雞蛋過敏原Gal d 4線性表位的預測定位及鑒定

王濤,湯鑫磊,李倩,姜松松

(揚州大學 旅游烹飪學院,江蘇 揚州,225127)

雞蛋過敏是一種過敏性疾病,能夠引發嚴重的臨床癥狀,甚至導致休克、死亡,嚴重影響著人類的生活質量和生命安全[1]。雞蛋過敏多發于在嬰幼兒時期,占嬰幼兒和兒童食物過敏的35%;同時在成人中也存在廣泛,占成年人食物過敏的12%[2-3]。在我國,雞蛋是除牛奶外,第二大導致嬰幼兒和兒童過敏的食物[4]。而在某些發達國家,雞蛋過敏的患病率甚至超過了牛奶[5]。雞蛋過敏原主要有6種,其中4種存在于蛋清中,包括卵類黏蛋白(ovomucoid,OVM,Gal d 1)、卵白蛋白(ovalbumin,OVA,Gal d 2)、卵轉鐵蛋白(ovotransferrin,OVT,Gal d 3)和溶菌酶(lysozyme,Lys,Gal d 4),另外2種存在于蛋黃中,分別為 α-卵黃蛋白(α-livetin,Gal d 5)和卵黃糖蛋白 42(yolkglycoprotein42,Gal d 6)[6]。其中,溶菌酶是存在于雞蛋蛋清中的一種過敏原蛋白,占蛋清含量的3.5%,分子質量為14.3 kDa,它常被用于制藥產品、奶酪和葡萄酒行業。但多項研究表明,雞蛋過敏患者血液中存在溶菌酶特異性IgE抗體[7-8],這說明Gal d 4也是一類重要的蛋清過敏原。

抗原表位,即抗原決定簇,是過敏原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團。表位按照結構特點通常分為線性表位和構象表位,前者由連續的氨基酸組成,后者則是不相連的氨基酸殘基通過折疊所形成的空間結構,按照與細胞結合的類型可以分為T細胞表位和B細胞表位[9]。B細胞表位是可被B細胞表面受體或B細胞分泌的抗體特異性識別并相互結合的表位[10]。T細胞表位是通過主要相容組織復合體(major histocompatibility complex,MHC)分子提呈的,CD8+T細胞表達的T細胞抗原受體(T cell receptor,TCR)識別的表位由MHC-I類分子提呈,CD4+T細胞表達的TCR識別的表位由MHC-II類分子提呈[11]。T細胞表位屬于線性表位,沒有構象結構域。它們不能與細胞結合的IgE交聯或激活肥大細胞和嗜堿性粒細胞,但可以引發T細胞產生增殖、分化,是決定過敏反應的關鍵。因此,獲得B細胞表位和T細胞表位信息是充分了解食物過敏致敏機理的基礎。

目前,已有大量研究對雞蛋蛋清致敏原Gal d 1、Gal d 2 和 Gal d 3 的線性表位進行了研究。但目前關于Gal d 4的線性表位尚未被表征。目前來說,線性表位的分析方法主要有傳統化學切割法、重疊合成肽庫法、核磁共振分析法、質譜技術以及生物信息學預測方法[12]。重疊合成肽等方法由于其高昂的實驗成本以及較大的盲目性使其不適合大規模應用[13],生物信息學方法是一種新興的預測線性表位的方法[14],其原理是對已知的線性表位特點進行歸納后,發現親水性殘基與表面可及性較高區域可能位于分子表面,因此這些區域相比較而言形成抗原表位的可能性較大,可塑性較高的區域表明這部分具有較好的柔韌性,也容易形成利于抗體能夠識別的空間結構,是表位所在區域的概率也較高[15]。生物信息學方法對食物過敏原表位的預測有利于研究潛在的抗原表位,在一定程度上可以減少分析過敏原結構與功能所消耗的時間與費用[16]。

因此,本研究擬通過使用生物信息學方法預測雞蛋過敏原Gal d 4的線性表位,并對其線性表位進行空間定位,隨后對預測所得B細胞線性表位進行鑒定,為進一步認識雞蛋過敏原Gal d 4的結構與功能奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 生物信息學方法分析雞蛋過敏原Gal d 4 的線性表位

