油菜蜂花粉發酵工藝及生物活性研究

段倩倩,程妮,2*,趙丞,曹煒,2

1(西北大學 食品科學與工程學院,陜西 西安,710069)2(陜西省蜂產品工程技術研究中心,陜西 西安,710065)

蜂花粉是蜜蜂將采集來的花粉摻入唾液和花蜜粘成的一種不規則顆粒物,其富含多糖、蛋白質、不飽和脂肪酸、酚類化合物等物質,被稱為人類營養的膳食補充劑[1],是一種極具開發價值的食物資源。這些營養物質和功能性成分介導多種生物效應,如抗氧化、抗癌和免疫調節等[2]。然而,蜂花粉由于特殊的腥味和花粉過敏的癥狀,大大降低了蜂花粉的可接受程度,且蜂花粉堅韌的細胞壁也限制了其內容物的釋放,因此,可以有效改善其感官特性、提高其生物有效性和生物活性,對蜂花粉資源開發具有重要意義。

目前,蜂花粉在食品中的應用主要是直接食用、壓成片劑或作為輔料添加到其他產品中,對于蜂花粉發酵,改善產品感官特性等也有報道,但是,發酵的微生物、花粉的植物來源以及發酵條件不同,對發酵結果也會有影響。此外,目前尚未有研究關注油菜蜂花粉發酵前后的抗氧化、抑菌和體外抗炎活性。因此,本文選用植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌2種益生菌來發酵油菜蜂花粉,采用單因素試驗和正交設計對發酵工藝進行優化,旨在改善蜂花粉口感、提高蜂花粉營養成分和生物學活性,為油菜蜂花粉進一步深加工提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌凍干性菌粉,山東中科嘉億生物工程有限公司提供;油菜蜂花粉,蜂農處,且經孢粉學鑒定確定其植物源;MRS肉湯、MRS固體培養基,北京奧博星生物技術有限公司;瓊脂培養基,自制;透明質酸酶、透明質酸鈉、牛血清白蛋白,上海源葉生物科技有限公司;葡萄糖、蘆丁、沒食子酸等標準品,上海阿拉丁生化科技有限公司;DNS試劑,廣檢(廣州)檢測科技有限公司;其余試劑均為國產分析純或生物制劑。

SHA-B恒溫搖床,常州國華電器有限公司;CXG-1微生物培養箱,上海青浦滬西儀器廠;UV1800分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;52AA旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;FD-1C-50凍干機,北京博醫康實驗儀器有限公司;超凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;PHS-3C pH計,上海佑科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化和培養

植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌凍干型菌粉在室溫下解凍,按照1%(體積分數)的接種量接種于10 mL MRS肉湯培養基中,于37 ℃活化12 h,將菌種分別接種到MRS液體培養基中,混合均勻并培養至對數生長期。

1.2.2 油菜蜂花粉處理

采用75%(體積分數)的食用酒精噴灑油菜蜂花粉,邊噴邊翻動,花粉密封2～3 h。取出后,其表面覆蓋8層滅菌紗布,置于40 ℃烘箱中,使乙醇完全揮發,備用。

1.2.3 單因素發酵試驗

乳酸菌接種量分別為3%、5%、7%、10%和15%(質量分數);添加水量分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、45%和50%(質量分數);發酵時間為0、24、48、72、96和120 h;發酵溫度為33、35、37、39和42 ℃;植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌菌液比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、2∶1、3∶1和5∶1(體積比,下同),將對數生長期的菌株接入蜂花粉中,測定發酵后乳酸菌活菌數和pH,同時進行感官評價。

1.2.4 乳酸菌發酵油菜蜂花粉工藝優化

根據單因素試驗結果,選擇確定乳酸菌接種量(%)、添加水量(%)、發酵溫度(℃)、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌菌液比例設計L9(34)正交設計,以乳酸菌活菌數和感官評分為指標對發酵工藝進行優化。因素水平如表1。

