海黃牡丹不同部位的成分分析、體外抗氧化能力及其α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制能力

代嫚婷,宋靜,余瀟,張平芳,平懷磊,劉子榕,王娟,王振興

1(西南林業大學 園林園藝學院,云南 昆明,650224)2(西南林業大學 林學院,云南 昆明,650224)3(西南林業大學 綠色發展研究院,云南 昆明,650224)4(西南林業大學 生命科學學院,云南 昆明,650224)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(section Moutan DC)的多年生木本花卉,其種類繁多,花型顏色各異,有“花中之王”與“國花”美譽[1]。牡丹除可作為觀賞植物之外,還具有很高的食用價值,可用于制酒、面點輔料、焙烤食品、泡茶,如牡丹花營養酒、牡丹花鮮花餅、牡丹花茶等[2-4]。研究表明,牡丹花除了含有豐富的碳水化合物、蛋白質、脂肪、礦物質元素和維生素外,還含有多種人體所需的游離氨基酸,且含量較高,是一種極具營養價值的食品資源[5]。

牡丹中含有豐富的黃酮、酚類物質等生物活性成分,具有抗氧化、降血脂、抗炎、抑菌等功能活性。陳慶敏等[6]以牡丹雄蕊為材料,研究發現70%(體積分數)的甲醇提取物具有良好DPPH自由基清除能力,其主要酚類成分為沒食子酸、蘆丁、槲皮素;關寧寧[7]研究表明,高含量的牡丹花蕊醇提物具有很強的還原力和·OH清除能力,且對糖尿病小鼠的血糖指數有顯著改善作用;董振興等[8]研究表明,牡丹籽油可顯著降低高脂血癥大鼠的血脂水平,同時具有降低糖尿病小鼠血糖、改善正常小鼠糖耐量的作用。隨著社會的發展,人們的生活水平顯著提高,抗氧化、降血脂等功能食品也越來越引起重視。牡丹在抗氧化、降血脂等方面有較好的作用,對其活性成分進行開發利用,可拓展功能性食品種類,具有良好的市場開發前景。

海黃(Paeoniasuffruticosa‘Hai Huang’)是觀賞牡丹的一個品種,孫澤飛[9]研究表明,海黃牡丹花瓣含有豐富的多酚成分,其含量僅次于紫紅色花系,且有較高的抗氧化活性。目前,關于海黃牡丹的研究大多集中在栽培育種[10]、品種間差異比較[11]、遠緣雜交鑒定[12]等方面,而對于海黃牡丹的活性成分研究較少,且對海黃牡丹不同部位的活性研究未見報道。因此,本研究以海黃牡丹的4個部位(花瓣、花萼、雌蕊、雄蕊)為研究對象,對其功能活性和化學組成進行研究,從而為提高海黃牡丹的利用水平、拓展新型功能食品種類提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海黃牡丹:于2021年4月8日采集自云南省玉溪市梁王山種植資源收集圃(東經102°53′55″,北緯24°45′38″,海拔2 733 m),并置于4 ℃冰箱中保存備用。

CH3OH、NaNO2、Al(NO3)3、FeCl3、CH3COOH、CH3COONa、Na2SO3、抗壞血酸(維生素C)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,pNPG)、DPPH、ABTS、阿卡波糖等均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;2, 4, 6-三(2-吡啶基)三嗪(2, 4, 6-tripyridin-2-yl-1, 3, 5-triazine,TPTZ),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蘆丁(純度≥98%)、沒食子酸(純度≥99%)、木犀草素(純度≥98%)、異鼠李素(純度≥98%)、芹菜素(純度≥98%)、對香豆酸(純度≥98%)、表兒茶素沒食子酸酯(純度≥98%),上海源葉生物科技有限公司;α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶,均為分析純,北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GZX-9240MB電熱鼓風干燥箱,上海博迅實業有限公司;200T高速多功能粉碎機,永康市鉑歐五金制品有限公司;FVYANG超聲波清洗機,深圳福洋科技集團有限公司;S1010E離心機,Hitachi Koki公司;N-1200B旋轉蒸發儀,上海泉杰儀器有限公司;AX224ZH電子天平,奧豪斯儀器有限公司;FD304箱式真空冷凍干燥機,濟南駿德儀器有限公司;1260 Infinity II高效液相色譜儀,Agilent Technologies;TECAN infinite 200 PRO多功能酶標儀,上海迪奧生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

