.

[KEY WORDS] liver neoplasms; N7-methylguanosine; proportional hazards models; microRNAs; prognosis

肝癌是世界上是第七常見的癌癥類型，5年生存率僅有18%，是致死率第二高的腫瘤，僅次于胰腺癌^[1]。隨著環境中致癌因素的增加，肝癌在我國的發病率逐年上升^[2]。盡管目前的臨床管理已經極大地改善了肝癌病人的生存率，但由于轉移率高，肝癌病人的一般預后仍然極差^[3]。因此，了解肝癌的發病機制，找到一種評估病人預后以及指導臨床治療的方法十分重要。microRNA（miRNA）作為短的單鏈RNA分子可以通過翻譯抑制調節蛋白質編碼基因^[4]，肝組織miRNA在肝癌中表達失調，參與了肝癌的發生和發展^[5]。肝癌細胞通過多種方式影響miRNA的功能，包括染色體改變、聚腺苷基化修飾及轉錄因子的異常表達等^[6]。N7-甲基鳥苷（m⁷G）具有特定修飾依賴性化學性質，普遍存在于哺乳生物中并且修飾特定轉錄位置。m⁷G存在于真核生物mRNA的5端帽中，且在轉運RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、小核RNA（snRNA）和小核仁RNA（snoRNA）等其他種類的RNA中也發現了類似情況^[7]。已有研究表明，介導內部m⁷G修飾的最具特異性酶甲基轉移酶樣1（METTL1）和其輔助因子WDR4，參與調節miRNA的m⁷G修飾，從而影響生物發生和細胞遷移^[8]。本研究基于生物信息學方法，應用腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫構建了m⁷G修飾相關的miRNA的風險預后模型，并利用Estimate數據庫對免疫細胞浸潤和免疫功能進行分析，旨在構建一個模型來評價肝癌病人的預后，為肝癌病人的治療和預后評價提供參考。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 數據下載與處理

從TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）中檢索并下載肝癌的miRNA表達數據和臨床特征數據，其中正常組織50例，腫瘤組織375例，臨床數據371例。利用軟件Strawberry Perl 5.32.1.1將基因表達數據進行轉換整理為表達矩陣，用于后續分析。GSEA數據庫（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下載得到m⁷G相關基因并進行單因素Cox回歸篩選，得到差異基因用于后續分析。在Estimate數據庫中下載肝癌相關的373個樣本的免疫評分，用于后續免疫細胞浸潤和免疫功能的分析。

1.2 m⁷G差異基因分析

使用R語言中的“edgeR”和“Limma”包，分析腫瘤組織和正常組織間差異基因的表達情況。差異基因的篩選標準：|log₂FC|≥1，P<0.05。

1.3 構建m⁷G風險評分模型

利用“survival”包和“glmnet”包對差異表達miRNA進行單因素和多因素回歸分析，得到預后相關miRNA；同時結合臨床數據計算模型的風險評分，構建m⁷G風險評分模型。公式為：風險評分（Riskscore）=∑回歸系數×基因表達量。然后利用“Rtsne”包執行PCA分析。依據風險評分，繪制Kaplan-Meier生存曲線以及ROC曲線，進一步對該模型準確性進行評估。

1.4 風險評分與臨床因素分析

利用“survival”包構建具有風險評估和臨床因素的Cox模型。在臨床肝癌病人中，通過單因素和多因素Cox回歸分析，評估影響其預后的獨立危險因素。

1.5 功能富集分析

使用R語言中的“clusterprofile”“enrichplot”“ggplot2”包進行基因本體（GO）和KEGG通路分析，以確定與差異表達的m⁷G相關miRNA的作用位點和信號通路。

1.6 風險評分模型與免疫浸潤的相關性分析

利用“Limma”包和“edgeR”包對肝癌病人高風險組和低風險組進行基因表達差異分析（篩選標準：|log₂FC|>1，FDR<0.05）。采用“GSVA”包中的基因集富集分析算法（ssGSEA）計算肝癌病人免疫細胞和免疫功能表達的基因豐度并繪制熱圖，進行免疫細胞和功能的相關性分析，比較高風險組和低風險組的免疫細胞表達及免疫功能。

1.7 統計學處理

利用R語言軟件（4.1.3）進行統計學分析。應用單因素和多因素Cox回歸分析風險模型的獨立預后價值，Kaplan-Meier法進行生存分析，Mann-Whitney檢驗比較兩組免疫浸潤和免疫通路激活情況。所有生存結局均以P值和風險比（HR）表示，置信區間（CI）為95%。P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 肝癌病人與m⁷G相關的miRNA差異基因

