脂肪酶微膠囊制備工藝及性質研究

楊寶嘉，孫晗，蔣士龍，解慶剛，呂加平，宋博，劉妍妍

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163000；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；3.黑龍江飛鶴乳業有限公司，北京 100015）

0 引 言

酶的代謝與人體的健康緊密相關，體內活細胞在適宜的條件下能夠催化人體內的各種生物化學反應，促進新陳代謝[1]。脂肪酶（Lipase）又稱三酰基甘油酰基水解酶，在自然界中來源廣泛，動物、植物及微生物均具有生產脂肪酶的能力[2]，其中人體中的脂肪酶多存在于消化道及胰腺等器官中。但配方奶粉喂養的嬰兒、患厭食癥的兒童、有功能性消化不良癥狀的老年人[3-5]，以及某些疾病狀態如胰腺炎、克羅恩病、乳糜瀉和囊腫性纖維化等, 都會因為脂肪酶分泌不足導致消化功能減弱，從而造成營養不良。因此額外補充脂肪酶十分重要，但脂肪的消化吸收主要是在腸道中進行，為了保證消化過程中脂肪酶能夠耐受胃部酸性環境，完整到達其作用位點腸道，本研究采用微膠囊技術對脂肪酶進行包埋，提高其在消化系統中的穩定性。

微膠囊技術（Microencapsulation）是指使用某種技術手段如物理，化學，生物等將芯材包裹在微小的膠囊中，這是一種貯存固體、液體、氣體的微型包裝技術[6-7]。微膠囊技術可以保護敏感成分，掩蓋芯材的不良味道，確保營養成分不流失，并控制芯材的釋放。壁材通常采用天然的或者是人工合成的高分子材料以薄膜的形式覆蓋在芯材的表面。天然壁材因為無毒無害而被廣泛應用，主要包括蛋白質類、碳水化合物類、脂質類。改性壁材是利用某些手段如酶法、物理法等來彌補天然高分子材料的不穩定性、包埋釋放效果不佳等缺點[8]，Zhang 等[9]利用美拉德反應產物制備微膠囊，證明了改性壁材在一定程度上可以彌補壁材本身的缺陷。

本研究選用海藻酸鈉為壁材，海藻酸鈉是從海藻中提取出的一種共聚物，由α-L-古羅糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸通過α（1→4）線性嵌段形成[10]。當海藻酸鈉遇到鈣離子等二價陽離子時，鈣離子可以取代鈉離子形成海藻酸鈣凝膠，表現出更好的強度和彈性，目前已被廣泛的應用于食品，化工，醫藥等領域[11]。張慧霞等[12]利用海藻酸鈉和微孔淀粉固定酯化酶，選取CaCl2為固定溶液，通過擠壓法對酯化酶進行包埋，優化工藝后包埋率可達到87%以上。Tian 等[13]利用復合凝聚法，采用海藻酸鈉及明膠復合材料為壁材，制備石蠟微膠囊，微膠囊的包封率達到82.12%，且制備的該微膠囊具有較好的熱穩定性和熱性能。目前海藻酸鈉是研究最為廣泛的壁材之一，為本研究的開展提供了理論基礎。

本研究優化了微膠囊的制備工藝，并對該微膠囊的微觀結構、胃耐受性和腸釋放性進行評價，為脂肪酶微膠囊的工業化生產提供理論依據。

1.1 材料與試劑

脂肪酶（20 000 L），諾維信；海藻酸鈉（化學純），上海源葉生物科技有限公司；氯化鈣（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶，北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設備

LGJ-18C 冷凍干燥機，北京四環福瑞科技公司；Model 680 酶標儀，美國Bio-Rad；SU3500 掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪酶微膠囊的制備

稱取海藻酸鈉溶于25 mL 水中，充分溶解后備用。將酶液與壁材溶液按1∶3（V/V）混和均勻，將其用注射器逐滴加入到10 mL 質量分數為3%的CaCl2溶液中固定30 min 后形成微膠囊。經過濾、洗滌除去殘留的CaCl2溶液及微膠囊表面的酶溶液，得到濕潤的微膠囊，置于-20 ℃過夜，經真空冷凍干燥得到干態微膠囊[14]。

