基于包埋法固定化漆酶的酶學性質及其催化氧化海水養殖廢水中四環素的效能與途徑?

張思敏, 金春姬,2??, 吳香梅, 趙陽國,2, 佘宗蓮,2

(1. 中國海洋大學環境科學與工程學院, 山東 青島 266100;2. 中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室, 山東 青島 266100)

抗生素因其成本低、使用便捷和療效顯著等優點,在預防和治療水產細菌性傳染病方面發揮著重要作用[1]。抗生素作為食物顆粒中的添加劑投入到養殖環境中,只有25%～75%可以被動物腸道所吸收,其余則通過糞便和尿液以母體化合物或代謝物的形式排泄,會對生態系統和人類健康造成不利影響。其中,四環素類抗生素因其低生產價格、高質量和高純度,在水產養殖業和畜牧業被廣泛使用,是世界上第二常用的抗生素[2]。在海水養殖區水域四環素類抗生素被頻繁檢出。Han等[3]對黃海沿岸海水養殖區中抗生素分布情況進行調查,一共檢出15種抗生素,其中土霉素和多西環素的檢出率較高(>60%),土霉素最高達到了42.63 ng·L-1。不同海水養殖區的四環素濃度差異很大,Na等[4]發現四環素是中國大連海水養殖場中的主要抗生素(范圍:2.11～9.23 ng·L-1);而Chen等[5]在調查海陵島海水養殖區抗生素分布情況時發現在蝦幼體池塘氧四環素(Oxytetracycline,OTC)和TC的最高濃度分別是15 163和2 305 ng·L-1,這兩種抗生素被廣泛用于對蝦養殖場,以預防細菌性疾病。四環素類抗生素在自然環境中難以被生物降解,且降解的中間產物可能具有更大的生物毒性,盡管目前在海水養殖廢水中檢測到的四環素濃度低,但低濃度的四環素已經具有抑菌作用,導致抗生素抗性基因的出現。因此,迫切需要研究一種從海水養殖廢水中去除四環素的有效方法。

通常,四環素的處理技術主要包括吸附[6]、膜分離[7]、高級氧化[8]和微生物降解[9]。物理法操作簡單,但其僅對抗生素進行了相的轉移,治標不治本;高級氧化技術雖然能高效降解環境中的抗生素,但存在能耗和處理成本高等問題,難以應用于實際工程。生物處理技術則相對成熟,是目前處理抗生素的主體工藝,但存在抗生素抗性基因過量表達的風險,而酶降解技術因其反應溫和,氧化污染物能力強受到了廣泛關注,它既擁有生物處理技術的優點,也不必擔心抗生素抗性基因的出現。漆酶(EC 1.10.3.2)是一種具有高催化活性和高特異性的含銅多酚氧化酶[10],具有良好的底物專一性及穩定性,可以催化酚類、芳胺類、羧酸及其他富含電子底物的單電子氧化,且產生無毒害物質,被廣泛應用于農藥降解[11]、印染脫色[12]、石油烴去除[13]、環境修復[14]等領域。然而,漆酶的構象結構容易受環境條件的變化而扭曲,損害其酶活性[15],再加上游離漆酶無法回收利用,其低穩定性和高生產成本限制了它的實際應用。

酶固定化是解決這一問題的有效手段,酶固定化是指通過物理或化學手段,將游離酶負載到載體材料上形成具有催化活性并能連續反應和使用的酶制劑[16]。因此本研究選擇海藻酸鈉、聚乙烯醇、明膠結合形成復合載體,使用活性炭吸附漆酶,采用吸附+包埋的方式制備固定化漆酶,研究固定化酶和游離漆酶的酶學性質,氧化還原介體、鹽度和pH對固定化酶去除四環素的影響,使用超高效液相色譜質譜聯用儀分析四環素可能的降解機理,為固定化漆酶廣泛用于污染物去除、環境修復等領域提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

漆酶(EC 1.10.3.2)為市售商品漆酶,購自上海丹尼悅生物科技有限公司;2,2’-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS,≥99%);鹽酸四環素(TC),生物技術級;丁香醛(SA);1-羥基苯并三唑(HBT),分析純;甲酸,色譜純均購自上海麥克林生物科技有限公司;乙腈,色譜純(≥99%),購自德國默克公司;其余試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