在Uniprot數據庫獲取雞蛋過敏原Gal d 4的氨基酸序列。使用SignalP-5.0 services軟件對Gal d 4信號肽進行預測。使用生物信息學軟件DNAStar Protean中的Hoop-woods的氨基酸親水性方案[17]、Emini的表面可及性算法[18]、Kparlus-Schuzl的可塑性分析[19]和Jameson-wolf的抗原指數分析方案[20],對Gal d 4的一級序列性質進行分析,綜合分析這些參數預測結果的重疊部分后,得出DNAStar預測所得的雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位序列。

分別使用Immunomedicine Group中的predicted antigenic peptides(IGPAP)、Bepipred-2.0 server和ABCpred在線工具對Gal d 4的B細胞線性表位進行預測。篩選以上3種方法預測所得的B細胞線性表位的重疊區域作為最終所得的Gal d 4的B細胞線性表位序列。

分別利用SYFPEITHI、NetMHC和NetCTL三種在線工具預測Gal d 4 的CD8+T細胞表位。表位肽段長度設置為9 AA。MHC類型選擇人白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)-I類分子HLA-A*02:01(A2)和HLA-A*03:01(A3)作為限定條件。SYFPEITHI分析結果選取得分在前2%的肽段作為可能性較大的表位肽段;NetMHC分析結果親和值<50 nm的肽段作為強結合肽段,50 nm<親和值<500 nm的肽段為弱結合肽段;NetCTL預測所得表位鑒定的閾值為0.75。

利用NetMHCⅡpan 4.0 Serer在線工具預測Gal d 4 的CD4+T細胞表位。表位肽段的長度設置為15 AA,選取HLA-Ⅱ類分子 (HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1302、HLA-DRB1*1501)作為預測限定條件。表位肽段與HLA-Ⅱ類分子的親和性閾值為50 nm,親和值<50 nm的肽段為強結合肽段,50 nm<親和值<500 nm的肽段為弱結合肽段。

1.2 生物信息學方法分析雞蛋過敏原Gal d 4二級結構

使用DNAStar Protean載入Uniprot數據庫中下載的FASTA格式的雞蛋過敏原Gal d 4的氨基酸序列,對其二級結構使用Chou-Fasman以及Garnier-Robson方案進行預測分析。

1.3 空間定位

在PDB數據庫中查找雞蛋過敏原Gal d 4的三級結構模型,將使用生物信息學軟件預測所得的Gal d 4的B細胞線性表位序列進行空間定位。

1.4 免疫活性鑒定

生物信息學軟件預測所得的B細胞線性表位經Fmoc法固相合成,采用高效液相色譜分析純度。收集的6名雞蛋過敏患者的血清,采用間接競爭ELISA實驗對合成的預測線性表位進行IgE結合活性驗證。根據FU等[21]的方法略有改動,使用純化的Gal d 4包被在96孔板上孵育過夜。3%牛血清白蛋白封閉2 h后,合成肽(B1～B5)與單個血清樣品在37 ℃下孵育1.5 h,一抗為收集的雞蛋過敏患者血清,山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶為二抗,稀釋度均為1∶50。H2SO4終止反應后,在450 nm處測定吸光度。IgE結合活性抑制率按公式(1)計算:

抑制率/%=(1-OD450/OD0)×100

(1)

式中:OD0,空白樣吸光度;OD450,450 nm處吸光度。

1.5 數據處理

數據統計與圖標繪制工具主要為DNAStar軟件、SignalP- 5.0 services(https://services.healthtech.dtu.dk/)、Predicted Antigenic Peptides(http://imed.med.ucm.es/)、Bepipred-2.0 server(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)、ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)、NetMHC(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHC-4.0)、NetCTL(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetCTL-1.2)。

2 結果與分析

2.1 雞蛋過敏原Gal d 4信號肽預測

如圖1所示,1MRSLLILVLCFLPLAALG18前18個氨基酸殘基為Gal d 4信號肽的可能性為99.72%。信號肽是引導新和成的蛋白質向分泌通路轉移的短肽鏈,通常疏水性較強,不適合作為線性抗原表位。

