海地瓜巖藻聚糖與硫酸軟骨素雙水相分離方法的研究

宋琳,宋曉,薛長湖,2,李嘉靖,劉冠辰,陳廣寧,李嘉宇,劉金秋,常耀光,2*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266003)2(青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東 青島,266237)

海參是一種富含生物活性物質的海洋動物,藥食兼用,產地遍布全球。大宗低值海參品類產值低,傳統海參產品制作方式易造成多糖等水溶性營養物質的流失。對海參生物活性物質進行深入研究,有利于促進低值海參的高值化利用,為臨床醫學、制藥行業提供巨大的經濟價值和應用前景。

海參多糖是海參中一類重要生物活性物質[1],占海參干質量6%以上,主要有巖藻聚糖和巖藻糖基硫酸軟骨素2類,具有抗炎[2]、護肝[3]及抗氧化[4]等多種生物活性。巖藻聚糖是由L-巖藻糖構成的直鏈多糖;巖藻糖基硫酸軟骨素是葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基半乳糖、巖藻糖連接構成的支鏈多糖[4]。2種多糖的鏈構象、生物活性[5]、研究方法均有差異;分子質量、黏度等物化性質也不同,具有不同的應用場景,分離純化巖藻聚糖及巖藻糖基硫酸軟骨素,對于它們的研究、應用,以及海參的充分開發具有重要意義。

海參中的巖藻聚糖和硫酸軟骨素的分離純化方法主要有分步醇沉及色譜法2類。分步醇沉法較為簡便,通過添加乙醇至終體積分數為40%、75%,使多糖沉淀,但提取產物中含有雜蛋白及色素,該方法常用于粗多糖的提取。色譜法可以有效分離海參中的2種多糖,主要有陰離子交換柱層析法[6-7]和凝膠色譜柱層析法[8-9],2種層析法聯用[10]能夠獲得單一多糖組分,但該法操作繁瑣、耗時長,且處理的樣品量少。目前,建立一種操作簡便、高效且分離效果好的分離方法有助于海參多糖進一步的研究與開發。

雙水相體系在天然復雜基質的單一組分精確提取方面展現出極大的潛力,常被用于分離純化活性要求高、濃度低的天然產物,如DNA[11]、病毒[12]、蛋白質[13]、多糖[14]、青霉素[15]等多種生物分子[16]。該體系是2種高聚物或高聚物與無機鹽在水中以適當的濃度溶解后形成的互不相溶的兩相體系[17]。其中,聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-鹽雙水相體系在多糖純化方面應用廣泛,如糖胺聚糖[18]、龍葵多糖[14]、蘆薈多糖[19]、牛蒡多糖[20]等多糖。目前相關研究多將雙水相體系運用于不同種生物大分子之間的分離純化,對于同類型生物大分子,尤其是不同種類多糖之間的分離純化報道較少。通過前期預實驗,我們發現PEG-鹽雙水相體系在海參中的巖藻聚糖和硫酸軟骨素的分離純化方面展現了較大的潛力,本研究將對該方法進行進一步研究及優化。

本研究以海地瓜(Acaudinamolpadioides)為原料,擬通過單因素試驗,分別研究其中巖藻聚糖、硫酸軟骨素在雙水相體系中的分配行為,并設計和建立雙水相體系,實現巖藻聚糖和硫酸軟骨素2種多糖組分的分離,以期獲得一個可以有效分離巖藻聚糖與硫酸軟骨素的方法,為其他海參來源多糖的分離研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海地瓜(Acaudinamolpadioides),市售;檸檬酸鈉、K2CO3、Na2SO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、NaH2PO4、無水乙醇、NaCl、L-半胱氨酸、EDTA-Na2,國藥集團化學試劑有限公司;PEG(分子質量為2 000、4 000、6 000、10 000、20 000 Da)、木瓜蛋白酶,上海麥克林生化科技有限公司;TSKgel Super AW4000凝膠柱,日本Tosoh公司;HiPrep 26/10 Desalting凝膠柱、色譜柱HiPrepTM26/60 Sephacryl S-500 column,美國GE Healthcare Life Sciences公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Advantage A10超純水機、10 kDa超濾離心管,美國密理博公司;酶標儀,美國BioRad公司;Agilent 1260 HPLC高效液相色譜儀,配備示差檢測器(refractive index detector,RID),美國安捷倫公司;KTA Prime Plus高效蛋白質純化系統,美國GE Healthcare Life Sciences公司;FD5-3T冷凍干燥機,GOLD-SIM公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海地瓜中的巖藻聚糖與硫酸軟骨素的制備

