基于腸道類器官解析益生菌調節腸嗜鉻細胞合成5-HT的效應物質

汪錚,田培郡,朱然,王剛,陳衛

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)作為一種神經遞質,在調節腸道蠕動和神經功能方面扮演著重要的角色[1-2]。5-HT是以色氨酸為前體,在色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)和芳香族氨基酸脫羧酶的催化下生成的[3];TPH是其合成途徑中的關鍵限速酶,包括TPH1和TPH2兩種亞型。前者存在于腸嗜鉻(enterochromaffinl,EC)細胞內,后者主要在大腦中縫核中發現[4]。EC細胞占比不到腸上皮細胞總數的1%,卻合成了人體內超過90%的5-HT[3]。EC細胞還能夠接受腸腔內環境的化學、機械等刺激,在基底部位或頂膜附近釋放5-HT,將腸內信號傳導至大腦[5]。

腸道菌群及其分泌的代謝產物能夠刺激EC細胞來調控5-HT的合成。YANO等[6]發現無菌小鼠腸道內5-HT含量比正常老鼠低約60%,當重新定殖產孢細菌后,能夠恢復其腸道內5-HT的水平;進一步的研究發現,菌群代謝產物是誘導EC細胞釋放5-HT的關鍵因素,包括α-生育酚、丁酸鹽、膽鹽、脫氧膽酸鹽、對氨基苯甲酸、丙酸鹽和酪胺等。另有研究表明,與SPF小鼠相比,無菌小鼠結腸內Tph1表達水平顯著降低,而恢復腸道菌群可顯著逆轉這一現象;菌群產生的短鏈脂肪酸是影響Tph1表達和5-HT合成的必要因素[7]。此外,在異硫氰酸烯丙酯、異戊酸、兒茶酚胺等腸道菌群代謝產物的刺激下,EC細胞分別通過TRPA1離子通道、Olfr558受體和Adrα2A受體—TRPC4通道信號級聯通路對其作出興奮反饋,激活EC細胞的L型電壓門控鈣離子通道來釋放血清素[8]。

益生菌也被證明具有調節腸道5-HT合成的能力。例如,乳雙歧桿菌TY-S01能夠通過調節腸道微生物群和代謝產物來維持腸道內5-HT水平,對洛哌丁胺誘發便秘具有一定的預防效果[9]。此外,齒雙歧桿菌的定殖可以提高腸道短鏈脂肪酸受體FFAR2和5-HT轉運蛋白的表達,進而促進5-HT的外分泌水平[10]。可以看出,現有關于益生菌調節宿主5-HT合成的機制,仍停留在調節腸道菌群及其代謝產物的宏觀層面。至于益生菌本身對5-HT合成的影響機制,尚未有深入研究。

本團隊前期研究發現一株短雙歧桿菌——CCFM1025,能夠顯著提高EC細胞模型(RIN14B)的5-HT合成能力;尤其是使用發酵上清液孵育30 min后,能夠顯著提高RIN14B細胞Tph1基因的轉錄水平[11]。但是,何種代謝產物、通過何種途徑提高EC細胞合成5-HT仍然是未知的。本研究擬基于益生菌與腸道類器官共培養和量效分析的方法,解析短雙歧桿菌CCFM1025調節5-HT合成的特征效應物,從而闡明益生菌發揮生理功能的分子機制,為該類功能益生菌的定向篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

MRS肉湯培養基、TRIzol RNA Isolation Reagents,美國Invitrogen公司;SYBR Green Supermix,美國Bio-Rad公司;Tph1特異性引物、D601037-0050抗小鼠/兔FITC免疫熒光檢測試劑盒,上海生工有限公司;色氨酸羥化酶1(TPH1;Cat#DF6465),美國Affinity抗體公司;06005 IntestiCultTM類器官生長培養基,加拿大StemCell公司;356231基質膠,美國Corning公司;C0221D D-PBS,碧云天;E-EL-0033c血清素/5-羥色胺(serotonin/5-HT)酶聯免疫吸附測定試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技有限公司;36254 DMEM/E12培養基,加拿大Stemcell公司。

1.2 材料和設備

5417R冷凍離心機,德國Eppendorf公司;CFX384實時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;SX-300型滅菌鍋,日本Tomy Digital Biology公司;CO2培養箱,美國Thermo Scientific Forma公司;T1-SAM倒置熒光顯微鏡,日本Nikon公司;恒溫水浴鍋;厭氧工作站;SCIENTZ-48高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技有限公司;BSC-1004IIA2生物安全柜,蘇州安泰。