將海黃牡丹的花瓣、花萼、雌蕊、雄蕊這4個部位分別剝離,置于50 ℃恒溫箱中烘干至恒重。將其粉碎后過60目篩。準確稱取4個部位的粉末各10 g,按料液比1∶25(g∶mL)的比例加入體積分數為70%的甲醇溶液(含體積分數為1%的甲酸),避光過夜,超聲波提取1 h后,4 000 r/min離心15 min,收集濾液,濾渣再加入體積分數為70%的甲醇溶液(含體積分數為1%的甲酸)超聲波提取,離心,重復提取2次,合并濾液,抽濾2次。用旋轉蒸發儀50 ℃條件下真空旋干,樣品冷凍干燥后置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 總酚含量的測定

參考THAVAMONEY等[13]的方法測定總酚含量。在室溫下,取20 μL沒食子酸或合適質量濃度的樣品加入到96孔酶標板,加入20 μL 0.5 mol/L福林酚溶液,混合5 min后,加入160 μL 0.075 g/mL的Na2CO3溶液,對照組此時加入同體積的蒸餾水,避光反應25 min,然后在765 nm下測定吸光度Ai,在相同條件下測定10、20、30、40、50、60 μg/mL的沒食子酸吸光度,以沒食子酸質量濃度為橫坐標,以吸光值Ai為縱坐標,繪制標準曲線,得到標準方程Y=0.006 6X-0.005 5(R2=0.994),其中X為質量濃度,Y為吸光值。所有試驗重復3次,計算總酚含量,以沒食子酸當量表示(mgGAE/g)。

1.2.3 總黃酮含量測定

參考HUANG等[14]的方法測定總黃酮含量。在室溫條件下,取40 μL蘆丁或稀釋到合適質量濃度的樣品加入96孔酶標板,然后加入20 μL 0.03 g/mL的NaNO2溶液,室溫下放置6 min后加入20 μL 0.06 g/mL的Al(NO3)3溶液,室溫下反應6 min后加入140 μL 0.04 g/mL的NaOH溶液和60 μL體積分數為70%甲醇溶液,放置15 min后在510 nm下測定吸光度。其中,對照組分別在上述步驟中加入同體積的70%(體積分數)甲醇溶液代替NaNO2溶液和Al(NO3)3溶液。在相同條件下測定0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg/mL的蘆丁吸光度,以蘆丁質量濃度(X)為橫坐標,以吸光值(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,得到標準方程Y=0.000 8X+0.033 9(R2=0.991)。所有試驗重復3次,計算總黃酮含量,以蘆丁當量表示(mg RT/g)。

1.2.4 高效液相色譜分析

海黃牡丹4個部位的濾液各取2 mL通過針頭過濾器(0.45 μm)過濾后進行HPLC分析。色譜柱:Eclipse plus C18 column(4.6 mm×150 mm,5 μm);洗脫劑:乙腈(C)和體積分數為0.1%的甲酸水溶液(D);檢測波長280 nm;流速0.8 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量10 μL;紫外吸收掃描波長范圍為200～600 nm。其中,洗脫梯度為:0～5 min,5%～5% C;5～10 min,5%～10% C;10～20 min,10%～10% C;20～40 min,10%～20% C;40～80 min,20%～30% C。