1.3.2 微膠囊包埋率的測定

稱取干燥后的微膠囊0.5 g 加入5 mL PBS 溶液，高速剪切3 min 后，于4 ℃5 000 r/min 離心5 min，使包埋在微膠囊中的脂肪酶全部釋放出來[15]。再通過銅皂法測定脂肪酶活性[16]，從而測定出包埋率。包埋率按下式計算：

包埋率=微膠囊產品中的脂肪酶活性/制備微膠囊產品時加入的脂肪酶活性×100%

1.3.3 微膠囊的平均粒徑

參照侯丹等[17]的方法改進，取未凍干的微膠囊30粒，利用游標卡尺測量后取平均值，每種微膠囊重復測定3 次取平均值。

1.3.4 掃描電子顯微鏡（SEM）

采用掃描電子顯微鏡對微膠囊樣品的表觀形態進行觀察。將微膠囊樣品均勻的固定于樣品臺上，噴金90 s 后，置于樣品室進行觀察。

1.3.5 微膠囊在模擬胃液中的耐受性

成人及嬰兒胃液儲備液的配置：2 g 氯化鈉溶于800 mL 去離子水中，分別用0.1 mol/L HCl 調節pH至1 和3 再定容至1 000 mL[18]。

正式消化前，將0.5 g 微膠囊樣品分別加到4.5 mL 的成人及嬰兒胃液儲備液中，加入胃蛋白酶達到2000U/mL，設置搖床溫度為37 ℃，轉速100 r/min，消化時間為1 h，分別在5、10、15、30、60 min 收集微膠囊沉淀，洗滌后測定微膠囊中脂肪酶活性，并以未包埋的脂肪酶為對照。

1.3.6 微膠囊在模擬腸液中的釋放性

腸液儲備液（SIF）的配置：6.8 g 磷酸二氫鉀溶于800 mL 去離子水中，用0.1 mol/L NaOH 調節pH 至7，再定容至1 000 mL。

腸道釋放性測試，取1 g 脂肪酶微膠囊樣品加入到9 mL 腸液儲備液中和1%的胰蛋白酶，二者按照1∶1 的比例混合均勻，設置搖床溫度37 ℃，轉速100 r/min，消化時間為2 h，分別在10、15、30、60、120 min 取消化液，以釋放率（%）為評價指標，根據下式計算：

釋放率=不同消化時間腸消化液中脂肪酶活性/消化前微膠囊樣品中脂肪酶活性×100%

1.4 試驗設計

1.4.1 單因素試驗設計

為了得到最佳的包埋率的工藝，通過對比海藻酸鈉質量分數、酶液與壁材的比例（V/V）、固定時間、CaCl2質量分數4 個因素對脂肪酶包埋率的影響，采用單因素試驗進行實驗設計，如表1 所示。

表1 制備膽鹽激活脂肪酶微膠囊單因素水平

設置CaCl2質量分數為3.0%，固定時間為30 min，酶液與壁材的比例為1∶3（V/V）；設置海藻酸鈉質量分數為2.5%，固定時間30 min，酶液與壁材的比例為1∶3（V/V）；設置海藻酸鈉質量分數為2.5%，CaCl2質量分數為3.0%，酶液與壁材的比例為1∶3（V/V）；設置海藻酸鈉質量分數為2.5%，CaCl2質量分數為3.0%，固定時間為30 min；分別考察海藻酸鈉質量分數，CaCl2質量分數，固定時間以及酶液與壁材的比例對微膠囊包埋率的影響。

1.4.2 正交試驗設計

通過單因素試驗，選取海藻酸鈉質量分數，CaCl2質量分數，固定時間，酶液與壁材的比例（V/V）4 個因素，每個因素設定3 個水平，以包埋率為考察指標，采用L9（34）正交對包埋條件進行優化，如表2 所示。

表2 正交因素水平

1.5 數據處理

采用Statistix 8.1 和SPSS 20.2 軟件進行數據統計分析，差異顯著性分析（P＜0.05）；采用Origin 2019 軟件繪圖。實驗均重復3 次，每個處理組做3 個平行，數據表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 影響脂肪酶微膠囊包埋率的主要因素