1.3 擬試驗菌株

BifidobacteriumbreveCCFM1025分離自西藏某一健康成人糞便,保藏于江南大學生物技術中心菌種庫(-80 ℃,30%甘油中)。

1.4 菌株活化和發酵液制備

使用前,以無菌接種環挑取適量菌液,在MRS瓊脂平板上劃線活化2次(37 ℃厭氧培養24～48 h)。挑取單菌落,CCFM1025接種于含有1 g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS液體培養基中,置于37 ℃的厭氧工作站進行發酵培養。取對數生長后期的發酵液,離心(4 ℃、6 000×g、10 min)收集上清液得到發酵液。

1.5 菌株發酵產物非靶向代謝組學分析

取對數生長后期的發酵液,離心(4 ℃、6 000×g、10 min)收集上清液后過0.22 μm濾膜得到發酵液,經400 μL甲醇沉淀蛋白質后,4 ℃、15 000 r/min離心15 min,取上清液于真空濃縮儀蒸發至干,最后以100 μL甲醇水(4∶1,體積比)復溶待測。

采用Ultra-performance liquid chromatography &Q-Exactive high-resolution mass spectrometer系統進行代謝組學檢測:使用C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1 mm×100 mm,1.7 μm)進行梯度洗脫。流動相包括:(A)0.1%甲酸水溶液和(B)乙腈用于正離子模式;(A)5 mmol/L乙酸銨水溶液和(B)乙腈用于負離子模式。進樣量5 μL,流速350 μL/min。梯度洗脫程序:0～1.5 min,99%(A);1.5～16 min,從99%～0%(A);16～18 min,0%(A);18～18.1 min,從0%到99%(A);18.1～25 min,99%(A)。采用MS/MS-scan模式(70～1 050m/z),分辨率70 000。采用Compound Discover 3.3軟件進行樣本的峰識別、提取、對齊和整合。之后,通過mzCloud數據庫對91個(負離子模式)和185個(正離子模式)發酵液代謝物的名稱和化學結構進行二次比對,刪去重復合并后共259個代謝物進行后續分析。

1.6 小腸類器官構建

1.6.1 腸道隱窩分離、培養

取6周齡雄性C57BL/6小鼠約20 cm的小腸,用鑷子和剪刀去除腸系膜、血管和脂肪,并用D-PBS沖洗多次,沿著腸腔軸向剪開腸道,轉移至含有10 mL D-PBS的培養皿中清洗干凈。用鑷子將腸道懸于含有預冷D-PBS的50 mL離心管口,剪成約2 mm的小段。用移液槍反復吹打,待組織塊自然沉降后,棄去上清液,加入15 mL預冷的D-PBS,反復吹打3次,靜置。重復操作15次或是等到上清液變澄清,棄去上清液加入細胞解離液搖床上低速孵育10 min,待自然沉降棄去上清液,用含有0.1%(體積分數)牛血清白蛋白的D-PBS重懸,70 μm濾網過濾后,低速低溫離心后重懸于DMEM/F-12培養基。顯微鏡下挑選質量較好、密度適中的隱窩數。用類器官培養基和基質膠各150 μL重懸腸隱窩,吸取50 μL懸液,加入到提前預熱的24孔板的中心部位,在37 ℃培養箱中靜置10 min讓基質膠凝固成一個圓頂結構,使用移液槍沿著孔側壁向每個孔加入750 μL類器官培養基,并在37 ℃和5% CO2下進行培養。

1.6.2 小腸類器官換液和傳代

待腸隱窩培養2～3 d后,培養基逐漸變黃,用移液槍沿著孔側壁吸去培養基,再吸去750 μL新的培養基,沿著孔側壁緩慢加入。

等培養5～7 d后進行傳代,準備好所有試劑進行解凍,在每個需要傳代的孔中小心吸去培養基,不要破壞基質膠結構,每孔加入1 mL細胞裂解液,室溫孵育1 min,用潤洗后的槍頭對類器官進行反復吹打20次,注意不要產生氣泡,用同一根槍頭將所有需要傳代的類器官轉移至15 mL離心管中。之后再用新的細胞裂解液潤洗培養孔,再轉移到15 mL離心管,其余需要傳代的孔均按上述操作。搖床低速孵育10 min,低速低溫離心5 min后棄去上清液,加入10 mL DMEM/F-12培養基,混勻后低速低溫離心,棄去上清液。將類器官培養基和基質膠以1∶1的質量比重懸腸隱窩,吸取50 μL懸液,加入到提前預熱的24孔板的中心部位,在37 ℃培養箱中靜置10 min讓基質膠凝固成一個圓頂結構,使用移液槍沿著孔側壁向每個孔加入750 μL類器官培養基,并在37 ℃和5% CO2下進行培養。觀察培養5～7 d后的類器官形態,成熟且具有明顯多芽結構,即可進行物質刺激實驗。

