N-乙酰半胱氨酸聯合頭孢西丁對金黃色葡萄球菌的體外藥敏試驗研究

吳桐，谷海瀛,2

N-乙酰半胱氨酸聯合頭孢西丁對金黃色葡萄球菌的體外藥敏試驗研究

吳桐1，谷海瀛1,2

1.寧波大學醫學部，浙江寧波 315211；2.寧波大學醫學院附屬醫院消化病實驗室，浙江寧波 315020

使用頭孢西丁（cefoxitin，FOX）分別與未處理的N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）和酸堿度調節至中性的NAC對金黃色葡萄球菌（，）ATCC29213、ATCC43300進行體外聯合藥敏試驗，檢測FOX與NAC聯合應用對的作用，評估NAC的酸性特性在發揮藥物效果中的影響。微量肉湯稀釋法測定藥物最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）；棋盤法進行聯合藥物敏感性試驗，結晶紫染色法測定生物被膜（biofilm，BF）形成量，激光共聚焦顯微鏡觀察菌落成分變化。調節NAC至中性再次進行上述試驗。FOX對ATCC29213和ATCC43300的MIC分別為2μg/ml和32μg/ml，NAC對2菌株的MIC均為4mg/ml。酸度調節至中性的NAC對ATCC29213和ATCC43300的MIC均>64mg/ml。保持弱酸性的NAC與FOX間存在相加作用，BF含量、細菌數量、BF多糖成分均有所下降；中性的NAC與FOX聯合應用時藥物間作用效果為無關甚至拮抗，未出現上述作用效果。NAC的存在一定程度上可增加體外條件下對FOX的敏感性，降低細菌數量和BF的形成量，且不因菌株耐藥性的不同而存在明顯差異，但這種作用依賴于NAC自身的酸性。

金黃色葡萄球菌；生物被膜；N-乙酰半胱氨酸；抗生物被膜

金黃色葡萄球菌（，）是常見的革蘭陽性病原菌之一，能夠持續定植于大約30%的健康成年人的鼻咽部，并在多達60%的人群中間歇定植，是醫院和社區獲得性感染的主要病原菌之一[1]。據2021年CHINET中國細菌耐藥監測顯示，在臨床革蘭陽性細菌分離株中高居首位，約31.2%，而其中耐甲氧西林的的檢出率高達30.0%[2]。盡管抗菌藥物不斷開發迭代，但目前對治療的選擇仍十分有限，在具有多藥耐藥性感染相關的最重要的ESKAPE組（屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌屬）中，也因較高的毒性和強大的可塑性及適應性占據特殊地位，生物被膜（biofilm，BF）形成是維持感染和產生藥物耐受的一種重要方式[3-5]。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）（C?H?NO?S）是一種具有弱酸性的硫醇化合物，是谷胱甘肽合成的前體及活性氧清除劑，現常作為祛痰藥用于呼吸系統疾病的輔助治療[6]。NAC的廣泛應用不僅因其具有良好的抗氧化性和自由基清除活性，還因其作為硫醇分子，性質非常穩定，人體對濃度高達1200mg/ml的NAC仍具有良好的耐受性[7]。

現有研究表明NAC對多種細菌具有抑制作用，能夠抑制細菌BF形成，并可與多種抗生素產生協同效應[8-10]。此外，有研究者認為NAC可提高ATCC29213的β-內酰胺類抗生素敏感性，甚至10mmol/LNAC可將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant，MRSA）轉變為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin- susceptible，MSSA），但相關試驗依據缺乏[11]。FOX屬半合成β-內酰胺類抗生素，可作用于青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）而抑制細菌細胞壁中肽聚糖的合成來發揮其抗菌作用[12]。在美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）中，FOX被認為是檢測葡萄球菌mecA基因介導的甲氧西林耐藥性的可靠藥物，并規定當的FOX最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）>4μg/ml時可將其判定為MRSA。故本研究選取FOX與NAC對ATCC29213和ATCC43300進行體外藥敏試驗，探究藥物對的作用，并評估NAC的弱酸性質對藥物作用效果的影響，以期為相關感染的臨床治療藥物選擇提供一定的參考信息。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 試驗菌株ATCC29213和ATCC43300均為購于北京北納生物科技有限公司的二代菌株。試驗前使用MALDI TOF MS對菌株進行鑒定。

