一株分離自母乳的長雙歧桿菌嬰兒亞種YLGB-1496的菌株鑒定

劉沖,馬霞,于學健,劉藝茹,劉偉賢,劉蕊,辛迪,唐騰飛,劉紅強,葛媛媛,孫婷,蔣秋悅,洪維鍊*,姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司 中國工業微生物菌種保藏管理中心,北京,100015)2(內蒙古乳業技術研究院有限責任公司,內蒙古 呼和浩特,010110)3(內蒙古伊利實業集團股份有限公司,內蒙古 呼和浩特,010110)

長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)作為人體腸道中常見的定植細菌,也是嬰幼兒腸道菌群中最豐富的物種之一,對人類健康發揮著重要作用[1]。隨著分類學技術的發展,B.longum的分類學地位變遷為4個亞種,分別為B.longumsubsp.longum,B.longumsubsp.infantis,B.longumsubsp.suis和B.longumsubsp.suillum[2],其中B.longumsubsp.infantis與嬰幼兒腸道健康密切相關,通過加速免疫系統成熟、平衡免疫系統、抑制炎癥、改善腸道屏障功能、增加乙酸生成等方式對宿主有益[3]。目前B.longumsubsp.infantis已列入我國《可用于食品菌種名單》和歐盟安全資格認定(qualified presumption of safety,QPS)名單中,已有菌株列入《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》[4]。YLGB-1496是1株分離自母乳的B.longumsubsp.infantis,該菌株具有耐酸耐膽鹽特性,能有效定植于Caco-2細胞,具有較強的調節免疫能力、抗炎[5]及抗氧化效果[6],在功能性食品、嬰幼兒營養補充劑領域具有應用潛力。

研究表明益生菌的功能性和安全性特征在菌株水平具有特異性,在株水平間具有較大差異[7-8]。國內外政府監管機構及標準組織也對益生菌在菌株水平的鑒定和特征分析提出更高要求[9-10]。隨著微生物鑒定技術和系統分類學的發展,菌株水平鑒定技術也持續動態更新,益生菌“種水平”分類學地位是“株水平”鑒定的必要前提[10]。菌種分類學地位的確認通常可通過形態學、生理生化特征、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)等表型鑒定技術,并結合分子生物學16S rDNA和持家基因鑒定、平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)分析等技術實現[11]。益生菌“株水平”精準鑒定可采用多種表型與基因型分型技術,實現益生菌鑒定溯源分析,例如基于全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)的單核苷酸位點多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)、多基因序列位點分析(multilocus sequence analysis, MLST)、脈沖場凝膠電泳技術(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)、隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)標記等技術。DURANTI等[12]對18株B.adolescentis進行cgMLST分析,通過對共有基因進行差異分析和系統發育分析,18株菌株得到良好區分。LIU等[13]采用16S rRNA、MLST、PFGE和SNP基因分型方法明確市售產品中B.animalissubsp.lactis菌株的聲明準確性。基于WGS的SNP和cgMLST分析技術憑借其全面的遺傳信息和較高的分辨率成為菌株鑒定分型的可靠方法[14-15]。

本研究針對B.longumsubsp.infantisYLGB-1496,通過形態學、生理生化、MALDI-TOF MS等表型鑒定技術,結合全基因組測序、MLST、SNP等分子生物學技術,在菌株水平對目標菌株的分類鑒定方法開展研究,為建立適用于YLGB-1496的菌株鑒定流程奠定技術基礎。通過菌株鑒定實現益生菌的精準溯源,為產品質量控制提供可靠的技術支撐,建立完善的菌株鑒定技術體系對益生菌行業的健康快速發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株信息

菌株YLGB-1496-1～5均由內蒙古伊利實業集團股份有限公司提供,模式菌株B.longumsubsp.infantisCICC 6069T和B.longumsubsp.longumCICC 6186T由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。其他參比菌株分離自有明確菌株聲稱的益生菌菌劑、沖劑、滴劑、菌片、膠囊等產品。菌株具體信息見表1。

表1 菌株信息Table 1 Information of strains

1.1.2 實驗儀器

光學顯微鏡,尼康儀器有限公司;掃描電鏡,日立高新技術國際貿易有限公司;MALDI-TOF MS,德國布魯克公司;PCR儀,德國Biometra;電泳儀,美國BIO-RAD;BGISEQ-500高通量基因測序儀、BGIDL-50全自動樣本加載系統,深圳華大智造科技有限公司;微量可調移液器、冷凍離心機,德國Eppendorf公司;Q800R2超聲打斷儀,美國Sonicator公司;Qubit 3.0核酸熒光定量儀,賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 實驗試劑

