鹽脅迫下叢枝菌根真菌和生物炭調(diào)節(jié)黑麥草碳氮代謝的路徑?

趙新月, 孫 萍, 陳友媛,2,3??, 劉佳鑫, 王秀海,2,3??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266100; 2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266100; 3. 中國(guó)海洋大學(xué)山東省海洋環(huán)境地質(zhì)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266100)

土壤鹽漬化是制約全球土地利用效率提高和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素[1]。中國(guó)濱海重度鹽漬土區(qū)域的鹽度高達(dá)7以上[2],且土壤養(yǎng)分匱乏[3]。高鹽嚴(yán)重阻礙了植物生長(zhǎng),導(dǎo)致植物種類稀少,景觀蕭條,破壞當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境[4]。因此,探索有效方法提升植物的碳氮代謝活性對(duì)提高植物在重鹽堿地的生存能力至關(guān)重要。

生物炭和叢枝菌根真菌(AMF)已被證明對(duì)鹽漬土有較好的改良效果[5-6]。生物炭能夠通過(guò)影響碳氮相關(guān)酶活性調(diào)節(jié)土壤的碳礦化和氮轉(zhuǎn)化[7]。有研究認(rèn)為,生物炭提高了土壤蔗糖酶活性,促進(jìn)土壤有機(jī)碳礦化[8];它還提高了土壤蛋白酶等氮循環(huán)酶活性,增加養(yǎng)分可用性[9]。因此,生物炭添加有望提高鹽脅迫下的植物生長(zhǎng)水平,而促生機(jī)制與植物的碳氮代謝過(guò)程密切相關(guān)。

在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,植物吸收無(wú)機(jī)氮(如銨鹽、硝酸鹽)和有機(jī)氮(如氨基酸)[10],投入充足的氮進(jìn)行光合作用,將CO2同化為碳水化合物;同時(shí),在無(wú)機(jī)氮同化過(guò)程中,需要大量的碳充當(dāng)反應(yīng)受體[11]。而鹽脅迫嚴(yán)重限制了上述過(guò)程中植物對(duì)碳水化合物的積累[12],影響無(wú)機(jī)氮同化和有機(jī)氮合成[13],威脅生命活動(dòng)。AMF作為一種廣泛存在的共生真菌,其對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要源于對(duì)植物碳氮代謝的調(diào)控,可將植物固定的碳轉(zhuǎn)移到菌絲體中以調(diào)節(jié)碳分配[14]。Shu等[15]研究了AMF定植對(duì)荔枝幼苗蔗糖代謝的影響,發(fā)現(xiàn)蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶保持了高活性。但是,AMF和生物炭聯(lián)合作用對(duì)鹽脅迫植物碳氮代謝的影響還未知,而且二者調(diào)節(jié)植物碳氮代謝關(guān)鍵酶活性和代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的路徑尚未得到量化。偏最小二乘路徑分析(PLS-PM)可定量解釋多個(gè)指標(biāo)和影響路徑之間的因果關(guān)系[16],在闡明環(huán)境領(lǐng)域污染物轉(zhuǎn)化路徑、多環(huán)境因子影響程度等方面具有巨大潛力[17],但目前應(yīng)用較少。

本研究通過(guò)水培實(shí)驗(yàn),探究鹽脅迫下植物碳氮代謝關(guān)鍵酶及中間產(chǎn)物變化,分析并量化AMF和生物炭對(duì)植物碳氮代謝的影響效果與路徑,主要達(dá)到以下3個(gè)目的:(1)明確不同鹽脅迫條件下AMF和生物炭對(duì)植物的促生作用;(2)明確AMF和生物炭對(duì)植物碳氮代謝產(chǎn)物、碳氮代謝關(guān)鍵酶的影響;(3)通過(guò)聚類分析和PLS-PM模型,闡明AMF和生物炭調(diào)控植物碳氮代謝的作用路徑。研究結(jié)果將為濱海鹽堿地區(qū)植物景觀恢復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