將新鮮海地瓜烘干、粉碎、酶解及分步醇沉[21],獲得沉淀即為粗多糖(含有色素、蛋白等雜質)。利用KTA Prime Plus蛋白純化系統,采用凝膠排阻色譜法(色譜柱:HiPrepTM26/60 Sephacryl S-500 column)進行多糖純化,所得2種海參多糖的純度由HPLC測定,色譜柱為凝膠柱TSKgel Super AW4000,流動相為0.2 mol/L的NaCl,流速0.5 mL/min,檢測器采用RID。

1.3.2 單因素實驗探究海地瓜中巖藻聚糖與硫酸軟骨素的分配行為

在25 ℃條件下,選擇質量分數為15%的PEG 8000與12.5%的鹽組成雙水相體系,分別進行巖藻聚糖、硫酸軟骨素2種多糖在雙水相體系中的分配行為的研究。制備上述體系,總質量共5 g,向其中加入0.5 g 2 g/L巖藻聚糖或硫酸軟骨素溶液,5 000 r/min離心5 min,靜置,將上下相分離并測量體積,采用次甲基藍法[22]檢測多糖質量濃度,計算相應參數。

固定條件:雙水相體系總質量為5 g,PEG的質量分數為15%,鹽的質量分數為12.5%,提取時間4 h,提取溫度25 ℃。分別考查鹽種類[檸檬酸鈉、K2CO3、Na2SO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、NaH2PO4]、PEG分子質量(2 000、4 000、6 000、10 000、20 000 Da)、pH值(6、7、8、9、9.3)、PEG的質量分數(10%、12.5%、15%、17.5%、20%)和鹽的質量分數(10%、12.5%、15%、17.5%、20%)5種因素對巖藻聚糖、硫酸軟骨素分配行為的影響。

1.3.3 巖藻聚糖與硫酸軟骨素質量濃度的測定

采用次甲基藍法[22]進行2種海地瓜多糖的濃度測定。分別移取0.02 mL質量濃度為0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.2 g/L的海地瓜巖藻聚糖溶液,加入0.18 mL次甲基藍溶液(0.18 g/L),混勻,測定560 nm處的吸光值,從而繪制巖藻聚糖的標準曲線。硫酸軟骨素標準曲線的繪制方式相同。計算多糖的分配系數及回收率。

巖藻聚糖分配系數Ka計算如公式(1)所示:

(1)

巖藻聚糖回收率Ya計算如公式(2)所示:

(2)

硫酸軟骨素分配系數Kb計算如公式(3)所示:

(3)

硫酸軟骨素回收率Yb計算如公式(4)所示:

(4)

式中:Ca,樣品巖藻聚糖的質量濃度,g/L;Cb,樣品硫酸軟骨素的質量濃度,g/L;Ka,巖藻聚糖分配系數;Kb,硫酸軟骨素分配系數;Ya,巖藻聚糖回收率,%;Yb,硫酸軟骨素回收率,%;VT,上相體積,mL;VB,下相體積,mL。

1.4 HPLC驗證雙水相體系對海地瓜粗多糖的分離效果

制備雙水相體系,PEG 6000和K2HPO4質量分數分別為15%、10%。將經酶解醇沉法制得的海地瓜粗多糖作為樣品,溶解后加入至上述雙水相體系中,進行海地瓜粗多糖的分離。分離雙水相體系的上下相,分別使用10 kDa超濾離心管進行超濾,以脫除PEG或K2HPO4,采用HPLC進行上、下相中多糖組分的測定,通過與標準品比對,確定最終海地瓜粗多糖的分離效果。

1.5 統計分析

試驗設計3個平行,實驗數據均表示為平均值±標準偏差。利用t檢驗進行顯著性分析,用Origin Pro 2019軟件作圖。利用P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 海地瓜中的巖藻聚糖及硫酸軟骨素的制備

按照1.3.1節中方法制得海地瓜中的巖藻聚糖及硫酸軟骨素,經HPLC檢測(圖1),結果顯示2種多糖組分皆為單一狹窄峰,峰形良好,表明2種多糖純度高,滿足后續實驗要求。

圖1 制備的海地瓜巖藻聚糖、硫酸軟骨素的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of Acaudina molpadioidessulfated fucan and chondroitin sulfate