標準品溶液制備和測定:精確稱取木犀草素、異鼠李素、芹菜素、對香豆酸、表兒茶素沒食子酸酯標準品,用色譜甲醇配制成0.1 mg/mL的混合標準品儲備液。分別吸取上述標準品溶液1、5、10、15、20 μL,注入高效液相色譜儀中,以峰面積(Y)對其進樣量(X)進行線性回歸,并根據標準曲線方程進行該物質的定量定性分析。其各種標準品的回歸方程分別為:異鼠李素Y=67.261X+13.301(R2=0.997);木犀草素Y=407.73X-26.306(R2=1.000);芹菜素Y=288.25X-20.415(R2=1.000);對香豆酸Y=551.57X-15.99(R2=1.000);表兒茶素沒食子酸酯Y=143.7X+115.57(R2=0.984)。

1.2.5 DPPH自由基清除能力

參考陳蓬鳳等[15]的方法,在室溫條件下,取100 μL標準品和用體積分數為70%甲醇溶液稀釋到合適質量濃度的樣品加入96孔酶標板,加入100 μL 0.15 mmol/L DPPH溶液充分混合,在室溫下避光反應30 min后在517 nm處測定其吸光度值(As),以體積分數為70%的甲醇溶液代替樣品的反應為空白(Ac),以體積分數為70%的甲醇溶液代替DPPH溶液的反應為樣品空白(Ab),采用兩倍稀釋法進行實驗,以維生素C和BHT為陽性對照,所有試驗重復3次,按公式(1)計算樣品中DPPH自由基清除率。

(1)

采用Origin 2018軟件計算樣品清除DPPH自由基的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)/(μg/mL),結果用IC50值表示。

1.2.6 ABTS陽離子自由基清除能力

參考SAREGA等[16]的方法,稱取38.4 mg ABTS和6.623 mg K2S2O8混合,蒸餾水溶解后并定容至10 mL配成ABTS母液。室溫避光反應12～16 h后用PBS稀釋ABTS母液至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02左右。在室溫條件下,取50 μL標準品和用體積分數70%甲醇稀釋到合適濃度的樣品加入96孔酶標板,加入200 μL ABTS溶液充分混合,在室溫下避光反應6 min后在734 nm處測定其吸光值(As);以體積分數為70%的甲醇溶液代替樣品的反應為空白(Ac);以體積分數為70%的甲醇溶液代替ABTS溶液的反應為樣品空白(Ab),采用兩倍稀釋法,以維生素C和BHT為陽性對照,所有試驗重復3次,按公式(1)計算樣品 ABTS陽離子自由基清除率,結果用IC50值表示。

1.2.7 鐵還原能力

參考龔宇等[17]的方法,并適當修改。按照體積比10∶1∶1的比例將30 mmol/L CH3COONa緩沖液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液混合配制鐵離子還原力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)溶液。在室溫條件下,取30 μL標準品和用體積分數70%甲醇稀釋到合適質量濃度的樣品加入96孔酶標板,然后加入240 μL FRAP溶液,充分混合,在37 ℃避光反應10 min后在593 nm處測定吸光度值(As)。以體積分數為70%的甲醇溶液代替樣品的反應為空白(Ac),以體積分數為70%的甲醇溶液代替FRAP溶液的反應為樣品空白(Ab),以維生素C和BHT為陽性對照。以不同質量濃度(0～100 μg/mL)的FeSO4溶液作為標準品繪制標準曲線,得到標準方程Y=0.006 6X-0.005 5(R2=0.999),其中X為質量濃度,Y為吸光值。所有試驗重復3次,以此計算樣品的FeSO4水溶液的當量,表示樣品的鐵還原能力。