表1 發酵工藝優化正交設計水平表Table 1 Orthogonal test level of fermentation process optimization

1.2.5 驗證實驗

用正交試驗設計確定的最佳條件進行蜂花粉發酵,測定所得結果,比較其與實驗組的差異。

1.2.6 顯著性和相關性分析

采用SPSS 26.0軟件對代表性指標進行正交優化分析,得出蜂花粉的最優發酵方案。對所測活性指標進行顯著性差異分析(P<0.05),運用Origin 2022軟件作圖。

1.3 測定方法

1.3.1 乳酸菌活菌計數

乳酸菌活菌計數依據GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行測定。

1.3.2 發酵蜂花粉pH的測定

準確稱取5 g蜂花粉樣品,加入15 mL蒸餾水,振搖混勻后使用pH計測定pH值。

1.3.3 感官評價

感官評分標準如表2所示。

表2 發酵油菜蜂花粉感官評定標準Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented rape bee pollen

1.3.4 還原糖含量的測定

參考曾志恒等[10]的方法,采用DNS法測定還原糖含量,葡萄糖標準曲線對應方程為:y=0.574 8x-0.006 6(R2=0.996 4)。

1.3.5 蛋白質含量的測定

發酵前后蜂花粉經浸泡和抽提回流后脫脂,烘干后以1∶10(g∶mL)加入緩沖溶液(0.02 mol/L PBS溶液[NaCl],pH 7.4),4 ℃攪拌提取24 h,于4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,得到蛋白質提取液。采用考馬斯亮藍法測定花粉中粗蛋白的含量[11]。牛血清標準蛋白曲線對應方程為:y=0.316 3x-0.001 8(R2=0.997 5)。

1.3.6 抗氧化活性的測定

蜂花粉乙醇提取液的制備:各稱取發酵前后的蜂花粉樣品10 g與75%乙醇按料液比1∶10混合后超聲提取45 min后,熱回流提取2 h,抽濾,濾液濃縮后用75%乙醇定容至100 mL。

總酚、總黃酮含量測定參考SEIFZADEH等[12]的方法,總酚以沒食子酸為標準品,沒食子酸標準曲線對應方程為:y=12.034x+0.047 3(R2=0.993 3)。總黃酮以蘆丁為標準品,蘆丁標準曲線對應方程為:y=1.129 1x+0.002 2(R2=0.992 9)。

總抗氧化能力的測定參考何亮亮等[13]的方法,以FeSO4繪制標準曲線(0～0.4 mmol/L),蜂花粉總抗氧化能力以FeSO4當量表示,FeSO4標準曲線對應方程為:y=1.667 2x+0.001 7(R2=0.991 9)。

Fe2+螯合率測定參考何亮亮等[13]的方法,4 mL樣品稀釋液加入50 μL FeSO4(2 mmol/L)和Ferrozine(5 mmol/L)混勻后于37 ℃水浴反應30 min,于562 nm處測定吸光度,以蒸餾水為空白,Fe2+螯合率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:B0,4 mL 75%乙醇溶液代替樣品吸光度值;B1,樣品溶液吸光度值。

DPPH自由基清除能力參考HARA等[14]的方法測定。分別吸取0.2 mL發酵前后蜂花粉乙醇提取稀釋液,加入0.04 mg/mL的DPPH乙醇溶液5 mL,混勻后在室溫避光反應30 min,于517 nm處測定吸光度值。DPPH自由基清除率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A0,0.2 mL 95%乙醇溶液代替樣品吸光度值;A1,樣品溶液吸光度值。