生物炭原材料為滸苔(Enteromorphaprolifera),購(gòu)買自中國(guó)海洋大學(xué)生物科技有限公司。將滸苔置于氣氛爐中,以5 ℃·min-1的升溫速率升溫至400 ℃并停留2 h,得到滸苔生物炭,其基本特性如表1所示。AMF菌劑購(gòu)買自捷克諾曼環(huán)境技術(shù)股份有限公司。多年生黑麥草,種子購(gòu)買于宿遷春滿園種業(yè)有限公司。

表1 滸苔生物炭的理化特性Table 1 Physicochemical properties of Enteromorpha prolifera biochar

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將黑麥草種子用6%的H2O2滅菌,并在室溫下預(yù)發(fā)芽48 h,在每個(gè)花盆(10 cm×10 cm×12 cm)中加入80 g滅菌蛭石。設(shè)置不同鹽度和添加物的12個(gè)處理組,各處理組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。最后將50粒預(yù)發(fā)芽后的種子均勻撒在蛭石表面,再用10 g滅菌蛭石均勻蓋住種子,用去離子水澆透基質(zhì)。將盆栽放置在光照培養(yǎng)箱中,保持30 ℃,24 h·d-1光照,待種子萌發(fā)率達(dá)到約50%后將培養(yǎng)條件改為30 ℃,16 h·d-1光照。在實(shí)驗(yàn)第7天對(duì)植物進(jìn)行間苗,使每個(gè)花盆中留下長(zhǎng)勢(shì)相近的20株植物。為防止植物出現(xiàn)“鹽休克”,每天增加4個(gè)單位鹽度,直至達(dá)到鹽度設(shè)計(jì)水平后,保持設(shè)定的0、10和20的鹽度(在本文中鹽度用NaCl濃度表示)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每天澆灌1/2強(qiáng)度含NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液20 mL。生長(zhǎng)20 d后收獲所有植物,測(cè)定植物指標(biāo)。對(duì)于每個(gè)測(cè)試指標(biāo),隨機(jī)從每個(gè)處理組設(shè)置的5盆重復(fù)樣中取3株植物。

表2 處理組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design of the treatment groups

1.3 分析測(cè)定方法

1.3.1 菌根定植觀察 使用生物顯微鏡(BM 2000),觀察未接種與接種AMF情況下,植物根部的顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.2 植物生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 收獲植物前,用直尺測(cè)量植物自然狀態(tài)下植株最高點(diǎn)到土壤的距離,即為植物株高。將植物根收獲后小心地沖洗干凈,用直尺測(cè)量植物根長(zhǎng)。每盆隨機(jī)收獲3株植物幼苗,沖洗并拭干后測(cè)量稱重,取平均值作為植物鮮重(FW)。然后,將植物在60 ℃的烘箱中干燥72 h,以獲得恒定的重量,記錄植物干重(DW)。植物總重量(TW)為黑暗條件下將葉片浸入蒸餾水中24 h,使得葉片吸水成飽和狀態(tài)時(shí)的重量。葉片相對(duì)含水率(RWC)的測(cè)量方法如下[18]:

(1)

1.3.3 植物生理生化指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 植物光合色素含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.2 g新鮮葉片樣品,浸泡在20 mL 80%丙酮溶液(作為浸提試劑)中,黑暗提取72 h以上,分別在663、646和470 nm下比色,以測(cè)定植物葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量[19]。

1.3.3.2 植物碳氮代謝產(chǎn)物測(cè)定 碳代謝產(chǎn)物測(cè)定:可溶性糖和淀粉含量測(cè)定采用硫酸-蒽酮比色法[20]。

氮代謝產(chǎn)物測(cè)定:氨基酸含量測(cè)定采用茚三酮法,可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[21]。

1.3.3.3 植物碳氮代謝酶活性測(cè)定 蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)試劑盒購(gòu)買自南京建成生物工程研究所,根據(jù)說(shuō)明進(jìn)行兩種酶的活性測(cè)定。谷氨酰胺合成酶(GS)活性根據(jù)金等[22]方法進(jìn)行測(cè)定。谷氨酸合成酶(GOGAT)活性測(cè)定根據(jù)Lin等[23]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行不同處理組間的多重比較分析(P<0.05)。使用R語(yǔ)言進(jìn)行聚類分析,采用Smart PLS 3.0軟件進(jìn)行偏最小二乘路徑分析(PLS-PM)[24]。其他統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下AMF-黑麥草菌根定植情況