1.2.8 α-葡萄糖苷酶抑制能力的測定

參考WANG等[18]的方法,在室溫條件下,取50 μL標準品和用體積分數70%甲醇稀釋到合適質量濃度的樣品加入96孔酶標板,加入25 μL α-葡萄糖苷酶溶液,將酶標板置于托盤內于水浴鍋中進行37 ℃恒溫反應10 min后,加入50 μLpNPG溶液充分混勻,繼續反應15 min后加入100 μL Na2CO3溶液終止反應。立即在405 nm下測定吸光值(As),以體積分數70%的甲醇溶液代替樣品的反應為空白(Ac),以體積分數為70%的甲醇溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液的反應為樣品空白(Ab),采用兩倍稀釋法進行實驗,以阿卡波糖為陽性對照,所有試驗重復3次,按公式(2)計算樣品中α-葡萄糖苷酶抑制能力:

(2)

1.2.9 α-淀粉酶抑制能力

參考張兆遠等[19]的方法,稱取2.1 g NaOH和18.2 g酒石酸鉀鈉溶于蒸餾水中,然后加入0.63 g DNS于45 ℃加熱溶解,冷卻后加入0.5 g苯酚和0.5 g Na2SO3,完全溶解后用蒸餾水定容至100 mL,配制DNS溶液。用20 μmol/L,pH 6.9 PBS稀釋α-淀粉酶至540 nm波長處吸光度為0.9～1.0。取20 μL用體積分數70%甲醇稀釋到合適質量濃度的樣品加入96孔酶標板,然后加入20 μL α-淀粉酶溶液,25 ℃反應10 min后,加入100 μL 2.5 mg/mL糊化后的淀粉溶液充分混勻,繼續反應10 min,加入20 μL DNS溶液,將酶標板置于托盤內于水浴鍋中進行沸水浴10 min,冷卻至室溫,最后加入110 μL蒸餾水,在540 nm下測定吸光度值,以阿卡波糖為對照,所有試驗重復3次,結果用抑制率表示。按公式(2)計算樣品α-淀粉酶抑制能力。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析,采用Origin 2018 繪圖軟件繪圖。P<0.05則認為樣品間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 海黃牡丹不同部位的成分分析

2.1.1 總酚、總黃酮分析

研究表明,海黃牡丹中含有豐富的總酚、黃酮類等活性物質,具有抗氧化、抗菌等多種生物活性作用[20]。由表1可知,海黃牡丹中的總酚、總黃酮含量以及提取物得率在4個不同部位間存在顯著性差異(P<0.05)。4個不同部位提取物的總酚含量依次為雌蕊>花萼>花瓣>雄蕊,總黃酮含量依次為雌蕊>花萼>花瓣>雄蕊。結果顯示,兩者含量在不同部位的變化趨勢相同,且總酚含量明顯高于總黃酮含量,這與苗永美等[21]研究石豆蘭中總酚、總黃酮含量的結果相一致。

表1 海黃牡丹不同部位提取物中總酚和總黃酮含量Table 1 Contents of total phenols and flavonoids in extracts from different parts of peony Hai Huang

2.1.2 HPLC分析

牡丹花作為新食品原料,營養豐富,富含多酚黃酮類活性物質,具有顯著的生理活性,廣泛應用于食品、飲料及化工行業[22]。研究表明,牡丹花中主要含有木犀草素、異鼠李素、芹菜素、對香豆酸和表兒茶素沒食子酸酯等活性成分[23-24],故以其為代表性物質對海黃牡丹不同部位的活性成分分布進行檢測。標準物質和海黃牡丹的HPLC圖如圖1所示。混合標準對照物被完全分開,無重疊現象,可用于海黃牡丹不同部位提取物中的化合物檢測。

a-對照品;b-花瓣;c-花萼;d-雌蕊;e-雄蕊

如表2所示,同一化合物含量在不同部位的差異顯著(P<0.05);在定量的5個多酚化合物中,花瓣部位檢測到全部5種多酚,種類最多,雄蕊部位芹菜素和異鼠李素含量最高(P<0.05)。在海黃牡丹檢測出的這些化合物中,木犀草素、芹菜素屬于黃酮類,異鼠李素屬于黃酮醇類,表兒茶素沒食子酸酯屬于黃烷醇,對香豆酸屬于簡單酚類,這些物質均具有一定的抗氧化、抗炎、降血脂、保護心血管等生物活性[25-26]。