L5紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司);HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州丹瑞實驗儀器設備有限公司);CHA-SA數顯氣浴恒溫振蕩器(常州普天儀器制造有限公司);AB SciEX OTrap 4500 HPLC-MS/MS聯用系統,配備Thermo Ultimate 3000型液相系統,電噴霧離子源(ESI)(美國AB公司);C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)(美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 固定化漆酶的制備

首先按照適當比例稱取海藻酸鈉、聚乙烯醇、明膠,加入去離子水,于水浴鍋內80 ℃加熱溶化,冷卻至室溫備用;配制10 g·L-1漆酶溶液,加入0.5 g(5 g·L-1)活性炭進行吸附;然后將酶液與包埋液混勻,將混合液用注射器勻速滴入4%CaCl2飽和硼酸溶液中進行交聯,形成水凝膠球。將形成的水凝膠球放置在交聯劑中4 ℃固定4 h后取出,蒸餾水反復沖洗數次后放入Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH=5,0.1 mol·L-1)中,4 ℃備用。形成的水凝膠球直徑約2 mm。

1.4 實驗用水

本實驗用水為模擬海水養殖廢水,葡萄糖、NH4Cl和KH2PO4分別為50、80和9 mg·L-1,調節pH為7.0～8.3,鹽度為30。加入鹽酸四環素作為目標污染物。實驗時取適量四環素儲備液(100 mg·L-1)于該模擬海水養殖廢水中,稀釋至所需濃度,具體水質指標如表1。

表1 實驗用水的水質指標Table 1 Water quality index of experimental water

1.5 分析檢測方法

1.5.1 酶活性的測定 使用ABTS為底物測試漆酶活性[17]。3 mL反應混合物由檸檬酸緩沖液(pH=5,0.1 mol·L-1)、1 mmol·L-1ABTS和游離漆酶或固定化漆酶樣品組成,在420 nm處測定5 min內的吸光度變化。一個酶活力單位定義為每分鐘使OD值增加1.0所需要的酶量[18]。同組實驗測定的最高酶活性記為100%,相對酶活性定義為其余酶活性與最高酶活性的百分比。

1.5.2 四環素的測定 使用高效液相色譜與三重四級桿質譜聯用技術(HPLC-MS/MS)測定四環素的濃度。色譜柱采用Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),流動相A為0.3%甲酸水,流動相B為乙腈,水/乙腈(v/v)比為30∶70,流速0.25 mL·min-1,電噴霧離子源(ESI)以正模式運行,離子化電壓5 500 V,離子源溫度450 ℃,進樣量1 μL,氣簾氣40 psi,柱溫30 ℃,去簇電壓90 V。由于水樣中含有無機鹽雜質,采用固相萃取對水樣中鹽酸四環素預處理后測定。

1.5.3 降解產物的測定 水樣前處理方式同鹽酸四環素測定的前處理方式一致。色譜檢測條件為:色譜儀為安捷倫1290UPLC,色譜柱采用waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇,梯度洗脫,進樣流速0.3 mL·min-1,進樣量為2 μL;質譜儀為安捷倫Q-TOF6500,電噴霧電離模式(ESI)模式在50～1 000 m/z范圍內分析正離子,霧化氣溫度為350 ℃,霧化氣氣流12 L·min-1,噴霧電壓+3 200 V。

2 結果與討論

2.1 游離漆酶與固定化漆酶酶學性質研究

2.1.1 pH對漆酶活性的影響 漆酶的活性與活性電位氨基酸的電離狀態密切相關,而反應體系酸堿度能顯著影響其電離狀態[19]。因此,在25 ℃下,評估pH在3～8.5的范圍內游離和固定化漆酶酶活性的影響,實驗重復三次,結果如圖1所示。游離漆酶和固定化漆酶活性均隨著pH的升高呈現出先升高后降低的趨勢。對于游離漆酶,最佳pH為6,隨著pH的變化,活性損失變化較大,pH<4.5或pH>7.5均不利于漆酶活性,在pH為3時,相對活性僅為66.29%,pH為8.5時,相對活性僅為69.32%。對于固定化酶,最佳pH為6.5,在較寬的pH范圍內保持著較高的相對酶活性,活性穩定在80%以上,即固定化漆酶的pH穩定性明顯優于游離漆酶。