圖1 SignalP- 5.0 services預測所得Gal d 4信號肽序列Fig.1 The Gal d 4 signal peptide sequence was predicted by signalP-5.0 Services注:圖中下劃線部分為預測所得信號肽區域。

2.2 DNAStar預測雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位

親水性和表面可及性高的區域一般分布在蛋白質分子的表面,易產生表位與抗體結合的區域,而可塑性較強的區域由于其易發生折疊和扭曲,因此,也容易形成利于抗體能夠識別的空間結構[22]。如圖2所示,在氨基酸親水性方案分析中,親水性指數>0表明親水性好,雞蛋過敏原Gal d 4的親水性區域分布較為均勻,親水性較好的氨基酸肽段為AA 22～26、AA 27～37、AA 52～55、AA 60～69、AA 84～92、AA 111～122和AA 130～137;以表面可及性指數>1為篩選條件,表面可及性較好的氨基酸肽段為AA 29～41、AA 52～67、AA 84～91和AA 128～136;在可塑性方案分析中,AA 35～40、AA 52～70、AA 83～93、AA 102～107、AA 117～122和AA 131～137的氨基酸肽段具有一定的柔韌性,形成表位的可能性較大,容易與抗體進行嵌合[23];在抗原指數分析中,以抗原指數>0為篩選條件,結果顯示抗原指數較高的氨基酸肽段為AA 19～26、AA 27～45、AA 51～72、AA 77～94、AA 102～107、AA 110～124、AA 128～137和AA 143～146,這些區域可能含有潛在的優勢抗原表位。

圖2 DNAStar對Gal d 4的一級氨基酸序列分析Fig.2 Sequence analysis of primary amino acid of Gal d 4 by DNAStar

綜合以上參數,篩選出同時滿足4個條件的氨基酸序列作為雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位候選氨基酸序列。結果如表1所示,DNAStar預測Gal d 4 B細胞線性表位為:19KVFGRCEL26、27AAAMKRHGLDNYRG40、52FESNFNTQATNRNTDG67、83NDGRTPGSRNL93、117VSDGNGMN124和130RNRCKGTD137。

表1 DNAStar預測Gal d 4 B細胞線性表位Table 1 DNAStar prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.3 IGPAP預測雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位

進一步采用IGPAP預測雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位,根據KOLASKAR等[24]的方法預測抗原表位,結果如表2所示,IGPAP預測Gal d 4的B細胞線性表位為:4LLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAA28、43LGNWVCAA50、92NLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKI116和134KGTDVQAWIRG144。

表2 IGPAP預測Gal d 4 B細胞線性表位Table 2 IGPAP prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.4 Bepipred預測雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位

同時,采用Bepipred-2.0 server在線工具使用隱馬爾可夫模型和親水性參數評分預測Gal d 4 B細胞線性表位序列[25]。結果如表3所示,Bepipred-2.0 server預測Gal d 4 B細胞線性表位為:19KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGN45、57NTQATNRNTDGST-DYGIL74、76INSRWWCNDGRTPGSRNLCNI96和115KIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRG144。

表3 Bepipred預測Gal d 4 B細胞線性表位Table 3 Bepipred prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.5 ABCpred預測雞蛋過敏原Gal d 4 B細胞線性表位

最后,將雞蛋過敏原Gal d 4氨基酸序列提交到ABCpred網絡服務器后,利用人工神經網絡模型預測出Gal d 4的B細胞線性表位序列[26]。結果如表4所示,ABCpred預測Gal d 4 B細胞線性表位為:19KVFGRCELAAAMKR32、44GNWVCAAKFESNFNTQA60、65TDGSTDYGILQ75、78SRWWCND84、87TPGSRNLCNIP97和132RCKGTDVQAWI142。

表4 ABCpred預測Gal d 4 B細胞線性表位Table 4 ABCpred prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.6 雞蛋過敏原Gal d 4 B細胞線性表位的綜合分析