1.3.7 抗炎活性的測定

參考HAN等[15]的方法,通過測量發酵前后蜂花粉對透明質酸酶催化反應的抑制作用間接評估其抗炎活性。A、B管中加入0.5 mL樣品溶液,C、D管加入0.5 mL蒸餾水,A、C管加入0.5 mL透明質酸酶溶液(500 U/mL),B、D管加入0.5 mL醋酸緩沖液(pH 5.6,0.1 mol/L),37 ℃保溫20 min,各管加入100 μL 2.5 mol/L的CaCl2溶液,37 ℃保溫20 min,A、C管加入0.5 mg/mL透明質酸鈉鹽0.5 mL,B、D管加入0.5 mL醋酸緩沖液,37 ℃靜置反應40 min,各加入0.5 mL蒸餾水、0.1 mL 5 mol/L NaOH溶液、0.5 mL乙酰丙酮溶液,沸水浴15 min、冰浴10 min、室溫10 min后加入1 mL P-DAB顯色劑,加無水乙醇定容至8 mL,混勻室溫放置30 min后于530 nm處測定吸光度值,以去離子水作空白,透明質酸酶抑制率根據公式計算于530 nm處測定吸光度值,透明質酸酶抑制率的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A、B、C、D分別為對應管在530 nm處的吸光度值。

1.3.8 蛋白質變性抑制實驗

參考文獻[16]的方法,稍作改動。2.8 mL、2%牛血清白蛋白(溶于pH 5.5、0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液中),于37 ℃保溫20 min,加入一定量待測定樣品,定容至5 mL,于70 ℃水浴20 min后迅速冷卻至室溫,于660 nm處測定樣品吸光度,記為As。用蒸餾水代替待測樣品作為對照組測定吸光度記為Ac。蛋白質變性抑制率的計算如公式(4)所示:

(4)

1.3.9 抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定發酵前后蜂花粉抑菌活性。將100 μL OD值為0.3～0.36菌懸液用移液槍注入到已滅菌的瓊脂培養基上,無菌條件下用玻璃棒涂布均勻,將5只無菌的牛津杯均勻放入培養皿中。吸取200 μL蜂花粉醇提液加入牛津杯中,3只平行,其余2只牛津杯中分別加入體積分數80%甲醇和無菌的9 g/L NaCl溶液。上述過程嚴格按照無菌操作進行,培養皿置培養箱37 ℃培養24 h。觀察各皿抑菌效果,量取抑菌圈直徑,結果取平均值[17]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

添加水量、發酵時間、發酵溫度、乳酸菌接種量、菌液比例對發酵蜂花粉的影響如圖1所示,乳酸菌利用蜂花粉中營養物質生長繁殖,其生長代謝情況直接影響了發酵蜂花粉的感官、理化特性和有益菌數。

a-添加水量;b-發酵時間;c-發酵溫度;d-發酵菌接種量;e-植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌菌液比例

2.1.1 添加水量的確定

水分是發酵中影響微生物代謝活動的一項重要因素。由圖1-a可以看出,當加水量為40%～45%時,蜂花粉感官評分較高,pH適宜,且加水量為40%時,發酵蜂花粉活菌數最高。但加水量>40%后,由于蜂花粉營養成分被稀釋,發酵蜂花粉感官特性變差,活菌數量也逐漸減少,故確定蜂花粉的最佳添加水量為40%。

2.1.2 發酵時間的確定

圖1-b顯示,發酵蜂花粉的pH隨著發酵時間的延長呈現先降低后穩定的趨勢,到72 h后趨于穩定,活菌數和感官評分隨著發酵時間先升高,發酵時間超過72 h后,活菌數和感官評分卻明顯降低。這主要是因為發酵時間短,活菌數含量低、酸度低,使發酵的特殊風味還未形成;發酵時間過長時,產酸多、酸味重,且可供發酵的營養物質有限,活菌數和感官評分也會明顯下降[18]。

2.1.3 發酵溫度的確定

由圖1-c可以看出,當發酵溫度為35～39 ℃時,發酵蜂花粉感官評分沒有顯著差異,均保持較高水平,發酵溫度為37 ℃時,活菌數最高,為8.52 lg CFU/g。發酵溫度較低時,蜂花粉發酵不充分,苦味明顯;發酵溫度過高時,不利于乳酸菌生長,蜂花粉色澤由金黃色變為褐色,且會產生刺激性氣味,嚴重影響發酵蜂花粉感官品質,因此,蜂花粉發酵溫度選擇37 ℃為宜。