圖1 pH對游離和固定化漆酶酶活性的影響

有研究認為,反應體系pH的變化會改變漆酶分子的帶電狀態,不同的pH值會導致不同的微環境。等離子點會影響漆酶和載體的凈電荷,從而阻礙或激活漆酶活性[20-21],對催化反應造成影響。當體系中pH改變時,制備的水凝膠球具有pH緩沖功能,有效地緩沖了溶液中H+和OH-的變化,使固定化酶微環境的變化小于體系中的變化;同時,酶分子結構不易受到體系環境變化的沖擊,使得酶對pH的敏感性降低,從而提高了固定化漆酶對pH變化的穩定性。漆酶的最佳反應pH從6變到了6.5,這種變化在其他文獻中也有報道,如Wen等[17]在使用膨潤土衍生的介孔材料固定化漆酶時發現,游離酶的最佳pH為4,而固定化酶的最佳pH為5;Shao等[22]將漆酶固定在中空介孔碳納米球上時發現,游離酶的最佳pH為5.5,固定化酶的最佳pH為4.5。最佳pH的改變可能歸因于漆酶周圍微環境影響的相互作用,本研究使用海藻酸鈉和聚乙烯醇作為主體包埋材料,形成的水凝膠球富含羥基,使得固定化載體附近微環境的H+濃度偏高,溶液中pH必須向堿性偏移,從而使固定化酶在pH=6.5表現出最大酶活性[23]。

2.1.2 溫度對漆酶活性的影響 酶通常對溫度敏感,在高溫條件下活性會降低,通過將酶固定在合適的載體上,能夠改善酶活性的降低程度。本研究稱取等量固定化酶和游離漆酶(0.75 g·L-1)至50 mL蒸餾水中,恒溫振蕩1 h,在25～60 ℃范圍內探究了溫度對酶活性的影響,實驗重復三次。如圖2所示,游離漆酶的最佳反應溫度為25 ℃,此后,溫度升高酶活性下降,反應溫度為60 ℃時相對酶活性僅為41.79%。在25～35 ℃條件下,固定化漆酶的酶活性隨著溫度的增加而增加,35 ℃達到最大值,為29.30 U·g-1,溫度的升高有助于酶與底物的結合進程,從而加快反應速率。隨著溫度的進一步升高,酶活性降低,60 ℃時,固定化酶相對酶活性為66.81%,比相同溫度下游離漆酶相對酶活性高25.02%。高溫下相對酶活性的降低與酶結構的熱變性導致的部分酶失活有關[24],但固定化后形成的凝膠結構對酶蛋白分子的空間結構具有保護作用,增加了漆酶的剛度,使其不受構象變化的影響[25],酶蛋白分子的催化活性中心得到保護,使固定化漆酶耐熱性有所提高。

圖2 溫度對游離和固定化漆酶酶活性的影響

2.1.3 熱穩定性 稱取等量固定化酶和游離漆酶(0.75 g·L-1)至50 mL Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中,60 ℃、150 r/min恒溫振蕩3 h,每隔30 min取樣測定酶活性來評估漆酶的熱穩定性,實驗重復三次。相對酶活性定義為t時刻的活性與零時刻活性相比的百分數,使用一級動力學模型模擬酶的失活動力學,計算酶失活常數(Kd)和半衰期(t1/2)。結果如圖3所示。

圖3 游離和固定化漆酶的熱穩定性

由圖3可知,游離酶和固定化酶在60 ℃培養3 h后,與游離漆酶相比,固定化酶顯示出了優異的熱穩定性。游離酶僅保留了其初始催化活性的16.53%,這是由于高溫下漆酶的3D結構發生了變化[26];而固定化酶酶活性的下降趨勢相對緩和,60 ℃培養3 h后保留了其初始催化活性的76.31%,相對酶活性是游離漆酶的4.6倍。固定化酶熱穩定性的提高反映在其失活常數Kd和酶半衰期t1/2的值上,游離漆酶的Kd值和t1/2為0.010 2 min-1和67.96 min,而包埋的固定化酶的Kd值和t1/2為0.001 4 min-1和495.11 min。這是由于漆酶和水凝膠球載體之間形成了共價鍵或氫鍵降低了漆酶分子的運動活性,分子構象變化自由度降低,對酶蛋白分子起到保護作用。