表2 海黃牡丹4個部位提取物中5種多酚成分含量Table 2 Contents of five polyphenols in extracts from four parts of peony Hai Huang

2.2 海黃牡丹不同部位的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種很穩定以氮為中心的自由基,可用于反映樣品抗氧化能力強弱[27]。如圖2-a所示,樣品質量濃度為0～500 μg/mL時,不同部位的提取物均具有一定的DPPH自由基清除能力,且DPPH自由基清除能力均隨樣品質量濃度的遞增而增加。由圖2-b可知,各部位清除DPPH自由基的IC50值依次為維生素C(16.38 μg/mL)>花萼(27.87 μg/mL)>BHT(32.96 μg/mL)>花瓣(44.97 μg/mL)>雌蕊(74.83 μg/mL)>雄蕊(152.92 μg/mL),說明海黃牡丹的花萼部位具有最強的DPPH自由基清除能力,與維生素C較為接近,高于BHT,且強于其他部位。這可能與表2中花萼含有高含量的木犀草素有關,鄭必勝等[28]研究表明,金銀花中的綠原酸、木犀草苷、木犀草素3種活性成分中,木犀草素的抗氧化能力最強。單恬恬等[29]的研究也發現,香辛料提取物中黃酮、多酚含量與其抗氧化活性具有一定的相關性,而DPPH自由基清除能力與黃酮含量最為相關。

a-DPPH自由基清除率;b-IC50值

2.2.2 ABTS陽離子自由基清除能力

由圖3-a可知,在樣品質量濃度范圍(0～500 μg/mL)內,海黃牡丹的4個部位對ABTS陽離子自由基的清除率隨樣品質量濃度的增大而增大,且當清除能力低于80%時,樣品的ABTS陽離子自由基清除能力表現出明顯的量效關系。由圖3-b可知,各組分清除ABTS陽離子自由基能力的IC50值依次為維生素C(21.40 μg/mL)>BHT(36.37 μg/mL)>花萼(74.44 μg/mL)>雄蕊(82.42 μg/mL)>雌蕊(102.48 μg/mL)>花瓣(152.35 μg/mL)。結果顯示,各醇提取物均具有一定的ABTS陽離子自由基清除能力,其中花萼部位提取物能力最強,但與陽性對照維生素C和BHT比較仍有一定差距。因此可考慮將其開發為一種安全的天然可食用抗氧化劑。

a-ABTS陽離子自由基清除率;b-IC50值

2.2.3 鐵還原能力

樣品溶液中的還原劑在酸性環境下,會將TPTZ與Fe3+的復合物還原成Fe2+而呈明顯的藍色,在波長593 nm處有最大吸收,其值越大,則表示樣品的鐵還原能力越強。由圖4可知,海黃牡丹不同部位提取物的鐵還原能力依次為雌蕊(691.46 mg FeSO4/g)>花萼(504.41 mg FeSO4/g)>雄蕊(321.41 mg FeSO4/g)>花瓣(318.53 mg FeSO4/g)。4個部位均表現出一定的鐵還原能力,但均弱于維生素C和BHT。其中,雌蕊部位醇提取物的鐵還原力最強(P<0.05),花萼部位的醇提取物次之,這與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力的結果不同的原因是,雌蕊含有高含量的木犀草素、表兒茶素沒食子酸酯,使其還原能力增加。

