氨基脫氧分支酸合成酶對谷氨酸棒桿菌生長和產L-絲氨酸的影響

劉安倩,顏文斌,肖文翰,張曉梅*,史勁松,許正宏

1(江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫,214112)2(宜興市食品與生物技術研究院,江蘇 無錫,214122)3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214112)4(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇 無錫,214122)

L-絲氨酸被廣泛應用于醫藥、食品及化妝品等領域。目前,全球L-絲氨酸需求量約為3 000 t,市場價格約為20萬元/t[1-4]。L-絲氨酸也是世界氨基酸行業中工業化生產難度較大的氨基酸。目前國內多采用蛋白水解法工業化生產,該方法引起的環境污染問題不容忽視[5]。微生物利用廉價的糖質原料發酵生產L-絲氨酸正成為研究熱點[6]。

目前微生物發酵法生產L-絲氨酸的研究主要集中于谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌[1-6]。MUNDHADA等[7-8]將大腸桿菌進行代謝改造及適應性進化,經補料分批發酵,L-絲氨酸的產量達到50 g/L。谷氨酸棒桿菌是FDA認可生產食品及藥品的安全菌株[9-10],L-絲氨酸在谷氨酸棒桿菌中的代謝涉及3個合成途徑關鍵酶和2個降解途徑關鍵酶[11],即甘油酸脫氫酶(PGDH,編碼基因serA)、磷酸絲氨酸氨基轉移酶(PSAT,編碼基因serC)和磷酸絲氨酸磷酸化酶(PSP,編碼基因serB)[8];絲氨酸脫氫酶(SerDH,編碼基因sdaA)及絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT,編碼基因glyA)[12]。目前對L-絲氨酸重組菌株的構建集中于合成途徑關鍵酶的加強表達與降解途徑關鍵酶的敲除,同時研究也發現降解途徑關鍵酶SHMT對L-絲氨酸產量影響最為重要[3,12],而在谷氨酸棒桿菌中敲除SHMT會導致菌株無法生長。德國PETERS-WENDISCH研究發現,在L-絲氨酸合成過程中,四氫葉酸(tetrahydrogen folic acid,THFA)是SHMT的輔酶,pabAB編碼的氨基脫氧分支酸合成酶(aminodeoxychorismate synthase,ADC synthase)是葉酸合成途徑的關鍵酶,他們通過敲除pabAB減少輔酶構建了重組菌,但是該重組菌為葉酸缺陷型,在添加0.1 mmol/L葉酸時L-絲氨酸的產量為8.51 g/L,在20 L發酵罐L-絲氨酸的最終產量為36.26 g/L[3-4]。本課題組以1株能夠直接利用糖發酵生產L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌SSAAI為出發菌株[13],通過常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變得到高產突變菌株A36[14],對出發菌株SSAAI和突變菌株A36進行全基因組測序及比較基因組學分析,發現高產菌株A36中葉酸代謝途徑關鍵酶氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位發生突變(T426I),而氨基脫氧分支酸合成酶基因突變對酶活力、菌株生長及產L-絲氨酸影響尚未見報道。

本文在以谷氨酸棒桿菌SSAAI及其誘變菌株A36作為研究對象,根據誘變前后基因測序的結果對SSAAI中氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位進行定點突變(T426I),構建突變重組菌Kp,通過酶活力及發酵實驗評價pabAB基因點突變對酶活力、菌株生長和產L-絲氨酸的影響。同時采用不同強度啟動子替換高產菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的啟動子,考察調控氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力對菌株生長和產L-絲氨酸的影響,為進一步構建L-絲氨酸高產菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和引物

產L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌SSAAI與突變菌株A36為本實驗室前期構建保藏[15-17],敲除質粒pK18 mobsacB和大腸桿菌JM109為本實驗室保藏。本文所用引物如表1,所用菌株與質粒如表2所示。所用重組酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司,膠回收和質粒提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。限制性內切酶EcoR I,XbaI,NdeI,BamH I和BglII購于TaKaRa公司。