1.1.2 試驗菌液 新鮮無菌MHB液體培養基制備0.5麥氏濃度的菌液，稀釋1000倍后用于試驗。

1.2 主要試劑和儀器

NAC和FOX購自上海梯希愛化成工業發展有限公司；MHB培養粉購自英國OXOID公司；結晶紫購自美國Sigma公司；碘化丙啶和50%戊二醛購自上海麥克林生化科技有限公司；FITC-conA購自上海懋康生物科技有限公司。FOX藥敏凍干板、NAC藥敏凍干板、FOX與NAC聯合藥敏凍干板購自寧波迅檢生物科技有限公司。

生物安全柜購自蘇州金凈凈化設備科技有限公司；比濁儀和VITEK MS質譜儀購自生物梅里埃公司；全波長酶標儀和–80℃超低溫冰箱購自賽默飛世爾科技有限公司；培養箱購自上海躍進醫療器械有限公司；LEICA TCS SP8激光共聚焦顯微鏡購自德國徠卡公司。

NAC使用NaOH溶液調節至pH 6.8～7.0。NAC藥敏凍干板濃度范圍為0.0625～64.0000mg/ml，FOX藥敏凍干板濃度范圍為0.125～128.000μg/ml，每列第12孔均為藥物空白孔。FOX與NAC聯合藥敏凍干板，橫排為FOX，1～11孔濃度梯度為1/128～8MIC；每列B～H孔添加NAC，濃度為1/16～4MIC；每塊藥敏凍干板的H1、A12孔為藥物空白孔[13]。

1.3 MIC測定

向藥敏凍干板中每孔加入110μl試驗菌液，置于35°C環境中22h，觀察各培養孔中細菌的生長情況，確定藥物對ATCC29213和ATCC43300的MIC。

1.4 聯合藥敏試驗與部分抑菌濃度指數

向聯合藥敏凍干板中每孔加入110μl試驗菌液，置于35°C環境中22h，觀察各培養孔中細菌的生長情況，根據部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）藥A聯合藥A單藥藥B聯合/藥B單藥對藥物之間的作用效果進行判斷[14]。

1.5 結晶紫法測定BF形成量

藥敏板的選擇、菌液接種與培養同1.4。取出聯合藥敏板，棄去孔內液體，使用無菌生理鹽水清洗2次；99%甲醇固定15min；0.2%結晶紫染液染色10min；無菌蒸餾水洗滌至無染液流出；每孔加入110μl 95%乙醇，混勻后測量各孔600nm處的吸光度[15]。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察藥物作用后BF變化情況

藥敏板的選擇、菌液接種與培養同1.4。根據聯合藥敏試驗及FICI選擇合適的培養孔。取潔凈玻片編號，每載玻片上滴加170μl無菌蒸餾水，吸取10μl的培養物至玻片上的蒸餾水中，室溫晾干。80μl 2.5%戊二醛溶液，置于4℃環境中1.5h固定；PBS沖洗； 20.0μg/ml的FITC-conA熒光染液80μl，避光放置于4℃環境中30min；PBS沖洗；10.0μg/ml的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液100μl，置于37℃環境中、20min避光孵育；PBS沖洗，晾干，封片。LEICA TCS SP8激光共聚焦顯微鏡，分別在488nm和552nm發射波長的濾光器下觀察。

1.7 統計學方法

2 結果與分析

2.1 兩株S. aureus的藥物MIC

藥物對ATCC29213和ATCC43300的MIC見表1。對培養物吸光度的測定結果顯示，當NAC的濃度超過0.125mg/ml時，細菌的數量開始出現顯著下降。而使用NaOH溶液將NAC的pH值調節至6.8～7.0時，NAC對ATCC29213和ATCC43300的MIC均顯示>64mg/ml，培養物吸光度僅在中性NAC達8mg/ml或更高時，才出現較明顯的下降，見圖1。