1.7 刺激小腸類器官Tph1基因轉錄實驗

以發酵產物中每種代謝產物的實際濃度,配制標準溶液,并設置0.1×、1×、10×三個濃度梯度。無菌0.22 μm濾膜過濾除菌,每個孔用移液槍吸去培養基,加入含有一定濃度草酰乙酸、乳酸或檸檬酸的1 mL D-PBS,孵育一定時間后收集類器官。進行后續的基因表達和免疫熒光的分析。通過qRT-PCR檢測小腸類器官中Tph1的基因表達情況。

樣本RNA按照TRIzol法提取,收集完類器官加入TRIzol充分裂解、振蕩,加入氯仿提取RNA,然后通過異丙醇沉淀,體積分數75%乙醇洗脫得到RNA,室溫干燥15 min后加入DEPC水溶解RNA。采用Vazyme反轉錄試劑盒得到cDNA,在熒光定量擴增儀器上進行檢測。以管家基因Gapdh作為內參,每個樣本設立3個平行孔。反應結束后,取各個擴增循環數(Cq)進行計算分析。相對表達量以目的基因對于管家基因的倍數(2-ΔΔCq)表示,其中-ΔΔCq=(Cq目的基因-Cq管家基因)實驗組-(Cq目的基因-Cq管家基因)對照組。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 小腸類器官TPH1蛋白免疫熒光分析

腸類器官收取:腸類器官培養在24孔中,吸取培養基,用冷的D-PBS洗一遍,然后每個孔加入1 mL的預冷細胞裂解液,用潤濕的槍頭輕輕吹打,將腸類器官和基質膠從孔底部吹下來,轉移到1.5 mL離心管中自然沉降在底部。冰上孵育約20 min直到基質膠基本被融解,腸類器官在離心管中自然沉降在底部。

免疫熒光染色參照上海生工FITC免疫熒光試劑盒說明書進行:將收集的類器官用PBS清洗3遍,加入4%多聚甲醛(paraformaldehycle,PFA)進行固定,再次用PBS清洗3遍加入0.5% Triton-100溶液進行腸細胞破膜。隨后PBS清洗2遍后加入5%牛血清白蛋白進行抗體封閉。將一抗TPH1(1∶200)稀釋到合適的比例加入后4 ℃過夜,PBS清洗后加入FITC標記的二抗和DAPI進行染色。最后加入一滴抗熒光淬滅劑混勻封片,封好的片子4 ℃避光保存。在FITC和DAPI通道下,用激光共聚焦顯微鏡進行掃描拍照,分析蛋白在腸類器官中的表達定位情況。最后用Image J對類器官免疫熒光實驗結果進行平均免疫熒光強度測定。

1.9 5-HT檢測方法

用小鼠5-HT ELISA試劑盒檢測各組腸類器官分泌5-HT的水平變化,具體實驗步驟參考生產商的說明書進行。

1.10 數據統計與分析方法

數值表示為平均值±標準差,采用Prism 8進行統計分析和圖形繪制。顯著性標準設為P<0.05;其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。

2 結果與分析

2.1 小腸類器官構建及CCFM1025發酵液對小腸類器官的影響

小腸隱窩經分離提取培養,幾個小時到一天培養時間內形成閉合的圓形囊狀結構,并且具有相對光滑的邊緣(圖1-a),通常在培養2～4 d后,開始萌芽,位于小腸隱窩底部的干細胞不斷增殖和分化,向囊狀結構四周擴散,培養第5～7天閉合囊狀結構形成復雜的多葉結構,轉變為具有多個向外凸起芽體的立體結構(圖1-a),此時形成了小腸類器官的成熟結構,一般可達到每個孔約200個類器官(圖1-b)。繼續培養2～4 d,腸上皮細胞將會死亡脫落于腸腔內,中部變黑,直至類器官裂解破碎凋亡。