表1 本文使用的引物Table 1 Primers used in this paper

表2 本文使用的菌株與質粒Table 2 Strains and plasmids used in this paper

1.2 培養基及培養方法

(1)種子固體培養基(g/L):腦心浸液(brain heart infusion,BHI) 37,葡萄糖20,(NH4)2SO410,K2HPO40.2,NaH2PO40.3,MgSO4·7H2O 0.5,瓊脂粉20。

(2)種子液體培養基(g/L):BHI 37,葡萄糖20,(NH4)2SO410,K2HPO40.2,NaH2PO40.3,MgSO4·7H2O 0.5;裝液量20 mL/250 mL三角瓶。

(3)發酵培養基(g/L):蔗糖100,(NH4)2SO430,KH2PO43,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.02,MnSO4·H2O 0.02,原兒茶酸(PCA) 0.03,生物素5×10-5,維生素B14.5×10-4,CaCO360。

(4)培養方法:挑取種子接種至種子液體培養基中,于30 ℃,120 r/min往復式搖床培養至對數生長期,接種至發酵培養基中,裝液量為25 mL/250 mL三角瓶,初始OD562值約為1,于30 ℃,120 r/min往復式搖床培養120 h,每隔12 h取樣測定生物量及L-絲氨酸產量。

1.3 pabAB基因定點突變質粒構建

以菌株A36的基因組為模板,選擇pabAB基因點突變前500 bp和后500 bp為擴增目標,利用引物pabAB-F、pabAB-R擴增含點突變的同源臂基因片段。通過單片段同源重組酶將含同源臂的目的片段與經EcoRI和XbaI雙酶切的質粒pK18 mobsacB連接,構建定點突變質粒。

1.4 替換啟動子質粒的構建

以替換pabAB啟動子為Pkan為例,采用質粒pK18 mobsacB,以A36的基因組為模板,分別利用pK-18-Pkan-1/2,pK-18-Pkan-3/4(引物上設計替換啟動子序列)分別擴增除去pabAB啟動子的上下游同源臂片段,片段與酶切過的質粒回收方法具體見試劑盒說明書,回收得到的上下游同源片段用多片段同源重組酶與經EcoR I和XbaI雙酶切的質粒pK18 mobsacB連接得到重組質粒。

1.5 氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力測定

總蛋白濃度的測定:參照碧云天的Bradford蛋白濃度測定試劑盒所示方法,對蛋白標準品進行測定,繪制標準曲線。蛋白濃度與OD曲線方程為y=0.575 2x+0.461,R2=0.996 1。

氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力測定:采用科晶生物科技有限公司氨基脫氧分支酸合成酶ELISA試劑盒進行酶活力測定,酶活力與OD曲線方程為y=0.101 3x-0.005 3,R2=0.998。菌液于4 ℃,12 000 r/min離心10 min,用0.9%的生理鹽水清洗3～4次,除去培養基,稱取菌體約0.25 g,用5 mL 0.9%的生理鹽水充分懸浮菌體,使用超聲波破碎約30 min,4 ℃,12 000 r/min離心10 min,棄去沉淀取上清液,將上清液稀釋一定倍數,采用Synergy H4多功能酶標儀測定OD450值,利用標準曲線換算得到對應的酶活力。

1.6 分析方法

生物量的測定:采用1 mol/L的鹽酸稀釋發酵液至適當濃度,然后利用紫外分光光度計于562 nm處測定OD562值作為生物量。

L-絲氨酸的測定:采用HPLC測定樣品中L-絲氨酸的含量[16]。

2 結果與分析

2.1 氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB突變菌株的構建

以谷氨酸棒桿菌SSAAI及其誘變菌株A36作為研究對象,根據誘變前后基因測序的結果對SSAAI中氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位進行定點突變(T426I),構建突變重組菌Kp。即以菌株A36基因組為模板,利用相應引物進行PCR擴增相應基因片段pabAB,擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳驗證;將線性化的pK18 mobsacB質粒連接pabAB基因片段構建重組質粒,轉化大腸桿菌JM109感受態細胞;提取質粒進行瓊脂糖凝膠電泳驗證,并將擴增片段進行測序驗證,驗證正確的質粒轉化谷氨酸棒桿菌SSAAI,電泳驗證結果如圖1所示,經過測序比對,成功獲得pabAB突變株,將其命名為Kp。