圖4 海黃牡丹4個部位的總還原能力Fig.4 Total reduction capacity of four parts of peony Hai Huang

2.3 海黃牡丹不同部位的酶抑制能力分析

2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶將低聚糖或二糖水解為可吸收的單糖,從而促進人體對碳水化合物的吸收。當其活性被抑制時,能有效降低人體對碳水化合物的消化速率,從而達到降低人體餐后、空腹血糖的目的[30],因此尋找天然高效、無毒副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑一直是糖尿病學上的研究課題。由圖5可知,海黃牡丹4個部位的醇提取物均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,且在一定質量濃度范圍(0～500 μg/mL)內,α-葡萄糖苷酶抑制率隨樣品質量濃度的增大而增強,呈現一定的量效關系。當樣品質量濃度達到500 μg/mL時,花瓣對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最強,但低于陽性對照阿卡波糖,而花萼、雌蕊和雄蕊3個部位差別不明顯。花瓣部位的醇提取物對α-淀粉酶的抑制效果雖弱于阿卡波糖,但強于其他藥用部位,其原因可能是花瓣含有較豐富的表兒茶素沒食子酸酯,具有較好的降血糖能力[31]。同時,SONG等[32]的研究也表明,黃色牡丹花瓣提取物具有最強的α-葡萄糖苷酶的抑制能力。該結果為海黃花瓣作為α-葡萄糖苷酶抑制劑資源和降血糖功能食品的開發提供了科學依據,但具體成分和作用機制需要進一步研究。

圖5 海黃牡丹4個部位對α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.5 α-Glucosidase inhibition ability of four parts of peony Hai Huang

2.3.2 α-淀粉酶抑制活性

抑制α-淀粉酶的活性能有效阻止食物中碳水化合物在機體內的消化和水解,從而減少糖分的攝入,控制血糖升高。王俊朋等[33]研究表明,牡丹花黃酮對α-淀粉酶活性具有顯著抑制作用,在開發降血糖藥物或功能性食品方面具有很大的潛力。由圖6可知,海黃牡丹4個部位的醇提取物具有較好的α-淀粉酶抑制活性,花萼、雌蕊、雄蕊對α-淀粉酶的抑制作用強于陽性對照阿卡波糖,且在實驗質量濃度范圍(15.62～156.25 μg/mL)內,雄蕊對于α-淀粉酶的抑制作用較好,花瓣的抑制作用最差。雄蕊的醇提取物對α-淀粉酶的抑制效果強于其他藥用部位,其原因可能與表2中雄蕊含有較高的芹菜素(黃酮類)有關。LI等[34]研究表明芹菜素可通過調節PI3K/Akt信號通路來降低細胞黏附分子的表達, 從而緩解內皮細胞中由免疫細胞滲透增強及炎癥級聯反應引發的心血管疾病,具有降血糖作用。WANG等[35]的研究結果表明,芹菜素可以減輕鏈脲佐菌素誘導的胰島β細胞的氧化損傷,并可能成為治療糖尿病的新藥物。

圖6 海黃牡丹4個部位對α-淀粉酶的抑制效果Fig.6 α-Amylase inhibition ability of four parts of peony Hai Huang

3 結論

本研究對海黃牡丹花瓣、花萼、雌蕊、雄蕊部位提取物中的總酚、總黃酮含量及其活性物質分布情況進行了檢測,并比較了其抗氧化活性以及對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力。結果表明,雌蕊、花萼提取物中的總酚和總黃酮含量顯著高于其他2個部位,花萼部位有較強的DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力,其IC50值分別為44.97和74.44 μg/mL,雌蕊部位的鐵還原能力最強,其值為691.46 mg FeSO4/g。HPLC結果顯示,同一化合物成分含量在不同部位差異顯著,花瓣部位檢測到的多酚種類最多,雄蕊部位芹菜素和異鼠李素含量最高(P<0.05)。花瓣對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制作用,而雄蕊則對α-淀粉酶的抑制能力最強,強于陽性對照阿卡波糖。研究表明,花萼、雌蕊部位可作為天然抗氧化劑資源進行開發利用,同時花瓣與雄蕊對治療糖尿病具有一定的潛力。后續可進一步進行有效活性成分與藥用價值之間的關系分析,為海黃牡丹資源的綜合利用提供新思路。