MRS瓊脂培養基、強化梭菌培養基,美國BD公司;API 20 A培養基與試驗條,法國生物梅里埃公司;BIOLOG BUA培養基、BIOLOG AN-IF接種液、BIOLOG AN MicroPlateTM,BIOLOG公司;革蘭氏染色液,北京陸橋技術股份有限公司;高通量測序試劑套裝BGISEQ-500RS、通用DNA文庫制備試劑套裝,深圳華大智造科技有限公司;Qubit?dsDNA HS Assay Kit、Qubit?ssDNA Assay Kit,賽默飛世爾科技有限公司;細菌基因組提取試劑盒E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit,Omega Bio-tek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 參比菌株分離純化

采用梯度稀釋法從益生菌菌劑等樣品中分離純化目標菌株。依據產品中菌株含量信息將勻液稀釋為不同稀釋梯度,選擇適宜稀釋梯度的菌懸液涂布于MRS或強化梭菌平板上。36 ℃厭氧培養48～72 h后,選取單菌落進行MALDI-TOF MS鑒定,將鑒定為長雙歧桿菌的目標菌落進行劃線純化,得到純菌株。

1.2.2 形態學觀察

菌株YLGB-1496-1接種于MRS培養基平板上,于36 ℃厭氧條件下培養48 h后,觀察菌落形態,并進行革蘭氏染色觀察菌體形態。新鮮培養物經無菌生理鹽水漂洗后用體積分數2.5%戊二醛固定過夜。離心去除戊二醛,磷酸鹽緩沖液漂洗菌體,乙醇梯度脫水,CO2臨界點干燥后,將樣品噴金后使用掃描電鏡進行菌體形態觀察[16]。

1.2.3 API鑒定

菌株YLGB-1496-1于MRS培養基上36 ℃厭氧培養24 h,挑取足量菌落加入API20A培養基中制得混濁度相當于3 McFarland的菌懸液,接種API20A實驗條,于36 ℃厭氧培養24～48 h后,加入附加試劑BCP、XYL、HER、H2O2判讀結果,使用數據庫API 20A V3.0進行鑒定。

1.2.4 BIOLOG鑒定

將菌株純培養物轉移至BUA+B培養基上,用第二代的新鮮培養物和AN-IF接種液制備菌懸液,菌懸液濁度調至65%T,然后接種BIOLOG AN MicroPlateTM鑒定板,在空氣中暴露10～15 min,移至厭氧環境中36 ℃培養24 h[17]。使用BIOLOG Microstation,ML3 DC軟件讀取結果。

1.2.5 MALDI-TOF MS鑒定

挑取新鮮培養的實驗菌株菌體加入300 μL超純水,再加入900 μL無水乙醇渦旋振蕩1 min,離心收集菌體,加入50 μL 70%(體積分數)甲酸重懸菌體細胞,加入50 μL乙腈混勻;離心取上清液加到靶板上,按照儀器說明進行鑒定分析。

1.2.6 DNA提取與WGS

采用細菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,使用MGIEasy通用DNA文庫制備試劑套裝進行建庫,文庫經質控合格后完成上機測序,對原始下機數據進行質控過濾:去除質量值連續≤20的堿基數達到40%的reads、去除含N堿基比例≥10%的reads、去除接頭和重復污染。使用SPAdes 3.11.0軟件進行拼接組裝獲得基因組序列。

1.2.7 基于WGS的ANI/數字DDH分析

以模式菌株B.longumsubsp.longumJCM 1217T(GCA_000196555.1)、B.longumsubsp.infantisATCC 15697T(GCA_000020425.1)、B.longumsubsp.suisDSM 20211T(GCA_900103055.1)、B.longumsubsp.suillumSu 851T(GCA_016882605.1)為參考菌株,利用fastaANI(v 1.3)軟件對測序菌株進行ANI分析。通過GGDC在線分析數據庫(https://www.dsmz.de/services/online-tools/genome-to-genome-distance-calculator-ggdc)計算實驗菌株和參考菌株的數字DDH值。

1.2.8 基于WGS的多基因序列位點分析(cgMLST)分析

利用Prodigal(v2.6.3)軟件進行基因預測,對菌株的蛋白基因進行聚類分析CD-HIT(v 4.6.6),提取樣品中共有基因,基于共有基因矩陣構建系統進化樹。用TreeBeST(v 1.9.2)的PHYML(最大似然法)算法構建系統進化樹,bootstraps參數設置為1 000。

1.2.9 基于WGS的SNP分析

利用MUMmer將實驗菌株序列與參考序列進行比對,得到潛在SNP位點;提取參考序列SNP位點兩邊各100 bp序列,然后用BLAT將提取的序列和組裝結果進行比對,驗證SNP位點。采用BLAST、TRF、Repeatmask軟件預測重復序列位點,過濾去除重復區SNP,最后得到可靠的SNP。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