2.1.4 儲存穩定性 酶的儲存穩定性對其應用于實際而言至關重要。圖4顯示了游離和固定化漆酶在4 ℃下儲存30 d的儲存穩定性。游離酶和固定化酶的相對活性均隨儲存時間的延長而下降,但游離漆酶活性損失更加明顯。游離酶在第5天就已經保留不到50%的活性,第30天僅保留24.84%的活性。固定化漆酶的相對活性下降非常緩慢,前20天保留90%以上的初始活性,此后由于水凝膠球外側的CaCl2溶解導致漆酶泄露,相對活性下降比較明顯,但在第30天也保持了一半以上的相對活性。結果表明,經過包埋+吸附固定的漆酶儲存穩定性大幅提升,酶與載體之間的相互作用使得酶蛋白分子的結構剛性增強[27],同時載體材料也為漆酶提供了微環境的保護。

圖4 游離和固定化漆酶的儲存穩定性

2.2 操作因素對固定化漆酶對海水養殖廢水中四環素的影響研究

2.2.1 氧化還原介體類型及濃度對四環素去除率的影響 有研究認為,漆酶的氧化還原電勢較低(300～800 V),并且漆酶的銅活性中心深埋于分子內部,阻礙了底物分子將電子傳遞給漆酶,氧化能力有限[28],而一些低分子量的介體(如SA、HBT)添加到漆酶氧化系統中可以提高漆酶的氧化能力,增強物質的降解。因此,本實驗在漆酶濃度1.5 g·L-1、鹽度30、不調節體系pH的條件下,研究了兩種氧化還原介體(SA、HBT)和不同濃度的介體(0、0.5、1、2和3 mmol·L-1)對漆酶降解四環素(1 mg·L-1)的影響。結果如圖5所示。

圖5 氧化還原介體對四環素去除效果的影響

固定化空白載體對四環素具有明顯的吸附作用,反應2 h,TC濃度降至729.26 μg·L-1,去除率達27.07%,是一個比較快速地吸附過程。隨后,TC濃度緩慢降低,反應12 h后,TC濃度為534.88 μg·L-1,固定化空白載體吸附了約46%的TC,空白載體對TC的吸附趨于飽和。不添加任何介體的固定化酶12 h后去除了體系中67.78%的四環素,當介體加入到反應體系后,隨著介體濃度的增加,四環素的去除效率明顯增加。在SA存在的情況下,SA濃度為0.5、1、2和3 mmol·L-1時,固定化酶對四環素的去除率分別為79.80%、84.78%、88.99%、91.69%;在存在介體HBT的情況下,HBT濃度為0.5、1、2和3 mmol·L-1時,固定化酶對四環素的去除率分別為74.51%、76.99%、80.86%和85.43%。

由此可以看出,氧化還原介體類型和濃度顯著影響漆酶介導反應中四環素的氧化速率。與SA相比,HBT對四環素去除的刺激較小,漆酶-SA系統在去除四環素方面的性能明顯優于漆酶-HBT系統,表明SA在加速四環素催化氧化有著更加顯著的促進作用。這與Shao等[22]、Ding等[29]的研究結果一致。SA和HBT的不同促進作用可能由于其結構、親和力和作用機制的不同導致的。SA是天然介體,在漆酶介導的氧化系統中,SA中的甲氧基降低了苯氧基的氧化還原電位,同時增加了苯氧基的電子密度[30],與HBT相比,SA更容易被漆酶氧化;而HBT是一種合成介體,增強機制歸因于氮羥基的催化作用[31]。

2.2.2 鹽度對四環素去除率的影響 漆酶應用于海水養殖廢水中抗生素去除的實用價值大,而現有的研究集中在漆酶在緩沖體系或純水體系對四環素的降解。因此本實驗探究了在不同鹽度條件下漆酶對海水養殖廢水中四環素的去除效果。本節實驗使用海水晶模擬海水中的鹽類物質,設置鹽度為20、30、40,同時設置空白對照組,加入3 mmol·L-1SA,其余實驗條件同2.2.1。結果如圖6所示。

圖6 鹽度對四環素去除效果的影響

鹽度增加,海水養殖廢水中的四環素降解率呈下降趨勢。鹽度為0時,四環素的降解率為95.55%,隨著鹽度增加為20、30和40時,四環素降解率分別為91.43%、89.41%、80.79%,這可能是由于漆酶是含銅多酚氧化酶,模擬的海水養殖廢水中大量Na+的存在會降低漆酶活性[32-33],抑制漆酶對底物的催化氧化,從而影響了四環素的去除。