2.1.4 乳酸菌接種量的確定

乳酸菌的接種量對發酵蜂花粉的發酵程度、口感和風味會產生一定的影響,由圖1-d可知,當乳酸菌接種量為10%時,油菜蜂花粉活菌數較多,感官評分較高,pH適宜,此時發酵蜂花粉酸甜適中。接種量太低會使蜂花粉發酵緩慢,乳酸菌不能充分利用其營養成分,產酸低,口感差,且易造成雜菌污染;乳酸菌濃度高,會使蜂花粉偏酸,且接種量太高會增加經濟成本,因此,菌接種量應該選擇10%。

2.1.5 菌液比例的確定

由圖1-e可知,不同的菌液比例(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌)對蜂花粉的感官評分、活菌數和pH具有顯著影響。當植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌為1∶1、2∶1時,活菌數和感官評分達到較高值,分別為8.52、8.50 lg CFU/g和10.63、10.70分。實驗結果表明,當植物乳桿菌接種過量或者鼠李糖乳桿菌接種量較多,都會影響蜂花粉的發酵,當菌液比例為2∶1時,能達到較好的發酵結果。

2.2 正交試驗設計結果

正交試驗設計結果見表3。

表3 正交試驗設計結果Table 3 Orthogonal design results

由表3可知,通過正交設計優化乳酸菌發酵工藝參數,由極差分析可以看出,對發酵蜂花粉活菌數的影響由大到小的順序為添加水量>發酵溫度>菌液比例(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌)>乳酸菌接種量,發酵最優水平為A3B2C2D2。對感官評分的影響由大到小的順序為菌液比例(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌)>添加水量>發酵溫度>乳酸菌接種量,發酵最優水平為A2B1C2D3。由于4個因素對于發酵蜂花粉影響程度不一致,導致其最優方案也不同。因素A對于乳酸菌活菌數而言,取A3(50%)較好,但是取A3時,因為加水量較多,感官評分較低,因此從感官角度應該選擇A2。因素B是2個指標中較重要的因素,從活菌數來說取B2(37 ℃)最好,但取B2時感官分數低,由于因素B2對乳酸菌活菌數的影響大于對感官的影響,因此選擇B2。因素C對于2個指標都是取C2(10%)好;因素D從感官角度出發,應取D3(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=3∶1),但對活菌數而言取D2好,由于因素D3對感官評分的影響大于對活菌數的影響,因此選擇D3。綜合來說,油菜蜂花粉發酵工藝的最佳組合為A2B2C2D3,即添加水量40%,發酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌菌液比例為3∶1。

2.3 驗證實驗

添加水量40%,發酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=3∶1時,油菜蜂花粉發酵72 h后,發酵蜂花粉的乳酸菌活菌數為8.37 lg CFU/g,感官評分為11.79,優于其他實驗組。

2.4 發酵對油菜蜂花粉營養成分和生物活性成分的影響

根據最優發酵條件完成油菜蜂花粉的發酵,其營養和生物活性成分的變化見表4,發酵后蜂花粉的水溶性蛋白含量降低,為2.24 g/100 g,可能是發酵過程中乳酸菌將蜂花粉中大分子的蛋白質降解為小分子的多肽和氨基酸。