2.2 鹽種類對多糖組分在雙水相體系中分配行為的影響

巖藻聚糖、硫酸軟骨素在6種鹽-PEG 8000的雙水相體系中的分配情況如圖2所示。巖藻聚糖主要分配在雙水相體系的上相,在PEG-K2HPO4體系的分配系數最高,為8.72±0.49(P<0.05)。不同鹽使得雙水相體系上下相體積比不同,巖藻聚糖回收率呈現不同規律,巖藻聚糖在PEG-NaH2PO4體系中的回收率為(83.16±1.92)%,與巖藻聚糖在PEG-檸檬酸鈉、PEG-K2CO3、PEG-K2HPO4三個體系中的回收率無顯著性差異,顯著高于剩余兩組(P<0.05)。從分配情況來看,巖藻聚糖在PEG-K2HPO4體系的分配效果最好。

硫酸軟骨素主要分配在雙水相體系下相,在各組雙水相體系中的回收率都在82%以上,分配效果良好。硫酸軟骨素在PEG-NaH2PO4體系中的分配系數最高,為7.33±0.41(P<0.05),在PEG-Na2SO4體系中的回收率最高,為(91.60±1.19)%。從整體來看,硫酸軟骨素在PEG-Na2SO4體系中分配效果最好。綜合2種多糖組分的分配行為,選定PEG-K2HPO4體系進行下一步實驗。

在PEG-鹽的雙水相體系中,疏水相互作用、靜電相互作用和雙水相表面張力可能是生物大分子在雙水相體系中受到的主要作用力[23]。2種多糖的分配行為是多種作用力共同作用的結果。巖藻聚糖、硫酸軟骨素均帶有負電荷,因結構存在差別,前者帶有電荷量大,受到靜電相互作用更強。巖藻聚糖主要分配在PEG富集相,硫酸軟骨素主要分配在鹽相。由此推測,靜電相互作用可能是巖藻聚糖的主要作用力,而硫酸軟骨素還受到其他更強的作用力可以抵消靜電相互作用而向體系下相移動。

2.3 PEG分子質量對多糖組分在雙水相體系中分配行為的影響

PEG分子質量的增加會導致其成相能力增強,從而影響其所在的雙水相體系中生物大分子的分配[24]。如圖3所示,PEG分子質量由2 000 Da增加至10 000 Da,巖藻聚糖的分配系數及回收率都隨之增加。PEG分子質量為10 000、20 000 Da的2個實驗組之間,巖藻聚糖的回收率無顯著性差異。巖藻聚糖在PEG的分子質量為10 000 Da時,分配效果最好。

a-分配系數;b-回收率

PEG分子質量由2 000 Da增加至20 000 Da,硫酸軟骨素的分配系數與回收率均呈現先增加后減小的趨勢;在PEG分子質量為6 000 Da時,分配系數及回收率達到最大。PEG分子質量過大會使得體系黏度過高,導致巖藻聚糖、硫酸軟骨素因在體系中轉移時受到的阻力過大而不能進行良好的分配。綜合2種多糖的分配行為,選擇PEG 6000進行后續實驗。

PEG分子質量的增加會導致PEG富集相中可容納其他大分子的空間減少,PEG組分對上相中存在的生物大分子具有排除體積效應[25]。從熵的角度看,生物分子更傾向于分配空間位阻較小的相[11]。巖藻聚糖更多地分配在體系的上相,表明巖藻聚糖受到的靜電相互作用可以抵消PEG的體積排除效應,被推動向上相移動。而硫酸軟骨素隨著PEG分子質量的增加在下相的分配系數增加,此時體積排阻效應為其在體系中受到的主要作用力。當PEG分子質量過大時,上相的黏度增加,硫酸軟骨素在體系中移動時阻力增加,從而導致分配系數降低。

2.4 pH對多糖組分在雙水相體系中分配行為的影響

pH會影響生物大分子和離子組成的電荷,以及污染物質的表面特征,導致它們在雙水相體系中的分配行為發生變化[26]。如圖4所示,在pH值為6、7、8、9、9.3(未調節pH實驗組)的5個實驗組中,隨著體系pH增加,巖藻聚糖的分配系數增加,回收率先降低后增加。整體來看,未調節pH時,PEG-K2HPO4在雙水相體系中分配效果最好。硫酸軟骨素在不同pH實驗組的分配效果相當,在上相的濃度接近于0,回收率接近100%。因此,不對體系pH值作出調整。

圖4 pH值對巖藻聚糖在PEG-K2HPO4雙水相體系中的分配系數及回收率的影響Fig.4 Effect of pH on the partition coefficient and recovery rate of sulfated fucan in PEG-K2HPO4 aqueous two-phase system