團隊前期檢測了CCFM1025發酵上清液對RIN14B細胞Tph1轉錄表達的影響。在刺激時間為30 min時,較于空白組Tph1的表達有顯著提高。我們設置了不同濃度梯度的CCFM1025發酵液,觀察對小腸類器官Tph1表達和5-HT外分泌水平的影響。結果顯示發酵液干預60 min后,小腸類器官Tph1基因表達和5-HT外分泌水平呈劑量依賴性。如圖1-c所示,較于105CFU/mL發酵液干預組,107、109CFU/mL發酵液干預組中小腸類器官Tph1基因表達顯著上調;如圖1-d所示,較于105CFU/mL發酵液干預組,109CFU/mL發酵液干預組中小腸類器官5-HT分泌水平顯著上調(P<0.05)。

2.2 CCFM1025發酵液非靶向代謝組分析

根據Compound Discover 3.3軟件對樣本的峰識別、提取、對齊和整合(如圖2-a所示),篩選出符合數據庫配比得分>80等條件的所有代謝物,得到91個(負離子模式)和185個(正離子模式)發酵液代謝物,刪去重復合并后共有259個代謝物。并根據含量對對數后期CCFM1025發酵液中能檢測到的代謝物進行排序,發酵液中含量排序前10的物質如圖2-b、圖2-c所示,前10種物質的m/z的離子圖和峰面積圖如圖2-b所示。

a-CCFM1025發酵液非靶向代謝譜圖;b-CCFM1025發酵液非靶向代謝物離子圖(m/z)和峰面積圖;c-CCFM1025發酵液非靶向代謝物峰面積圖(前10)

根據前期文獻的調研,我們選取發酵液揮發性代謝產物和非揮發性代謝產物(豐度前10)。根據靶向定量的方法,確定了發酵液中含有4.8 mg/mLL-乳酸等,以發酵液所含每種物質的濃度定為1×,根據母液濃度按梯度稀釋配制0.1×、1×、10×的工作液進行后續實驗。

2.3 代謝產物對小腸類器官Tph1基因表達的調節作用

以發酵產物中每種代謝產物的實際濃度配制好后,與小腸類器官共培養不同時間:20、40、60 min。如圖3所示,檸檬酸、亮氨酸、L-乳酸、異亮氨酸、腺嘌呤、乙酸呈時間依賴性。相較于20 min共培養組,較長時間共培養的草酰乙酸、L-乳酸、肌酐、腺嘌呤、乙酸組均能夠顯著提高小腸類器官Tph1基因的表達,而較長時間共培養的檸檬酸、亮氨酸、異亮氨酸組顯著抑制了小腸類器官Tph1基因的表達。我們根據每種物質在發酵液中的含量設置了3個不同的濃度梯度的工作液,統一為0.1×、1×(CCFM1025發酵液所含該物質濃度)、10×;與小腸類器官共培養相應的最適時間。結果發現L-乳酸、乙酸均具有劑量依賴性,并且在10×濃度下能夠顯著提高小腸類器官Tph1基因的表達(L-乳酸:P<0.000 1;乙酸P<0.001)。

2.4 乙酸、乳酸對小腸類器官TPH1蛋白免疫熒光的表現

上述結果顯示,L-乳酸、乙酸能夠顯著刺激小腸類器官Tph1基因的表達,因此我們又對小腸類器官進行TPH1免疫熒光實驗觀察。DAPI透過細胞膜和細胞核中雙鏈DNA結合發揮標記作用,經等濃度DAPI染色后各組間熒光強度沒有顯著差異,結果體現了實驗樣本和檢測條件的一致性(圖4-a)。將最適濃度的乙酸(1×)、L-乳酸(1×)與小腸類器官共培養,對小腸類器官進行TPH1免疫熒光染色處理,結果顯示L-乳酸和乙酸體外刺激小腸類器官導致TPH1表達顯著增強(如圖4-b、圖4-c所示)。綜上,L-乳酸和乙酸激活了小腸類器官TPH1的表達,與上述基因表達結果一致。