綜合DNAStar、IGPAP、Bepipred-2.0 server以及ABCpred預測所得的Gal d 4 B細胞線性表位序列結果,如圖3所示,4種軟件預測重疊氨基酸序列為:19KVFGRCELAA28、92NL93和134KGTD137。3種軟件預測重疊氨基酸序列為:29AMKR32、44GN45、57NTQA60、65TDG67、83ND84、87TPGSR91、94CNI96、132RC133、138VQAWI142。因此,綜合以上結果,將3種及以上軟件預測重疊氨基酸數≥3的序列作為雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位,這些氨基酸序列是B細胞表位的可能性較大,可作為研究重點。如表5所示,綜合分析所得Gal d 4的B細胞線性表位為:19KVFGRCELAAAM-KR32、57NTQA60、65TDG67、87TP-GSRNLCNI96和132RCKGTDVQAWI142。

表5 不同軟件預測Gal d 4 B細胞線性表位的氨基酸序列Table 5 Amino acid sequences of B cells linear epitopes of Gal d 4 predicted by different software

圖3 不同軟件預測Gal d 4的B細胞線性表位的綜合分析Fig.3 Comprehensive analysis of B cells linear epitopes of Gal d 4 predicted by different software注:圓角矩形方框內為4種軟件預測重疊氨基酸序列;直角矩形方框內為3種軟件預測重疊氨基酸序列。

2.7 雞蛋過敏原Gal d 4的CD8+ T細胞表位預測

SYFPEITHI、NetMHC和NetCTL三種在線工具可切斷肽鏈羧基的蛋白酶體并分析對肽段進行加工和轉運的速率,從而計算得分。預測所得Gal d 4 的CD8+T細胞表位結果如表6所示,與HLA-I類分子結合較好的表位肽段有42SLGNWVCAA50、100ALLSSDITA108。

表6 預測所得Gal d 4 的CD8+ T細胞表位Table 6 Comprehensive analysis of CD8+ T cell epitopes of Gal d 4

2.8 雞蛋過敏原Gal d 4的CD4+ T細胞表位預測

利用NetMHCⅡpan 4.0 Serer 在線工具預測Gal d 4 的CD4+T細胞表位結果如表7所示。每個HLA-Ⅱ類分子結合的肽段數量都有所不同,其中,HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*1501分別含有4、5、4個強結合肽段,大部分HLA-Ⅱ類分子都含有數目不同的弱結合肽段。

表7 預測所得Gal d 4 的CD4+ T細胞表位Table 7 Comprehensive analysis of CD4+ T cell epitopes of Gal d 4

2.9 雞蛋過敏原Gal d 4的T細胞表位綜合分析

雞蛋過敏原Gal d 4的T細胞表位綜合分析如表8所示。根據CD4+T抗原表位覆蓋CD8+T細胞抗原表位的原則,得到2條優勢表位,即42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108。

表8 預測所得Gal d 4 的T細胞表位綜合分析Table 8 Comprehensive analysis of T cell epitopes of Gal d 4

2.10 雞蛋過敏原Gal d 4的二級結構預測

圖4為使用DNAStar軟件中的Chou-Fasman和Garnier-Robson方案對Gal d 4二級結構進行預測的結果[27]。分析可知,2種方案預測該蛋白二級結構的類型中α-螺旋和β-轉角結構占據了主要優勢,β-折疊次之。總體來看,Gal d 4二級結構中有序的螺旋、轉角和折疊占據了主要優勢,無規則卷曲的比例較小,反映了該蛋白具有較為致密的結構。