菌株YLGB-1496-1在MRS培養基中,36 ℃厭氧培養48 h,菌落白色、圓形、表面濕潤、不透明、邊緣整齊(圖1-a)。光學顯微鏡下觀察,菌體呈桿狀,(0.5～0.6) μm×(1.2～3.8) μm,單個或成對排列,革蘭氏陽性(圖1-b)。掃描電鏡觀察,菌體呈不規則桿狀,(0.4～0.6) μm×(1.3～4.7) μm,單個或成對排列(圖1-c和圖1-d)。菌株YLGB-1496-1的菌落和菌體形態符合長雙歧桿菌典型特征[18]。

2.2 生理生化特征

經API20A試劑條和BIOLOG鑒定系統對菌株YLGB-1496-1的酶活性、利用碳源產酸等生理生化特征進行檢測。如表2所示,菌株YLGB-1496-1能水解明膠和七葉靈,過氧化酶反應陰性,能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖等,經API20A系統鑒定為雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumsp.)。

表2 菌株YLGB-1496-1的API分析結果Table 2 API analysis results of strain YLGB-1496-1

BIOLOG主要根據菌株對糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進行鑒定。如表3所示,經BIOLOG AN鑒定板鑒定為B.longumsubsp.infantis。目標菌株鑒定至亞種水平,與鑒定系統中生理生化反應及數據庫中菌株收集的數量有關。

表3 菌株YLGB-1496-1的BIOLOG分析結果Table 3 BIOLOG analysis results of strain YLGB-1496-1

2.3 菌株YLGB-1496及參比菌株MALDI-TOF MS鑒定結果

MALDI-TOF MS是近年來新興的微生物快速鑒定系統,通過檢測微生物核糖體等高豐度穩定表達的特征蛋白指紋圖譜,與已知菌種蛋白指紋圖譜比對分析,進行快速菌種鑒定。該方法已進入GB/T 33682—2017《基質輔助激光解析電離飛行時間 質譜鑒別微生物方法通則》,并且在益生菌菌種鑒定方面有較好的應用,已有研究利用此技術對動物雙歧桿菌的2個亞種實現區分[19]。MALDI-TOF MS數據庫中包含25種雙歧桿菌蛋白指紋圖譜,數據庫中菌株的種類和數量越豐富,指紋圖譜越完善,得到的鑒定結果也越可靠[20]。如表4所示,MALDI-TOF MS可明確YLGB-1496菌株及參比菌株的種水平,均鑒定為B.longum,分值均達到2.0以上,鑒定結果具有較高的可信度。

表4 MALDI-TOF MS鑒定結果Table 4 Identification results of MALDI-TOF MS

2.4 ANI分析結果

ANI于2007年由GORIS等[21]提出,指2個基因組序列之間的整體相似性,將ANI值95%～96%作為細菌菌種鑒定的有效判定指標。模式菌株B.longumsubsp.infantisATCC 15697T(ref1)、B.longumsubsp.longumJCM 1217T(ref2)、B.longumsubsp.suisDSM 20211T(ref3)和B.longumsubsp.suillumSu 851T(ref4)的全基因組序列作為參考序列。如表5所示,實驗菌株均與3個及以上的參考模式菌株全基因組的ANI比值在95%以上,可確認其種水平分類學地位,所有菌株均鑒定為B.longum。5株YLGB-1496菌株與B.longumsubsp.infantisATCC 15697T的ANI值均大于98%,具有更高的相似性,親緣關系更近。

表5 ANI分析結果Table 5 Results of ANI analysis

2.5 數字DNA-DNA雜交(digital DNA-DNA hybridization,dDDH)分析結果

dDDH分析可作為對ANI分析結果進一步補充,選取相同的模式菌株的全基因組序列作為參考序列進行分析,結果如表6所示。研究表明通過dDDH技術可有效將目標菌株鑒定至亞種水平,其判定閾值為79%～80%,DNA-DNA雜交值>79%為同一亞種[22]。5株菌株YLGB-1496與B.longumsubsp.infantisATCC 15697T的dDDH值均>85%,與其他參考模式菌株的dDDH值均<70%,鑒定為B.longumsubsp.infantis。

表6 dDDH分析結果Table 6 Results of dDDH analysis

在菌株株水平鑒定之前,基于最新方法在種或亞種水平上準確分類必不可少。結合形態學、生理生化、MALDI-TOF MS表型方法以及WGS-ANI、dDDH對菌株YLGB-1496進行了鑒定,可明確目標菌株的亞種水平分類學地位。目標菌株YLGB-1496-1～5鑒定為B.longumsubsp.infantis。表型鑒定方法也可表征菌株相關的代謝能力,對菌株發酵工藝過程的優化具有指導性,但細菌處于的生長期、數據庫的完善程度都會影響鑒定結果。全基因組測序目前被認為是菌種鑒定最有效和準確的方法,但其需要更高的成本和生物信息學知識來分析數據。