2.5 發酵對油菜蜂花粉抗氧化活性的影響

由表5可知,發酵后油菜蜂花粉抗氧化活性顯著增強(P<0.05),發酵后總抗氧化能力為0.29 mmol FeSO4/g,是發酵前的1.26倍。發酵后油菜蜂花粉對DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率分別為68.79%、76.56%,較發酵前分別提高了10.49%、23.19%。孫旭等[7]研究發現,茶花粉經乳酸菌發酵后對自由基的清除能力提高了28.73%;類似的研究如MENG等[23]使用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發酵枇杷汁后發現其抗氧化活性也顯著增加。總體來看,抗氧化活性的變化與多酚類物質的變化趨勢相一致,當發酵的菌種合適時,這些物質不但不會影響微生物,反而會被微生物代謝成生物活性更高且利于人體吸收的小分子物質。此外,某些乳酸菌會產生胞外酶,使酚類物質之間實現相互轉化,從而改變其抗氧化活性[24]。

表5 發酵對油菜蜂花粉抗氧化活性的影響Table 5 Effect of fermentation on antioxidant activity of rape bee pollen

2.6 發酵前后抗炎活性變化

透明質酸酶可降解細胞質基質中的透明質酸,并且具有較低的降解其他直鏈糖胺聚糖的能力[25],與炎癥、過敏具有很強的相關性[16]。因此,透明質酸酶活性抑制試驗是評價體外抗炎活性的一項指標。油菜蜂花粉發酵前后抗炎活性結果如圖2所示。發酵后的蜂花粉對透明質酸酶活性抑制率為46.08%,較發酵前的13.73%提高了3.36倍。有研究證實多酚類、黃酮類可以有效抑制透明質酸酶活性,而且乳酸菌還具有生物轉化作用,可能是通過代謝增加了某種具有生物活性物質的含量,從而增強了其抗炎活性[26]。炎癥被認為是一種主要的生理防御機制,有助于身體保護自身免受不同的刺激[27]。組織蛋白的變性是炎癥和關節炎疾病的原因之一,因此抑制蛋白質變性被認為是衡量體外抗關節炎活性的重要指標[28]。比較發酵前后的樣品抑制蛋白變性結果發現,發酵可以有效提高蜂花粉的抗炎活性。發酵后的蜂花粉抑制蛋白質變性較發酵前提高了24.65%,導致這一結果可能的原因是乳酸菌發酵積累的代謝產物具有一定的抗炎作用,或者蜂花粉經發酵后,生物活性物質釋放,進一步促進了其抗炎作用。

圖2 透明質酸酶活性和牛血清白蛋白變性抑制實驗結果Fig.2 Experimental results of hyaluronidase activity and denaturation inhibition of bovine serum albumin

2.7 發酵對油菜蜂花粉抑菌活性的影響

發酵前后蜂花粉對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種食源性微生物的抑制活性試驗結果見表6。

表6 發酵對3種食源性微生物抑菌活性的影響Table 6 Effect of fermentation on bacteriostatic activity of three food borne microorganisms

3 結論

研究結果表明,油菜蜂花粉發酵的最佳條件為添加水量40%,發酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=3∶1。在最優條件下,發酵72 h后的蜂花粉色澤呈金黃色,酸甜適宜,具有輕微香氣,活菌數為8.37 lg CFU/g,感官評分為11.79。而且發酵油菜蜂花粉總酚、總黃酮的含量提高了16.09%、51.02%;還原糖含量和蛋白質含量顯著降低,分別為43.75、2.24 g/100 g。油菜蜂花粉經發酵后,總抗氧化能力為0.29 mmol FeSO4/g,是發酵前的1.26倍;DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率較發酵前分別提高了10.49%、23.19%。對透明質酸酶活性抑制率從發酵前的13.73%提高至46.08%,抑制蛋白質變性的能力提高了24.65%。且發酵后的油菜蜂花粉對食源性微生物抑菌活性顯著增強。綜上所述,乳酸菌發酵不僅能改善油菜蜂花粉的感官品質,也可增加其內容物的溶出,且抗氧化、體外抗炎和抑菌活性有所增強。因此,發酵可作為增強油菜蜂花粉功能和開發油菜蜂花粉健康品的重要加工方法之一,為蜂花粉的深加工提供進一步理論指導。