表1 藥物對S. aureus ATCC29213和ATCC43300的MIC

2.2 聯合藥敏試驗與FICI

根據藥物MIC值確定聯合藥敏試驗中藥物的濃度范圍，NAC為0.25～16.00mg/ml，ATCC29213的FOX濃度為0.015～16.000μg/ml，ATCC43300的FOX濃度為0.25～256.00μg/ml。

在未對酸堿度進行調節的情況下，FOX和NAC聯用對ATCC29213和ATCC43300表現出相似的抗菌效果。在MSSA菌株ATCC29213的96孔藥敏培養板中，B4、C4、D4、D5、E4、E5、E6、E7孔中均未見細菌生長，通過計算FICI，僅D5、E5、E6、E7四孔內藥物之間表現為相加作用，其余培養孔的藥物之間的相互作用均表現為無關；其中，E7孔作用效果最佳，其FICI值為0.625；D5、E6兩孔的FICI值相同，為0.75；E5孔FICI值最大，為1.0。

圖1 NAC酸堿度改變時兩株S. aureus菌液吸光度的變化（OD600）

A.ATCC29213；B.ATCC43300；C.中性條件下ATCC29213；D.中性條件下ATCC43300

注：OD600為600nm處的吸光度值；與藥物空白孔比較，*<0.05；#<0.01；△<0.001；▲<0.0001

對耐藥菌株ATCC43300，在聯合藥敏板FOX單藥孔中測得的MIC值為8μg/ml，故FICI計算中使用8μg/ml。在未調節酸堿度的情況下，B6、C6、D6、D7、E6、E7、E8、E9孔內未見細菌生長，D7、E7、E8、E9孔顯示出兩種藥物之間具有相加作用，其FICI分別為0.750、1.000、0.750、0.625，其余培養孔則均表現為無關作用，見圖2。

2.3 藥物作用后S. aureus BF總生物量測定

使用結晶紫染色對BF總生物量進行測定。未調節pH時，亞抑菌濃度FOX作用下ATCC29213和ATCC43300的BF含量均隨著NAC濃度的升高而降低，與同濃度FOX單獨作用相比，聯合用藥時BF分別減少37.3%～56.5%和28.1%～41.4%不等；與藥物空白孔相比，此時ATCC29213和ATCC43300 BF的最大減少量分別為49.7%和43.4%。同樣的聯合藥物濃度在中性條件下BF量則表現出與細菌數量相似的增加，甚至可高達70%，見表2。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察結果

兩株激光共聚焦顯微鏡下所見BF熒光標記特點相似，無藥物作用的培養物中標記菌體的PI所發出的紅色熒光及標記多糖類物質的FITC-conA發出的綠色熒光亮度高、范圍大、聚集性強；亞抑菌濃度的FOX單獨作用時，紅和綠兩種熒光的強度略有下降，并變得更為分散，這種變化特點隨著藥物濃度的升高會變得更明顯。而在具有藥物相加作用的各孔中，標記BF的綠色熒光更分散，熒光強度更弱，紅色熒光標記的菌體數量大幅減少，熒光強度微弱；與之對應的中性NAC聯合作用孔鏡下表現介于低濃度FOX單獨作用或無藥物作用時，紅和綠兩種熒光的亮度強、范圍大，且呈現出聚集趨勢，見圖3。

3 討論

本試驗選取藥物敏感性不同的ATCC29213和ATCC43300進行FOX和NAC的藥物聯合試驗，并調節NAC至中性進行試驗，以觀察兩種藥物單獨及聯合應用對菌株的影響，同時評估NAC弱酸特性在其中的作用。研究結果表明保持弱酸性質的NAC單獨作用時已具備良好的抗菌、抗BF形成能力，當與FOX聯合應用時，可一定程度上增加ATCC29213和ATCC43300對FOX的敏感性，減少BF的形成量和其中的細菌數量、多糖成分含量。這可能與NAC競爭性抑制細菌對半胱氨酸的攝取、通過硫醇–二硫鍵交換還原蛋白質并降低其交聯程度、在細菌細胞質中解離并酸化胞質造成菌體蛋白變性和遺傳物質的損傷相關[16-18]。但也有研究表明，NAC的抑菌效果與其pH之間沒有明顯關聯，1mmol/ml的NAC幾乎可完全裂解細菌培養物中的雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA），即使其變為中性，這種裂解也保持在50%左右，而細胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）對BF的發育和結構的完整性來說至關重要，NAC破壞BF的關鍵或許在于eDNA的降解，但需進一步探索[19-21]。