2.6 cgMLST分析結果

MLST是基于多位點序列的分型方法,通過串聯多個基因內部片段序列,對菌株的等位基因進行多樣性比較,通過不同的序列型分析菌株間的關系,在流行病學監測和進化研究方面有較廣泛的應用[23]。cgMLST主要通過對菌株間的所有共有基因進行分型,可以得到較好的菌株區分效果。為進一步分析亞種內不同菌株間差異,選取EZBioCloud上28株B.longumsubsp.infantis全基因組序列以擴充樣本量。將所有菌株進行序列比對得到共有核心基因1 059個(圖2)。以共有基因為基礎,系統發育分析結果表明(圖3),原始種子批菌株YLGB-1496-1與不同種子批來源菌株YLGB-1496-2～5聚類在一起,處于同一分支。5株YLGB-1496目標菌株與其他不同株和不同亞種的參比菌株可以有效區分,因此通過cgMLST可以實現目標菌株的株水平分型鑒定。

圖2 菌株的共有基因和特有基因分布Fig.2 Distribution of common and unique genes in strains

圖3 菌株的cgMLST系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of strains based on cgMLST

2.7 SNP分析結果

以YLGB-1496-1為參考,將菌株reads序列進行比對分析,SNP分析結果如表7所示。YLGB-1496-2的SNP差異為0,YLGB-1496-3的SNP差異為15,YLGB-1496-4的SNP差異為30,YLGB-1496-5的SNP差異為5,與參考序列的SNP差異較小,其他參比菌株的SNP差異均大于18 000。結合EZBioCloud上28株B.longumsubsp.infantis全基因組序列分析,結果表明所有菌株與YLGB-1496-1的SNP差異均大于20 000。基于SNP差異的系統發育分析結果與cgMLST分析一致,如圖4所示,5株YLGB-1496的基因序列聚集在同一分支,與其他菌株有明顯區分。

圖4 菌株的SNP系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of strains based on SNP

表7 SNP分析結果Table 7 Results of SNP analysis

目前SNP分析在益生菌菌株鑒定領域還缺少統一公認的評判標準,該方法的判定標準與目標菌株及參考菌株的種類與數量密切相關。研究表明通過對1 143株L.monocytogenes的SNP分析,21個SNP差異以內可認為菌株具有同源性[15]。本研究5株目標菌株YLGB-1496中SNP差異最大為30,注釋到YLGB-1496-1與YLGB-1496-4具有28個差異基因位點。統計株內(5株)、株間(32株)和亞種內(4株)在差異位點的單核苷酸位點性態,計算4種核苷酸的占比結果如圖5所示,其中13個位點(3～6,11,13,16,18,19,22,23,25,27)是該種內的多態性位點,在菌株間的多態性變化屬于種內正常現象。研究表明乳酸菌菌株經過連續多次傳代后會引起同株內的SNP差異,但其表型特征基本穩定[24-25]。因此基于本研究的菌株數量及數據結果分析,目標菌株YLGB-1496具有30個以內SNP差異,可與其他菌株良好區分,SNP分析可實現YLGB-1496的菌株分型鑒定。

圖5 YLGB-1496-1與YLGB-1496-4 的SNP差異位點統計Fig.5 Analysis of SNP difference sites between YLGB-1496-1 and YLGB-1496-4

3 結論與討論

本研究建立了長雙歧桿菌嬰兒亞種YLGB-1496的“株”水平鑒定方法體系:通過形態學、生理生化、MALDI-TOF、基于WGS的ANI和數字DDH分析實現目標菌株YLGB-1496的亞種水平鑒定;進一步通過基于WGS的SNP和cgMLST分析有效區分目標菌株YLGB-1496與其他不同株、不同亞種的參比菌株,以及有效對不同批次來源菌株實現分型溯源,從而實現目標菌株YLGB-1496的株水平鑒定。本研究構建的目標菌株YLGB-1496鑒定技術流程,為益生菌菌株精確鑒定技術體系的構建提供了有效數據支撐和實踐參考。在株水平上鑒定益生菌方法的選擇,應根據菌株自身特點、不同用途或應用場景選擇適當的方法。SNP和cgMLST作為分辨率較高的益生菌菌株鑒定技術,廣泛應用于菌株溯源及新菌株的區分,其適用范圍、判定標準與研究涵蓋的目標菌株、參考菌株數量密切相關。隨著試驗菌株樣本量的不斷擴充,建立的益生菌菌株鑒定流程和評價標準將更具代表性、覆蓋度和統計學意義。未來基于cgMLST和SNP分析結果,可進一步分析目標菌株YLGB-1496特異性核苷酸位點,設計株水平特異性引物,實現YLGB-1496菌株的快速精準鑒定和定量檢測分析。