2.1.1 海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率及粒徑的影響

由圖1 可知，隨著海藻酸鈉質量分數的增加，微膠囊的外壁變厚，粒徑呈現出增加的趨勢，包埋率呈現先增加后降低的趨勢，當海藻酸鈉濃度為2.5%和3%包埋率最大分別在30%左右，顯著高于其他3 組（P＜0.05），粒徑分別為2.58 mm 和2.84 mm。當海藻酸鈉濃度為3.5%時包埋率顯著下降，該實驗的包埋方法是采用擠壓法，當海藻酸鈉濃度過高時黏度增加擠壓較為困難且形成的微膠囊形態不均勻、不圓潤，也可能成為微膠囊包埋率低的原因[19]。因此，當海藻酸鈉質量分數為2.5%為最佳壁材濃度，最佳區間是2%~3%。

圖1 海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率及平均粒徑的影響

2.1.2 CaCl2質量分數對微膠囊包埋率及粒徑的影響

由圖2 可知，隨著CaCl2質量分數的增加粒徑呈現出增大趨勢，在CaCl2質量分數為2%~4%時增加相對比較緩慢；CaCl2質量分數對微膠囊的包埋率影響在1%~3%之間呈現顯著增加（P＜0.05）當CaCl2質量分數為3%時包埋率最高，包埋率大于30%；CaCl2質量分數從3%~5%呈現顯著下降（P＜0.05），CaCl2質量分數為5%包埋率最低只有18%左右。當CaCl2質量分數過高，粒徑增大，微膠囊的壁材變厚，對微膠囊的包埋效果有消極的影響；當CaCl2質量分數過低時，酶液與壁材沒有及時固定而溶于CaCl2溶液中，所以微膠囊粒徑較小，包埋率較低；隨著CaCl2質量分數的增加，壁材與CaCl2溶液迅速反應，形成海藻酸鈣網絡結構[20-21]，迅速將脂肪酶進行包埋。因此本試驗選取CaCl2質量分數為3%時為最佳濃度，最佳區間是2%~4%。

圖2 CaCl2 質量分數對微膠囊包埋率及平均粒徑的影響

2.1.3 固定時間對微膠囊包埋率及粒徑的影響

固定時間對脂肪酶微膠囊包埋率影響如圖3 所示，隨著固定時間的延長，脂肪酶微膠囊粒徑以及包埋率都呈現先增加后降低的趨勢；當固定時間為40 min時微膠囊的包埋率為36%顯著高于其他4 組（P＜0.05），當固定時間為30 min 時微膠囊粒徑最大為2.5 mm。5組試驗中固定時間為10 min 和50 min 時包埋率最低，海藻酸鈉與CaCl2的反應比較容易，但也需要一定的時間才能完成，10 min 包埋率過低可能是由于固定的不完全，沖洗微膠囊時將未包埋的脂肪酶沖洗掉，固定50 min 包埋率下降，由于隨著固定時間的延長，微膠囊顆粒長時間浸泡在CaCl2溶液中，受到較長時間離子強度的影響[22]，導致脂肪酶活性下降。因此本試驗選取最佳固定時間為40 min，最佳區間是30~40 min。

圖3 固定時間對微膠囊包埋率及平均粒徑的影響

2.1.4 酶液與壁材的比例對微膠囊包埋率及粒徑的影響

由圖4 可以看出酶液與壁材比例在1∶2 時最佳包埋率為37.7%，粒徑為2.49 mm。當壁材比例升高時粒徑顯著增加（P＜0.05），而包埋率呈現顯著下降（P＜0.05）。產生這種現象的主要原因可能是因為，當海藻酸鈉過量時，分子間的作用力增加，溶液黏度也增加，碰撞劇烈對包埋率和粒徑產生了消極的影響[23]。故本試驗選取最佳酶液與壁材比例為1∶2，最佳區間是1∶1~1∶3。

圖4 酶液與壁材的比例對微膠囊包埋率及平均粒徑的影響

2.1.5 正交試驗優化包埋工藝條件

根據單因素試驗結果，設定海藻酸鈉質量分數，CaCl2質量分數、固定時間和酶液與壁材的比例（V/V）4 個因素，每個因素設定3 個水平，以包埋率為評價指標，采用L9（34）正交試驗對固定條件進行優化，結果如表3 所示。