M-Marker;1-pabAB PCR片段

菌株A36是本課題組前期對出發菌株SSAAI進行ARTP誘變結合高通量篩選得到的高產突變株,其生物量和L-絲氨酸產量比出發菌株SSAAI均有提高[13-14]。本課題組通過對突變菌株A36與出發菌株SSAAI進行全基因組測序及比較基因組學分析,發現誘變菌株A36中有11個基因發生非同義突變,分別為假定的轉座酶編碼基因K07497、UPF0176和K07146,腺苷琥珀酸裂解酶編碼基因purB,假定的ABC轉運蛋白編碼基因ABC.CD.P,內膜轉運蛋白編碼基因rhtA,酪氨酸轉運蛋白編碼基因tyrP,DNA氧化脫甲基酶編碼基因alkB,ATP結合蛋白編碼基因cydC,脂肪酸合酶編碼基因fas,葉酰聚谷氨酸合酶編碼基因folC以及氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB[7]。其中pabAB編碼的氨基脫氧分支酸合成酶是葉酸合成途徑的關鍵酶,其與L-絲氨酸降解密切相關,PETERS-WENDISCH通過敲除pabAB構建的重組菌L-絲氨酸的產量有顯著提高[3-4],而氨基脫氧分支酸合成酶基因突變對酶活力、菌株生長及產L-絲氨酸的影響有待進一步研究。

2.2 pabAB基因點突變對其酶活力的影響

出發菌株SSAAI及其突變株Kp在發酵60 h(對數生長期)和120 h(發酵結束)時氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力如圖2所示。從圖2-a可以看出,在60 h時,出發菌株SSAAI與pabAB突變株Kp的比酶活力分別為1.45和1.23 U/g,突變株Kp的比酶活比SSAAI下降15.2%。從圖2-b可以看出,在120 h時,出發菌株SSAAI與定點突變株Kp的比酶活力分別為0.59和0.51 U/g,定點突變后氨基脫氧分支酸合成酶的比酶活下降13.6%;說明pabAB基因426位的點突變(T426I)導致其酶活力下降。

a-60 h;b-120 h

本課題組前期研究比較了產L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌SYPS-062以及模式菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中氨基脫氧分支酸合成酶的活力,發現產L-絲氨酸菌株中該酶的比活力比模式菌株低46.6%;同時采用反義RNA技術下調控葉酸合成關鍵酶基因pabAB的表達,構建的重組菌與出發菌株SYPS-062相比生長緩慢,L-絲氨酸產量卻有所提高[18]。這些研究說明氨基脫氧分支酸合成酶與菌株的生長及產L-絲氨酸密切相關。

2.3 pabAB基因定點突變對菌株生長和產L-絲氨酸的影響

pabAB基因426位的點突變(T426I)對菌株生長和產L-絲氨酸的影響如圖3所示。從圖3-a可以看出,突變菌株Kp在120 h時最大OD562為32,比出發菌株SSAAI下降29.3%。從圖3-b可以看出,突變菌株Kp在0～36 h時的比生長速率高于出發菌株SSAAI,但在36～120 h則顯著低于出發菌株SSAAI。

出發菌株SSAAI及其突變菌株KpL-絲氨酸產量情況如圖3-c所示。從圖3-c可以看出,突變株Kp的L-絲氨酸產量為30.4 g/L,而出發菌株SSAAI的L-絲氨酸產量為26.25 g/L;說明pabAB基因426位的點突變(T426I)導致L-絲氨酸產量有所提高。從圖3-c還可以看出,與出發菌株SSAAI相比,在發酵前期,Kp菌株L-絲氨酸產量變化不明顯;而在發酵72 h后,L-絲氨酸產量逐漸提高,最終突變菌株Kp的L-絲氨酸產量提高15.9%。