圖4 Gal d 4的二級結構預測Fig.4 Prediction of secondary structure of Gal d 4

2.11 雞蛋過敏原Gal d 4線性表位的空間定位

通過在PDB數據庫下載雞蛋過敏原Gal d 4三維空間結構,利用PyMOL軟件對表5和表8中預測所得的線性表位在雞蛋過敏原Gal d 4的空間結構中進行定位,結果如圖5所示。如圖5-A1所示,圖中彩色區域是預測所得B細胞線性表位在Gal d 4分子飄帶模型的空間結構中的定位,5個模擬表位均已在圖中用數字標注。其中,19KVFGRCELAAAMKR32位于α-螺旋與無規則卷曲的連接處;57NTQA60位于β-折疊與無規則卷曲的連接處;65TDG67位于β-折疊與β-轉角的連接處;87TPGSRNLCNI96和132RCKGTDVQAWI142位于無規則卷曲區域。α-螺旋與β-折疊的結構特征能夠較好的保持穩定,β-轉角與無規則卷曲具有較好的可塑性以及表面可及性,有利于抗原表位的形成,這表明5個模擬表位成為B細胞線性表位的潛力較大。圖5-A2～圖5-A3分別為Gal d 4表面分子模型正視圖與翻轉180°后的背視圖。如圖所示,2個視圖中的5個B細胞模擬表位基本完全暴露在外,具有較好的表面可及性以及較大的接觸面積,利于在溶液的環境中與抗體互相作用。值得注意的是,在圖5-A2和圖5-A3中,19KVFGRCELAAAMKR32、57NTQA60和132RCKGTDVQAWI142、65TDG67和87TPGSRNLCNI96在氨基酸序列上不連續,卻在空間結構上鄰近,使其具有成為構象表位的潛力。

A-預測所得Gal d 4 B細胞線性表位;B-預測所得Gal d 4 T細胞表位;A1-預測所得B細胞線性表位在Gal d 4 分子飄帶模型中的定位;A2～A3預測所得B細胞線性表位在Gal d 4表面分子模型暴露情況;B1-預測所得T細胞表位在Gal d 4分子飄帶模型中的定位;B2～B3預測所得T細胞表位在Gal d 4表面分子模型暴露情況

圖5-B為預測所得T細胞表位在Gal d 4空間結構的定位。42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108均位于α-螺旋與無規則卷曲的連接處,能較好的與MHC分子結合形成抗原肽從而被T細胞識別誘發免疫反應。

2.12 雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位的空間定位

預測所得的B細胞線性表位IgE結合活性驗證結果如圖6所示。

圖6 Gal d 4的B細胞線性表位鑒定Fig.6 Identifcation of linear epitopes of B cells of Gal d 4注:Lys為雞蛋溶菌酶純品,不同字母標記表示為具有統計學上的差異性。

B1對雞蛋過敏病人血清與致敏蛋白的特異性結合具有顯著的抑制作用,這表明其免疫活性較強,具有一定的致敏性。B2～B5肽段則未顯示出明顯的抑制作用,表明其致敏潛力較小。因此,我們推斷B1:19KVFGRCELAAAMKR32為Gal d 4 的B 細胞線性表位。

3 結論與討論

本研究通過生物信息學方法對雞蛋過敏原Gal d 4的線性表位進行預測分析,最終篩選出5個B細胞線性表位,分別為:19KVFGRCELAA AMKR32、57NTQA60、65TDG67、87TPGSRNLCNI96和132RCKGTDVQAWI142;2個T細胞抗原表位,分別為:42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108。B細胞線性表位大部分位于親水性、表面可及性以及可塑性較強的區域。蛋白質的疏水性氨基酸被包被于蛋白內部,親水性氨基酸一般位于蛋白表面,因而,親水性較強的區域易于抗體結合產生相互作用;表面可及性主要指溶劑分子接觸抗原氨基酸的可能性,間接反映了與抗體的結合能力;可塑性強的區域的氨基酸易發生折疊和扭曲,有利于抗原與抗體的嵌合[28]。LI等[29]預測所得水牛乳β-乳球蛋白表位也位于親水性、表面可及性以及可塑性較強的區域。結合雞蛋過敏原Gal d 4的二級結構以及三維空間結構可知,Gal d 4的空間結構是由3個α-螺旋、1個β-折疊以及部分β-轉角和無規則卷曲組成的。由二硫鍵形成α-螺旋在維持蛋白質空間結構穩定性方面起到非常重要的作用[30];無規則卷曲多暴露在蛋白分子表面,有利于其與抗體嵌合;同時α-螺旋和β-轉角具有較高的氫鍵能,可以保持蛋白質的結構,并與抗體產生強烈的相互作用[31],這些使Gal d 4蛋白形成致密的球狀分子,為其致敏性提供了穩定的結構基礎。在本研究中預測所得的5個B細胞線性表位位于無規則卷曲與α-螺旋、β-轉角的連接處或無規則卷曲處,馬秀麗等[32]通過生物信息學方法預測的芝麻過敏原蛋白Ses i 3的B細胞線性表位大多分布在β-轉角和無規則卷曲區域。而李雪嬌等[33]通過生物信息學方法預測小麥過敏原B細胞線性表位則位于無規卷曲處和α-螺旋與無規卷曲的連接處,這與本研究預測結果相似。將5個B細胞線性表位定位在分子表面發現,5個表位大部分暴露在分子表面,具有較好的表面可及性以及較大的接觸面積,利于在溶液的環境中與抗體互相作用。值得注意的是,在本研究中發現,非連續的B細胞模擬線性表位片段19KVFGRCELAAAMKR32、57NTQA60和132RCKGTDVQAWI142、65TDG67和87TPGSRNLCNI96在空間結構上鄰近,這使其具有了形成構象表位的潛力。這表明,連續的氨基酸序列在成為線性表位的同時,具有一定的潛力與空間上鄰近的其他具有較大可能成為抗原表位的氨基酸序列形成構象表位。GUO等[34]在對核桃過敏原Jug r 1的研究中也證實了表位既可以是氨基酸的線性序列(線性表位),又可以是三維結構的基序(構象表位),這與本研究結果一致。