a-各組小腸類器官DAPI染色的平均免疫熒光強度;b-不同代謝物刺激小腸類器官TPH1的平均免疫熒光強度;c-不同代謝物刺激小腸類器官TPH1的免疫熒光表達

3 結論與討論

明確益生菌特定的代謝產物與腸道細胞的互作機制可能是未來實現特定功能益生菌定向篩選的前提。但由于研究方法的局限性,探究益生菌與宿主的直接互作機制仍具有挑戰。以往的研究,都是在單一時間點和特定范圍內進行橫斷面式研究,通過不同實驗組橫向比較得到差異結果[12-13],比如只通過某一時間點的橫向比較來判斷服用益生菌的積累效應;其次,在劑量維度上,往往采用單一劑量來評價益生菌的效果,然而它可能處于濃度與效果評價曲線中的任意一點[14]。可見,傳統的實驗設計存在一定的局限性。益生菌功效研究亟待擺脫脫離劑量、時間限定來研究其效果的現狀。

出現這種現象是因為體內量效關系研究的技術難度較高。近年來發展的腸道類器官培養技術能夠很好地解決這一問題[15-17]。腸道類器官擁有來源于腸干細胞的多種細胞類型,并復現了腸道組織局部的3D立體空間結構。通過與腸道細菌或是代謝產物的共培養,能夠模擬營養成分與多種細胞互作的真實內環境。此外,類器官能夠長時間培養、穩定傳代,有利于開展基于時間、劑量的量效分析實驗。BFLLONO等[18]通過腸類器官闡明了EC的內在生物物理、藥學及遺傳學特性,為研究腸道微生物調節宿主5-HT合成的分子機制、效應物篩選等奠定了理論和技術基礎。本研究采用腸類器官與益生菌特征性代謝產物共培養的方式,明確了能夠以時間、劑量依賴效應刺激Tph1基因表達的代謝產物,從物質層面為益生菌調節生理功能提供了更科學、更具體的證據。

針對CCFM1025發酵產物的非靶向代謝組學分析顯示,乳酸是其主要的非揮發性代謝產物(豐度排名前10)。此外,我們對CCFM1025主要的揮發性代謝產物——乙酸,也進行了量效作用分析。結果表明,乙酸、L-乳酸能夠以時間、劑量依賴效應促進腸道類器官Tph1基因的表達。值得注意的是,乙酸能夠參與神經系統功能調節,比如調節胃腸道蠕動、食欲、情緒反應等等。ENGEVIK等[10]研究發現,齒雙歧桿菌的定殖可增加小鼠腸道內乙酸的含量,通過提高5-HT轉運蛋白的表達,促進5-HT的分泌;此外,TSURUTA等[19]研究發現,乙酸鹽和腸類器官共培養能夠顯著提高CgA陽性細胞數量以及Tph1、Htr4的基因表達水平,這與我們的研究結論一致。乳酸在調節5-HT合成方面鮮有報道,但其被證明具有一定程度的神經活性。比如乳酸轉化為丙酮酸的過程中產生的NADH,能夠保護抑郁導致的神經元發生障礙[20];外周注射L-乳酸能夠提高了小鼠海馬體內Hes5的轉錄水平,激活Notch信號通路調節海馬體的神經發生[21];此外,有研究表明在血清素相關神經遞質的調節下,星形膠質細胞能夠在利用糖原過程中產生釋放乳酸鹽,并且乳酸鹽轉運到神經元是長期記憶形成的必要因素[22]。

本研究還存在一些不足之處。首先使用代謝組學技術篩選出益生菌潛在的多種作用物質,基于小腸類器官建立了物質與基因表達的互作量效關系,但時間和劑量的選擇范圍仍然偏窄。選擇作用時長短、時間間隔少、濃度梯度小的共培養方式均不能完全復現出益生菌與腸道細胞的動態互作關系。其次本文采用小腸類器官作為研究益生菌活性成分的模型,但是益生菌的作用部位主要在大腸。受技術所限,雖然小腸類器官是目前研究EC細胞的主要工具,但結腸類器官與益生菌共培養模式應當成為研究益生菌與宿主互作機制的第一選擇。

本研究首次采用腸道類器官技術來研究益生菌發揮生理作用的物質基礎并明確量效關系。發現短雙歧桿菌CCFM1025的發酵產物——L-乳酸、乙酸,能夠以劑量、時間依賴性顯著上調小鼠小腸類器官Tph1的基因表達,促進5-HT的生物合成。本文建立了益生菌特征性代謝產物與宿主互作的直接證據,闡明了益生菌調節腸道5-HT合成的潛在分子機制,為同類功能新菌株的開發提供了理論基礎。