以上研究表明,氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力降低有利于產L-絲氨酸,而不利于菌株生長。該結果與本實驗室前期及PETERS-WENDISCH的研究結果相一致[4],pabAB基因單點突變導致的酶活力及菌株生長變化為其他研究提供了參考。

2.4 調控氨基脫氧分支酸合成酶對菌株生長和產L-絲氨酸的影響

采用不同強度啟動子在L-絲氨酸高產突變株A36中調控氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力,考察其對菌株生長和產L-絲氨酸的影響。首先登陸http://www.fruitfly.org/seq-tools/ promoter.html在線網站,預測基因氨基脫氧分支酸合成酶的啟動子,然后在已報道谷氨酸棒桿菌啟動子庫中選取強度不同的兩個啟動子(啟動子強度差異如圖4-a所示)替換菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的啟動子。

從圖4-a可以看出,啟動子Pkan強度明顯弱于啟動子Dap-e。利用pK18 mobsacB-Pkan/Dap-e敲除質粒在A36上進行pabAB啟動子的替換,得到重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e。菌株在120 h時氨基脫氧分支酸合成酶的比酶活力測定結果如圖4-b所示,重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e的氨基脫氧分支酸的比酶活力比出發菌株A36分別提高16.9%和32.6%。而采用啟動子Dap-e替換導致重組菌株A36-Dap-e平均蛋白濃度有所下降,分析原因可能是蛋白測定過程中細胞的破碎程度不完全一致所導致;盡管總蛋白含量偏低,但是替換后氨基脫氧分支酸合成酶的總酶活力及比酶活力仍然較高。

重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e發酵結果如圖5所示。從圖5-a可以看出,重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e的最大OD562值比出發菌株A36分別提高8.3%和16%。從圖5-b可以看出,重組菌株A36-Pkan在96 h前L-絲氨酸積累量高于A36,96 h后開始下降,發酵120 h時L-絲氨酸下降18.2%;重組菌株A36-Dap-e在72 h前L-絲氨酸積累量高于A36,在72 h時開始下降,發酵120 h時L-絲氨酸的積累量下降22.6%。

a-菌株生長的;b-L-絲氨酸產量

以上研究結果說明,較高的氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力有利于菌株生長,但不利于菌株生產L-絲氨酸;該結果與本實驗室前期及PETERS-WENDISCH的研究結果相一致[4,18]。盡管本文采用了實驗室保藏的最弱的啟動子Pkan替換改造了菌株A36,但是啟動子替換后氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力仍然比A36高,說明谷氨酸棒桿菌A36氨基脫氧分支酸合成酶的啟動子強度較弱,這也為谷氨酸棒桿菌提供了新的可以選擇的弱啟動子。有研究表明啟動子強度受到背景基因的影響較大,同時基因表達還受到多元件的協同調控[19-22]。今后可以研究采用多元件調控氨基脫氧分支酸合成酶,為構建高產L-絲氨酸的菌株奠定基礎。

3 結論與討論

本文以谷氨酸棒桿菌SSAAI及其誘變菌株A36為研究對象,根據誘變前后基因測序的結果對SSAAI中氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位進行定點突變(T426I),研究該突變對酶活力、L-絲氨酸產量及菌株生長的影響。結果發現氨基脫氧分支酸合成酶426位的T426I突變導致酶比活力下降,同時發現該點突變有利于菌株產L-絲氨酸,不利于菌株生長。進一步選擇不同強度的啟動子調控高產菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力,結果發現弱啟動子Pkan替換后氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力仍然比A36高,說明菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的啟動子強度更弱。本研究的結果為谷氨酸棒桿菌提供了新的可以選擇的弱啟動子,同時為進一步構建L-絲氨酸高產菌株奠定了基礎。