T細胞表位是能被MHC分子遞呈和T細胞識別的抗原表位多肽,在細胞免疫中起著重要作用。目前T細胞表位生物信息學技術比較成熟,尤其是與MHC-I類分子結合的CD8+T細胞表位,預測的精確率已達80%以上,雖然與MHC-II類分子結合的CD4+T細胞表位預測稍遜于前者,但隨著生物信息學的發展也日趨成熟[35]。PASCAL等[36]使用NetMHCⅡpan-2.0算法預測Ara h 2肽段與HLA-II類分子結合力強的區域,最終鑒定了Ara h 2中的4個T細胞抗原表位。本研究預測所得T細胞表位經空間定位后發現,42SLGNWVCAA50大部分被包藏于蛋白分子內部,可能于消化后暴露增強其致敏性。

但從理論和實際效果看,針對線性表位相關預測方法雖然取得了一定的進展,但同時也存在著一定的缺陷,缺乏統一的標準進行評估和比較[37]。也有研究表明,僅僅依靠氨基酸序列展現的性質所預測得到的模擬表位的方法并不牢靠,需要與非表位特性的特征結合起來以提高預測模擬表位的準確性[38]。對絕大多數食物過敏而言,過敏原初次接觸機體,通過一系列反應,刺激B細胞產生IgE抗體,過敏原再次接觸,其B細胞表位與IgE抗體結合,誘發過敏反應,因此B細胞的線性表位十分重要。本研究通過固相肽合成方法[39]結合間接競爭ELISA對預測所得模擬表位進行鑒定,以此提高表征B細胞線性表位的精確性。結果表明,只有B1肽段具有較好的IgE結合活性,說明其成為B細胞線性表位的潛力巨大。剩余4個預測所得模擬表位展現較弱的抑制作用,可能是因為其氨基酸序列中包含了雞蛋溶菌酶的部分B細胞線性表位但并不完全,也有可能是因為雞蛋過敏患者的差異性,導致其特異性結合效果并不理想。

綜上,本研究首次對雞蛋過敏原Gal d 4的B細胞線性表位和T細胞表位同時進行表征,獲得了5個模擬B細胞線性表位:19KVFGRCELAAAMKR32、57NTQA60、65TDG67、87TPGSRNLCNI96和132RCKGTD-VQAWI142以及2個模擬T細胞抗原表位:42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108,對其在Gal d 4的三維結構模型上進行空間定位,最后通過固相肽合成結合間接競爭ELISA對預測所得模擬表位進行鑒定,得到一個優勢B細胞線性表位:19KVFGRCELAAAMKR32。這為進一步明確溶菌酶Gal d 4的表位提供了依據,同時也為雞蛋過敏原的識別與檢測提供了參考。