從GSEA數據庫下載得到34個可能與m⁷G相關的基因，通過單因素Cox分析肝癌病人預后數據，結合相關文獻結果^[1]篩選出12個與m⁷G相關的基因。利用TargetScan數據庫預測m⁷G調控的相關miRNA，并得到相應表達矩陣。結合TCGA數據庫中肝癌病人的miRNA數據與得到的m⁷G相關miRNA進行差異分析，根據相關篩選標準（|log₂FC|>1、FDR<0.05）獲得363個miRNA差異基因并繪制火山圖（圖1A）。其中上調基因320個，下調基因43個，差異表達最顯著的前20個上游miRNA熱圖見圖1B。

2.2 Lasso回歸篩選m⁷G相關miRNA

對363個差異表達miRNA與生存時間取交集進行單因素 Cox回歸分析，結果顯示共有32個miRNA與肝癌病人的預后顯著相關。將候選的32

4期邱康，等. 基于m⁷G相關miRNA的肝癌風險預后模型構建543

個miRNA納入Lasso回歸構建模型，選取誤差最低的數值，進一步篩選出11個有意義的特征基因miRNA，分別為miR-4661-5p、miR-301a-3p、miR-760、miR-9-3p、miR-7156-5p、miR-561-5p、miR-3911、miR-513c-5p、miR-4652-3p、miR-346、miR-548aq-5p（圖2A、B）。根據臨床生存時間進行多因素Cox回歸分析顯示，結果顯示has-miR-5p、has-miR-9-3p、has-miR-3911、hsa-miR-513c-5p、has-miR-4652-3p、has-miR-538aq-5p差異有統計學意義（HR=1.004～1.553，P<0.05）。見圖2C。

2.3 m⁷G相關miRNA的風險模型構建

應用上述11個與m⁷G相關的miRNA構建風險模型，并且基于風險評分將肝癌病人分為高、低風險組。PCA聚類分析結果表明，二者區分明顯（圖3A）。根據風險評分構建Kaplan-Meier曲線，經Cox回歸分析顯示，低風險組的整體生存水平明顯高于高風險組（HR=2.23，P<0.001） （圖3B）。ROC曲線分析結果顯示，肝癌病人的模型風險評分對1、3、5年生存評估的AUC分別為0.674、0.725和0.697（圖3C）。

2.4 風險評分與臨床因素的模型構建

為了評估風險水平模型在臨床中的預測效果，將風險水平與臨床因素中的年齡、性別、腫瘤分期（G₀=T₁+T₂，G₁=T₃+T₄）和風險評分納入分析。根據風險評分以及臨床因素繪制列線圖，對肝癌病人的預后進行預測，結果顯示，該預測模型的一致性指數（C-index）為0.611（0.563～0.658），肝癌病人第1、3、5年的生存率分別為78.1%、51.8%和37.1%（圖4A）。為了進一步評估預測模型是否符合實際情況，采用Bootstrap自抽樣法進行檢測，并繪制了預測模型的校準曲線。結果表明，3年和5年擬合線重合度較高，表明該預測模型具有較好的生存預測功效，其3年和5年生存期預測值與實際值相似（圖4B）。為了鑒別預測模型的區分度，繪制了預測模型的ROC曲線，結果顯示1、3、5年的AUC分別為0.613、0.701和0.673（圖4C）。

2.5 風險評分與免疫評分相關基因的功能分析

對風險模型與免疫功能的相關性分析顯示，在風險模型中的高風險和低風險組中發現了539個差異表達的mRNA。將來自Estimate數據庫的經免疫評分分組的960個基因與風險模型的差異表達基因相交，產生183個與風險模型和免疫浸潤相關的mRNA（圖5A）。GO分析顯示，這些基因主要參與了消化、內分泌過程、攝食行為等生物學過程（BP）；細胞成分（CC）主要富集在含膠原蛋白的細胞外基質、分泌顆粒腔、細胞質囊泡腔中；分子功能（MF）富集的主要是受體配體活性、信號受體激活劑活性、生長因子活性等（圖5B）。KEGG分析顯示，神經活性配體-受體相互作用、胰腺分泌、蛋白質的消化吸收是主要參與的富集通路（圖5B）。在眾多基因中篩選出了與免疫功能和免疫細胞相關的mRNA，其中S100A8、KRT4、FCGBP與免疫浸潤呈正相關，而SOHLH1、CRISP2、CTSV則與免疫浸潤呈負相關（圖5C）。

2.6 風險模型與免疫微環境之間的關系

應用ssGSEA分析肝癌病人風險評分與免疫細胞表達豐度以及免疫功能相關性結果顯示，高風險和低風險組中輔助性T細胞、人類白細胞抗原（HLA）和主要組織相容性復合物Ⅰ類（MHCⅠ）在腫瘤免疫微環境中顯著表達（圖6A）。腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）和CD8⁺T細胞在肝癌病人腫瘤免疫微環境中相關性最高（r=0.870），濾泡輔助性T細胞（Tfh）和肥大細胞的相關性最低（r=-0.004），在免疫功能中T細胞共抑制途徑和免疫檢查點顯示最高的正相關性（r=0.930）（圖6B）。高風險組活化的樹突狀細胞（aDCs）、巨噬細胞相較于低風險組富集更明顯（P<0.05），而低風險組中B細胞、肥大細胞、中性粒細胞、NK細胞、輔助性T細胞、細胞溶解活性、亞炎癥以及Ⅰ、Ⅱ型干擾素反應均顯著升高（P<0.05）（圖6C）。因此，肝癌高風險組病人可能更傾向于應用抗巨噬細胞或抗aDCs細胞進行免疫治療。