未接種和接種AMF處理組的植物根部生物顯微鏡照片見(jiàn)圖1。從圖中可以看出,不接種AMF的情況下,植物細(xì)胞呈規(guī)則排列的長(zhǎng)橢圓形。AMF接種后成功侵染植物根部,并對(duì)根細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,在根細(xì)胞和根外可見(jiàn)AMF的菌絲和泡囊等結(jié)構(gòu)。

圖1 未接種AMF植物根部(a)和接種AMF植物根部(b)的顯微照片

2.2 鹽脅迫下AMF和生物炭對(duì)黑麥草生長(zhǎng)情況的改善作用

隨著NaCl濃度升高,植物的株高、根長(zhǎng)、鮮重和相對(duì)含水率明顯降低(見(jiàn)圖2)。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到20時(shí),植物生長(zhǎng)受到顯著抑制。NaCl濃度為0和10時(shí),AMF和生物炭聯(lián)合處理顯著促進(jìn)了植物生長(zhǎng)和生物量積累(P<0.05),促生效果表現(xiàn)為BA>AMF>BC>CK。在NaCl濃度為10時(shí),AMF接種和生物炭添加使得植物株高提高了31.8%和19.6%,根長(zhǎng)提高了48.0%和38.7%,鮮重提高了59.9%和21.6%,相對(duì)含水率提高了2.9%和1.1%。

圖2 不同鹽度下AMF和生物炭對(duì)黑麥草株高(a)、根長(zhǎng)(b)、鮮重(c)和相對(duì)含水率(d)的影響

2.3 鹽脅迫下AMF和生物炭對(duì)黑麥草光合作用的促進(jìn)作用

隨著NaCl濃度升高,植物葉綠素a和類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),而葉綠素b變化不顯著(見(jiàn)圖3)。在不同的鹽脅迫條件下,AMF和生物炭均表現(xiàn)出良好的促進(jìn)植物光合作用的效果,且聯(lián)合處理的效果最佳。當(dāng)NaCl濃度為10時(shí),與CK組相比,BC、AMF和BA組的葉綠素a含量分別增加了25.2%、41.8%和47.8%,類胡蘿卜素含量分別提高了2.2%、28.8%和10.3%。而僅在NaCl濃度為0時(shí),AMF接種顯著提高了葉綠素b的含量(P<0.05)。

圖3 不同鹽度下AMF和生物炭對(duì)黑麥草葉綠素a含量(a)、葉綠素b含量(b)和類胡蘿卜素含量(c)的影響

2.4 鹽脅迫下AMF和生物炭對(duì)黑麥草碳代謝關(guān)鍵酶和碳代謝產(chǎn)物的影響

鹽脅迫顯著降低了植物可溶性糖和淀粉含量,以及蔗糖合成酶活性,但對(duì)蔗糖磷酸合成酶的活性影響沒(méi)有明顯規(guī)律(見(jiàn)圖4)。對(duì)于植物碳代謝關(guān)鍵酶和碳代謝產(chǎn)物的作用強(qiáng)度,整體表現(xiàn)為BA>BC>AMF>CK。NaCl濃度為10‰時(shí),AMF、生物炭處理分別增加了蔗糖合成酶(37.3%、48.3%)和蔗糖磷酸合成酶的活性(33.9%、44.4%),二者聯(lián)合應(yīng)用使得兩種酶活性分別增加了53.4%、66.1%。此外,可溶性糖和淀粉積累增加,與CK相比,AMF接種和生物炭添加使可溶性糖含量分別提高了36.9%和22.1%,淀粉含量分別提高了28.1%和23.2%。

2.5 鹽脅迫下AMF和生物炭對(duì)黑麥草氮代謝關(guān)鍵酶和氮代謝產(chǎn)物的影響

隨著NaCl濃度升高,植物的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶活性大大降低,氨基酸和可溶性蛋白的含量顯著下降(見(jiàn)圖5)。AMF和生物炭的加入均提高了氮代謝關(guān)鍵酶活性和氮代謝產(chǎn)物含量。當(dāng)NaCl濃度為10時(shí),BC和BA組的谷氨酰胺合成酶活性分別提高了36.9%和21.4%;谷氨酸合成酶的活性分別提高了31.2%和46.9%,氨基酸含量分別提高了8.2%和37.7%,可溶性蛋白含量分別提高了59.8%和110.3%。