2.2.3 pH對四環素去除率的影響 反應體系的pH對漆酶的催化氧化性能影響較大,海水養殖廢水的pH一般在7～8.5之間,因此研究了pH為7.0～8.5范圍內漆酶對四環素的去除效果,太高或太低的pH值范圍被認為是不相關的。

如圖7所示,在選定的pH范圍內,隨著pH值的增加,四環素的降解速率逐漸降低。當pH為7時,固定化酶對四環素的降解率達到最大值92.81%,反應速率常數分別為0.205 6 h-1。當pH為8.5時,固定化酶對四環素的去除率為85.31%。經固定化后載體材料可能提供了適合于固定化漆酶的表面電荷分布,并在酶活性電位周圍產生了抵抗pH值變化的微環境,因此pH對固定化酶去除四環素的效果影響較小,僅降低了7.5%。漆酶去除海水養殖廢水中四環素的最佳pH為7,這一結果與Tian等[34]的研究結果一致,其在使用漆酶降解TC和OTC溶液時,觀察到TCs被漆酶-SA或漆酶-HBT體系轉化時,最適pH為6.0～7.0左右;Kelber等[35]在使用漆酶降解阿霉素時發現隨著體系pH的增加,降解率逐漸增加,直至在pH=7時達到最大值。

圖7 pH對四環素去除效果的影響

四環素在弱堿性條件下降解率的下降可能是由于溶液中存在OH-,這些離子的存在會影響漆酶的結構和性質。由于OH-在Ⅱ型/Ⅲ型銅中的附著,OH-(堿性酸堿度)的存在抑制了漆酶中從Ⅰ型銅到Ⅱ/Ⅲ型銅的內部電子轉移。漆酶的降解也取決于底物和T1銅中心之間的氧化還原電位差,當酸堿度增加時,氧化還原電位降低[36]。

2.3 固定化漆酶對四環素的降解途徑分析

使用超高效液相色譜-質譜聯用技術(UPLC-MS/MS)檢測漆酶降解四環素的中間產物,并將其命名為TP618、TP461、TP459、TP444、TP443、TP431。從LC-MS結果中獲得的四環素的主要降解產物見表2,根據這些降解產物結合文獻分析,提出了四環素的可能的降解途徑,如圖8所示。

表2 TC降解產物的準確質量和建議的分子結構Table 2 Accurate mass measurements and proposed molecular structures of TC degradation products

漆酶催化氧化四環素的過程中,氧化、脫氫、脫甲基、脫氨基是主要反應。降解途徑主要有兩種:(1)TC通過脫氫反應降解為TP443,隨后進行雙脫甲基反應,連接到氮上的甲基官能團從碳骨架上斷裂轉化為TP415[40];(2)TC在3號位碳原子氧化形成的相應的酮(m/z=461),一方面通過脫氨基作用形成TP444;另一方面脫氫后形成TP459,然后氨基在1號位被雙脫甲基形成TP431[22]。有研究認為,土霉素TP461和TP459是形成TP431的必要中間體[10]。雖然本研究未發現由Sun等[38]提出的m/z=396的化合物,但許多研究認為TP396是四環素降解的直接產物,TP396是通過TP431位置12的脫氫,1號位氧化和5號位的脫水形成的。最后,對于TP618這個產物,在過往的研究中,僅Llorca等[37]在檢測漆酶降解四環素中間產物時有發現,但對R基團的結構性質仍不清楚。

3 結論

(1)考察固定化漆酶的酶學性質發現,漆酶固定化后,受到載體的保護,其三維結構更加穩定,限制了酶的泄露,確保了高催化活性的保留,固定化后的漆酶的熱穩定性、儲存穩定性有顯著提高。

(2)固定化漆酶對四環素的去除是吸附和催化氧化共同作用的結果。氧化還原介體類型及濃度顯著影響固定化漆酶對四環素的去除,漆酶-SA系統在去除四環素方面的性能優于漆酶-HBT系統,在3 mmol·L-1SA存在的條件下,固定化漆酶和對四環素的去除率是91.69%。鹽度增加,固定化漆酶對四環素的降解率降低,但保持了80%以上的降解率,能滿足修復的需要。固定化漆酶去除海水養殖廢水中四環素的最佳pH為7.0。

(3)對四環素酶促轉化降解產物的分析表明,氧化、脫氫、脫甲基和脫氨基是導致四環素分子轉化的主要過程。