巖藻聚糖、硫酸軟骨素的分配行為是多種作用力共同作用的結果。2種多糖的分配行為表明,巖藻聚糖受到更大的作用力,推動其向上相富集,硫酸軟骨素受到的主要作用力推動其向下相富集。由此推測,pH的改變可能會影響體系中鹽離子產生的電勢,使得巖藻聚糖在體系中受到的靜電相互作用力增強,更多的巖藻聚糖分配在體系上相;硫酸軟骨素受到的靜電相互作用力亦增強,但未能抵消其在體系中受到的體積排除效應。

2.5 PEG質量分數對多糖組分在雙水相體系中分配行為的影響

PEG質量分數的改變會使雙水相體系的構成改變,從而影響多糖的分配情況。如圖5所示,隨著PEG質量分數自10%增加至20%,巖藻聚糖的分配系數和回收率均呈現先增加后降低后趨于平穩的結果;在PEG質量分數為15%時,巖藻聚糖分配效果最好。

圖5 PEG質量分數對巖藻聚糖在PEG-K2HPO4雙水相體系中的分配系數與回收率的影響Fig.5 Effect of PEG concentration on the partition coefficient and recovery rate of sulfated fucan in PEG-K2HPO4 aqueous two-phase system

在各實驗組中,硫酸軟骨素在上相的濃度接近零,分配效果良好。表明PEG質量分數的增加,未改變硫酸軟骨素在體系中受到的主要作用力和分配行為。因此,選擇PEG 6000的質量分數為15%作為最佳條件。

2.6 K2HPO4質量分數對多糖組分在雙水相體系中分配行為的影響

如圖6所示,隨著K2HPO4質量分數由10%增加至25%,巖藻聚糖的分配系數整體呈增加趨勢,回收率整體呈降低的趨勢,在K2HPO4質量分數為10%時,巖藻聚糖的分配效果最佳,此時回收率最高,測定為(86.92±0.97)%。

圖6 K2HPO4質量分數對巖藻聚糖在PEG-K2HPO4雙水相體系中的分配系數與回收率的影響Fig.6 Effect of K2HPO4 concentration on the partition coefficient and recovery rate of sulfated fucan in PEG-K2HPO4 aqueous two-phase system

硫酸軟骨素在各實驗組中回收率均大于95%,其在上相的濃度均接近零,具有較好的分配效果。當K2HPO4的質量分數為10%時,硫酸軟骨素的分配系數為16.53,回收率測定為(106.47±1.84)%。總體來看,K2HPO4質量分數在10%時,2種海地瓜多糖組分在體系中有最好的分離效果。

巖藻聚糖回收率整體呈降低的趨勢,可能是由于鹽濃度的增加使其產生的電勢發生了改變,導致多糖在體系中受到的靜電相互作用發生改變;同時上相體積減小,PEG對多糖的體積排除效應增強。硫酸軟骨素主要分配在體系下相中,鹽濃度的改變不會顯著的影響其分配行為。

2.7 優化后雙水相體系的分離效果評價

制備雙水相體系,PEG 6000和K2HPO4質量分數分別為15%、10%。海地瓜粗多糖經此雙水相體系的分離,采用HPLC檢測上、下相中的樣品,結果如圖7所示。上下相中都僅含有1個樣品峰,根據出峰時間可以確定上相中僅有海地瓜巖藻聚糖,下相中僅含有海地瓜硫酸軟骨素。該結果表明最終設計的雙水相體系可以有效的分離海地瓜中的巖藻聚糖與硫酸軟骨素。

a-上相;b-下相

與目前常用的海參多糖的純化方法相比,本實驗建立的雙水相分離方法具有以下優點:其一,無需大型儀器設備,操作簡單,省時省力;其二,選擇性強,對海參多糖具有較好的分離效果;其三,條件溫和,易于工業放大。上述試驗結果可為海參多糖的分離純化提供參考,具有一定的理論研究及工業應用價值。

3 結論

本研究探明了海地瓜巖藻聚糖與硫酸軟骨素在雙水相體系中的分配行為,確定PEG 6000-K2HPO4雙水相體系為分離上述2個組分的最優體系,具體條件為:PEG 6000質量分數為15%,K2HPO4質量分數為10%。在該體系中,硫酸軟骨素主要分配于下相,分配系數為16.53,回收率測定為(106.47±1.84)%;巖藻聚糖主要分配在上相,分配系數為6.36,回收率測定為(86.92±0.97)%。本方法分離效果良好且簡便快捷,有助于海參多糖與低值海參資源的開發。