3 討論

m⁷G是最普遍的RNA修飾之一，有研究表明m⁷G修飾顯著參與腫瘤的發生發展^[9]。此外，m⁷G修飾不僅發生在mRNA、rRNA、tRNA上，還通過修飾miRNA介導RNA的代謝和功能^[8]。但是針對m⁷G修飾miRNA是否同樣影響了肝癌的發生發展，尚未見報道。既往研究表明，miRNA在轉錄后水平上調節基因的表達，在人的肝癌和正常肝臟中的表達存在顯著差異，miRNA的失調提示肝臟可能發生早期癌變^[10]。已有研究結果顯示，m⁷G修飾相關基因METTL1和WRD4參與了對miRNA的調控，推測可能有更多的m⁷G修飾基因參與了miRNA的調控。本研究提取肝癌中具有預后價值的m⁷G相關基因，篩選下游相關miRNA構建風險模型，評估模型的預測價值，為臨床治療提供參考。

本研究通過肝癌的預后數據篩選得到了12個m⁷G相關基因，并通過Cox和Lasso回歸分析構建模型，篩選出11個受m⁷G修飾影響的miRNA。其中血清外泌體中的miR-4661-5p可以作為早期肝癌的潛在診斷標志物^[11]，miR-301a-3p可以通過靶向VGLL4抑制肝癌的惡性進展，miR-760可以調控下游的NACC-1促進肝癌的發生發展^[12]，miR-561-5p通過影響CX3CR1/NK細胞的浸潤和功能促進轉移性肝癌的發生發展^[13]，海綿化的miR-346在circMDK促進肝癌進展的過程中發揮作用^[14]，而miR-9-3p則通過下調TAZ在肝癌細胞中發揮腫瘤抑制作用^[15]。目前肝癌研究中尚未見miR-7156-5p、miR-3911、miR-513c-5p、miR-4652-3p、miR-548aq-5p報道，其功能和機制有待進一步研究。

本文通過12個相關miRNA與生存時間構建風險模型，計算風險評分并進行PCA聚類分析，結果顯示風險評分能夠較好地將病人區分為高低風險組；Kaplan-Meier分析顯示，高風險和低風險組病人生存率存在差異，低風險組存活率顯著高于高風險組；ROC曲線分析顯示，該模型的1、3和5年生存率的AUC均大于0.6，表明預后模型具有預測價值，尤其是對肝癌病人3年生存率的預測。本文根據臨床因素建立預后模型列線圖分析顯示，風險評分對于病人預后的評價具有顯著意義，根據風險評分構建的預后模型可以更好地預測臨床病人的預后情況，為臨床治療提供指導意見。

RNA甲基化修飾除了直接影響腫瘤發展外，還通過調節腫瘤免疫力來影響腫瘤治療的有效性^[16]。作為m⁷G的關鍵基因，METTL1在肝癌放療中可能通過m⁷G修飾參與了免疫微環境的調節^[17]。本文利用已經構建的風險模型與免疫相關基因分析得到m⁷G修飾相關miRNA的下游基因，并分別進行了功能富集分析和相關免疫功能和免疫細胞的分析，結果顯示，受體配體活性、信號受體激活劑活性與免疫浸潤的抗腫瘤免疫力相關^[18]；ssGSEA分析結果顯示，在m⁷G相關的免疫環境中，輔助性T細胞、HLA和MHCⅠ的表達水平更高。不同風險組免疫浸潤相關表達豐度分析顯示，高風險組肝癌病人可能更傾向于抗巨噬細胞或抗aDCs細胞的免疫治療，提示m⁷G相關的miRNA可能與免疫浸潤有關，這可為免疫治療提供可能的指導方案。

綜上所述，本文研究構建了與m⁷G修飾相關miRNA的風險預后模型，將肝癌病人分為高低風險組，基于風險評分構建預測模型對于肝癌病人的預后評價良好。風險評分可以作為預測病人預后的獨立預后因素，對于病人的預后預測有著顯著意義。免疫浸潤相關分析提示高風險組病人的預后與巨噬細胞和aDCs細胞顯著相關，可能作為免疫治療的潛在方向。該模型的建立有助于為肝癌病人的生存和免疫治療提供預測和指導，但是其實際價值還有待于更大樣本量和相關實驗的驗證。

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（本文編輯 黃建鄉）