表3 正交試驗結果

由表3 可知，最優組合為A1B2C2D2即CaCl2質量分數為2%，海藻酸鈉質量分數為2.5%，固定時間為40 min，酶液與壁材比例為1∶2（V/V），由極差R 可知對脂肪酶微膠囊包埋率影響的主次為CaCl2質量分數（A）>酶液與壁材的比例（D）>固定時間（C）>海藻酸鈉質量分數（B）。

2.2 脂肪酶微膠囊的性質評價

2.2.1 微膠囊的形態觀察

脂肪酶微膠囊效果圖如圖5 所示，5（a）圖為濕潤狀態的微膠囊樣品，形態均一較為圓潤，表面光滑；5（b）圖是5（a）圖樣品冷凍干燥后得到的干態微膠囊，從圖可以看出顆粒均勻且較為細膩；5（c）圖是利用掃描電鏡觀察冷凍干燥后的微膠囊顆粒的表面結構，呈現出球形或橢球形，表面有類似于海綿狀的孔洞，表面有開裂，這一結果與GUO 等[24]對姜黃素微膠囊的研究結果相一致，冷凍干燥后的微膠囊容易出現更多的裂紋或斷裂。這是由于真空冷凍干燥條件下乳液在預凍過程中會形成冰晶體破壞原有結構，在分子間作用力下，更易導致溶質聚合，因而表面出現裂痕[25]。

圖5 微膠囊形態

2.2.2 微膠囊在模擬成人及兒童胃液中的耐受性

脂肪酶微膠囊在模擬嬰兒及成人胃液中的耐受性如圖6 所示，在模擬胃消化的過程中，由于微膠囊壁材遭到破壞，隨著消化時間的延長，微膠囊中脂肪酶的保留率呈現出持續下降的趨勢。（a）圖為模擬嬰兒胃部消化過程，胃消化60 min 后微膠囊中脂肪酶的保留率分別為67.23%；對比未包埋的脂肪酶在15 min內急劇下降至11%，到30 min 時完全失去活性，說明微膠囊壁材在一定程度上可以延長脂肪酶的存活時間。（b）圖為模擬成人胃部消化過程，消化60 min 后微膠囊中脂肪酶的保留率為55.94%；而游離的脂肪酶，在消化15 min 內就完全失活。在酸性環境中，微膠囊壁材遭到破壞，芯材釋放，在酸性環境中停留時間越長，微膠囊壁材破壞就越嚴重，酸性越強微膠囊壁材破壞也越嚴重。

圖6 微膠囊在模擬嬰兒（pH 3, a）和成人（pH 1, b）胃液中的耐受性

2.2.3 微膠囊的腸溶性

微膠囊在體內的特定部位溶解并釋放，是評價微膠囊的重要指標之一， 這決定著芯材能否最大限度的發揮生理功能。本試驗所制備的兩種脂肪酶微膠囊體系腸溶性結果如圖7 所示，其中微膠囊在消化的30 min 內釋放率呈現出持續增長的趨勢，微膠囊在此階段壁材持續被溶解；30~60 min 釋放率趨于平緩，說明微膠囊壁材的完全溶解發生在此階段，但值得注意的是微膠囊的釋放率并沒有達到100%而是在50%左右，可能是由于釋放的脂肪酶沒能及時與底物相結合而被腸液中的蛋白酶所破壞，這也導致了60 min后釋放率顯著下降。

圖7 微膠囊在模擬腸液中釋放性能

3 結 論

研究通過單因素和正交試驗，得出脂肪酶微膠囊最佳工藝條件為：海藻酸鈉質量分數為2.5%、氯化鈣質量分數為2%、酶液與壁材的比例1∶2（V/V）、固定時間為40 min，在該條件下制備的微膠囊包埋率可達59.26%。在模擬胃消化1 h 后，未包埋的脂肪酶經胃消化后完全失去活性；而脂肪酶微膠囊在模擬成人胃液（pH 1）時保留率為55.94%，在模擬嬰兒胃液（pH 3）時保留率為67.23%，因此可見制備的微膠囊具有良好的耐酸性；微膠囊中芯材在腸道中的釋放需要60 min 左右。研究實現了脂肪酶耐胃酸的目的，對促進脂肪消化吸收具有一定意義。