3 討論

AMF和生物炭在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用效果,且AMF的促生效果更佳。當(dāng)NaCl濃度為0和10時(shí),AMF侵染植物根后形成的根-菌絲網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)大了根系的吸收面積,加速宿主植物的根組織吸收水分和養(yǎng)分[25]。此外,AMF和生物炭均可增加植物的葉綠素和類胡蘿卜素含量,這與Yang等[26]的結(jié)果一致。菌根共生可能增加了植物葉片中的氮含量,增強(qiáng)了葉綠素a還原酶等的基因表達(dá)[27],從而增強(qiáng)植物的光合作用。AMF和生物炭發(fā)揮協(xié)同作用的原因可能是,生物炭的孔隙豐富、比表面積大,可為AMF生長(zhǎng)提供合適的棲息地,保護(hù)AMF菌絲免受傷害[28]。Hammer等[29]研究證實(shí),AMF和生物炭存在協(xié)同效應(yīng),能有效緩解鹽分引起的植物(萵苣)的生長(zhǎng)抑制。

采用聚類分析,探究3種不同鹽度條件下,AMF和生物炭作用后黑麥草生長(zhǎng)、生理指標(biāo)之間的相關(guān)性(見(jiàn)圖6)。在10 NaCl條件下,與對(duì)照組相比,生物炭的加入主要調(diào)節(jié)植物的碳氮代謝,提高蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性和淀粉含量,上調(diào)谷氨酰胺合成酶的表達(dá);AMF接種調(diào)控了碳代謝過(guò)程,促進(jìn)光合色素和淀粉的積累,提高蔗糖磷酸合成酶活性,這與前人的研究一致[30]。

(藍(lán)色和紅色分別表示正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系。“CK-0”、“CK-10”、“CK-20”、“BC-0”、“BC-10”、“BC-20”、“AMF-0”、“AMF-10”、“AMF-20”、“BA-0”、“BA-10”、“BA-20”表示不同的鹽分濃度和處理組。各測(cè)試指標(biāo)的單位同上。有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋,請(qǐng)參考本文的web版本。Blue and rad represent positive and negative relationships, respectively. The markers “CK-0”、“CK-10”、“CK-20”、“BC-0”、“BC-10”、“BC-20”、“AMF-0”、“AMF-10”、“AMF-20”、“BA-0”、“BA-10”、“BA-20” indicate different salt conditions and treatments. Units for each test indicator are as above. For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

(*的數(shù)量表示該模型中路徑的顯著性水平(***P<0.01,**P<0.05, *P<0.10)。各測(cè)試指標(biāo)的單位同上。有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋,請(qǐng)參考本文的web版本。)The number of asterisks indicates the significance level (***P<0.01, **P<0.05,*P<0.10). Units for each test indicator are as above. For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

4 結(jié)語(yǔ)

在0、10和20的NaCl濃度處理的水培條件下,AMF和生物炭均顯著促進(jìn)了黑麥草的生長(zhǎng)和生物量積累,極大減輕高鹽脅迫造成的損傷,提高植物耐鹽能力。AMF和生物炭在調(diào)節(jié)植物碳氮代謝方面存在差異,具體來(lái)說(shuō),生物炭在調(diào)節(jié)植物碳氮代謝方面的作用更強(qiáng),增加碳氮代謝關(guān)鍵酶的活性,促進(jìn)可溶性糖、淀粉等碳代謝產(chǎn)物,以及氮代謝產(chǎn)物氨基酸和可溶性蛋白的積累;AMF對(duì)于調(diào)控植物的碳代謝具有一定的積極作用,通過(guò)上調(diào)關(guān)鍵酶活性來(lái)增加植物的碳代謝產(chǎn)物。當(dāng)AMF和生物炭聯(lián)合作用時(shí),表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用,促進(jìn)植物生長(zhǎng)、光合作用和碳氮代謝活性,具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。