圖2 具有藥物相加作用的培養孔與同濃度FOX單獨作用、同濃度FOX與中性NAC聯用時S. aureus ATCC29213培養物OD600比較

A.ATCC29213；B.ATCC43300

注：<0.001

表2 NAC與FOX聯合藥敏板中S. aureus ATCC29213 BF結晶紫染色的吸光度（未調節pH，OD600）

圖3 藥物作用22h后S. aureus ATCC29213激光共聚焦下的熒光圖像（×40）

A.E6孔；B.D5孔；C.E7孔；D.H1孔；E.E6孔（pH6.8～7.0）；F.D5孔（pH6.8～7.0）；G.E7孔（pH 6.8～7.0）；H.A12孔

是臨床常見病原菌，其BF形成能力是產生藥物耐受的重要原因之一，與之相關的感染在治療和診斷上仍存在著較大的困難。本試驗僅選取ATCC29213和ATCC43300進行體外藥物敏感試驗，但除了單物種BF外，包含不同種、屬的混合BF在人類宿主中也十分常見。這種混合BF內積累的生存阻力相對更大，其中的細菌更易通過抗性基因的水平轉移等方式增強自身抵抗力，導致實際治療中包括常規一線藥物在內的多數抗生素難以根除這些與BF關聯的感染，給人類健康和疾病治療帶來艱巨挑戰[22]。因此，進一步開展對臨床分離株及混合病原菌的聯合藥物敏感試驗十分必要。

尋找針對細菌BF的新型治療方法是當前的緊迫問題，其在臨床實踐中扮演著十分重要的角色，但新藥的開發費用較高且過程緩慢，藥物再利用就成為另一種合理有效的解決辦法。本試驗結果有助于支持使用NAC作為具有抗細菌BF應用潛力的候選藥物用于預防和治療BF的形成。

[1] KWIECINSKI J M, HORSWILL A R.bloodstream infections: Pathogenesis and regulatory mechanisms[J]. Curr Opin Microbiol, 2020, 53: 51–60.

[2] 胡付品, 郭燕, 朱德妹, 等. 2021年CHINET中國細菌耐藥監測[J]. 中國感染與化療雜志, 2022, 22(5): 521–530.

[3] LEE A S, DE LENCASTRE H, GARAU J, et al. Methicillin-resistant[J]. Nat Rev Dis Primers, 2018, 4: 18033.

[4] MLYNARCZYK-BONIKOWSKA B, KOWALEWSKI C, KROLAK-ULINSKA A, et al. Molecular mechanisms of drug resistance in[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(15): 1–33.

[5] MOORMEIER D E, BAYLES K W.biofilm: A complex developmental organism[J]. Mol Microbiol, 2017, 104(3): 365–376.

[6] 楊中瀾, 王敏, 周莉莉, 等. 乙酰半胱氨酸的藥理作用與臨床應用[J]. 中國臨床藥理學雜志, 2021, 37(14): 1932–1936.

[7] CALVERLEY P, ROGLIANI P, PAPI A. Safety of N-acetylcysteine at high doses in chronic respiratory diseases: A review[J]. Drug Saf, 2021, 44(3): 273–290.

[8] PéREZ-GIRALDO C, RODRíGUEZ-BENITO A, MORáN F J, et al. Influence of N-acetylcysteine on the formation of biofilm byepidermidis[J]. J Antimicrob Chemother, 1997, 39(5): 643–646.

[9] POLLINI S, BONCOMPAGNI S, DI MAGGIO T, et al. In vitro synergism of colistin in combination with N-acetylcysteine againstgrown in planktonic phase and in biofilms[J]. J Antimicrob Chemother, 2018, 73(9): 2388–2395.

[10] MANOHARAN A, OGNENOVSKA S, PAINO D, et al. N-acetylcysteine protects bladder epithelial cells from bacterial invasion and displays antibiofilm activity against urinary tract bacterial pathogens[J]. Antibiotics (Basel), 2021, 10(8): 1–17.

[11] YANG F, ZHANG S, SHANG X, et al. Short communication: N-acetylcysteine-mediated augmentation of β-lactam antibacterial activity against methicillin- resistantisolated from bovine mastitis cases[J]. J Dairy Sci, 2019, 102(8): 6920–6922.

[12] SAENHOM N, KANSAN R, CHOPJITT P, et al. Evaluation of in-house cefoxitin screening broth to determine methicillin-resistant[J]. Heliyon, 2022, 8(2): e08950.

[13] LEBER A. Synergism testing: Broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods[M]. Washington, DC: ASM Press, 2016: 11–23.

[14] 丁麗, 陳佰義, 李敏, 等. 碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯合藥敏試驗及報告專家共識[J]. 中國感染與化療雜志, 2023, 23(1): 80–90.

[15] KAMBLE E, SANGHVI P, PARDESI K. Synergistic effect of antibiotic combinations onbiofilms and their persister cell populations[J]. Biofilm, 2022, 4: 100068.

[16] DINICOLA S, DE GRAZIA S, CARLOMAGNO G, et al. N-acetylcysteine as powerful molecule to destroy bacterial biofilms. A systematic review[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(19): 2942–2948.

[17] NAGY P. Kinetics and mechanisms of thiol-disulfide exchange covering direct substitution and thiol oxidation-mediated pathways[J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 18(13): 1623–1641.

[18] KUNDUKAD B, SCHUSSMAN M, YANG K, et al. Mechanistic action of weak acid drugs on biofilms[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 4783.

[19] AMARAL E P, CONCEI??O E L, COSTA D L, et al. N-acetylcysteine exhibits potent anti-mycobacterial activity in addition to its known anti-oxidative functions[J]. BMC Microbiol, 2016, 16(1): 251.

[20] PANLILIO H, RICE C V. The role of extracellular DNA in the formation, architecture, stability, and treatment of bacterial biofilms[J]. Biotechnol Bioeng, 2021, 118(6): 2129–2141.

[21] MANOHARAN A, DAS T, WHITELEY G S, et al. The effect of N-acetylcysteine in a combined antibiofilm treatment against antibiotic-resistant[J]. J Antimicrob Chemother, 2020, 75(7): 1787–1798.

[22] TUCK B, WATKIN E, SOMERS A, et al. A critical review of marine biofilms on metallic materials[J]. NPJ Materials Degradation, 2022, 6(25): 1–12.

Effect of N-acetylcysteine combined with cefoxitin onin vitro drug susceptibility tests

WU Tong, GU Haiying

1.Health Science Center, Ningbo University, Ningbo 315211, Zhejiang, China; 2.Laboratory of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Medical School of Ningbo University, Ningbo 315020, Zhejiang, China

To conduct a combination susceptibility test of cefoxitin (FOX) with N-acetylcysteine (NAC) or NAC adjusted to neutral pH on() ATCC29213 and ATCC43300, aiming to evaluate the drugs effect and the acidic properties of NAC on.Minimal inhibitory concentration (MIC) of FOX and NAC were tested by broth microdilution method; Combining drug susceptibility experiment was tested by the checkerboard method. The biofilm biomass quantification was determined by crystal violet staining. Biofilm (BF) composition changes were visualized using confocal laser scanning microscopy. The experiment was performed again by using neutral NAC.MIC of FOX againstATCC29213 and ATCC43300 were 2μg/ml and 32μg/ml. MIC of NAC was 4mg/ml for both strains, while the MIC of neutral NAC was greater than 64mg/ml. Both strains show an additive effect between NAC and FOX when the pH was low, where the content of BF, the number of bacteria, and the polysaccharide component of BF decreased. However, the drug’s effects were shown as irrelevant or antagonistic when the pH was adjusted to neutral.NAC is able to increase the sensitivity ofto FOX and significantly destroys BF formation, and the acidity of NAC might be the key to its effects.

; Biofilm; N-acetylcysteine; Antibiofilm

R37

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.022

谷海瀛，電子信箱：guhaiying@nbu.edu.cn

（2023–04–27）

（2023–08–22）