基因組重排選育優(yōu)良發(fā)酵性能的高濃釀造啤酒酵母

張亞萌,王金晶*,鈕成拓,鄭飛云,劉春鳳,李崎

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,釀酒科學(xué)與工程研究室,江蘇 無(wú)錫,214122)

高濃釀造是一種在啤酒生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的釀造技術(shù),具有提高產(chǎn)量、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)[1]。酵母在高濃釀造期間面臨多重環(huán)境壓力,主要包括高濃麥汁的滲透脅迫和發(fā)酵后期的乙醇脅迫。與常濃釀造相比,高濃釀造存在發(fā)酵周期長(zhǎng),發(fā)酵度低,麥芽三糖發(fā)酵不完全的問(wèn)題[2],另外殘留的麥芽三糖也會(huì)影響啤酒風(fēng)味。麥汁濃度越高,對(duì)糖化工藝、酵母菌株、發(fā)酵技術(shù)的要求也越嚴(yán)格,因此,在實(shí)際生產(chǎn)中,高濃釀造的原麥汁濃度受到限制。目前,可以通過(guò)調(diào)整釀造條件來(lái)提高酵母活性,比如適當(dāng)提高發(fā)酵溫度[3]、外源添加氨基酸[1]、增加溶氧[4]、提高接種量[5]等,但發(fā)酵工藝的調(diào)整往往會(huì)影響風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[4],因此發(fā)酵性能優(yōu)良的高濃釀造啤酒酵母的選育至關(guān)重要。

高濃釀造啤酒酵母的選育主要從2個(gè)角度出發(fā):一是提高酵母耐受性,高濃釀造的環(huán)境脅迫會(huì)比常濃更加明顯,不少研究通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化的方法,將酵母在高滲透壓[6]、高麥芽糖(或麥芽三糖)[7]或高乙醇[8]培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)30代甚至更久,從而獲得發(fā)酵能力提高的菌株;二是抗葡萄糖阻遏效應(yīng)啤酒酵母的選育,麥汁中主要的糖類(lèi)包括麥芽糖、麥芽三糖和葡萄糖,葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物會(huì)抑制麥芽糖及麥芽三糖利用相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,因此會(huì)出現(xiàn)酵母優(yōu)先利用葡萄糖的現(xiàn)象,即葡萄糖阻遏效應(yīng)[9]。郭立蕓[10]通過(guò)定向進(jìn)化獲得了抗葡萄糖阻遏效應(yīng)的啤酒酵母菌株,該菌株在18 °P麥汁發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵更快;然而,啤酒酵母的發(fā)酵性能本身是一個(gè)復(fù)雜性狀,受環(huán)境因素的影響很大,很難通過(guò)一個(gè)指標(biāo)的提升對(duì)應(yīng)到發(fā)酵性能上,這給選育工作帶來(lái)了一定挑戰(zhàn)。

基因組重排(genome shuffling)由DNA shuffling發(fā)展而來(lái),將重排范圍從特定的基因擴(kuò)大到整個(gè)基因組,無(wú)需了解菌株的基因調(diào)控機(jī)制,是一種基于表型篩選的定向育種技術(shù)[11]。該方法將傳統(tǒng)誘變與原生質(zhì)體相結(jié)合,先借助誘變手段獲得大量突變,再通過(guò)多輪次多親本的原生質(zhì)體融合將正向突變不斷富集,以達(dá)到選育目的。相比傳統(tǒng)誘變,基因組重排的育種效率更高,在微生物育種工作中應(yīng)用廣泛,包括提高代謝物產(chǎn)量[12]、提高底物利用率[13]、增強(qiáng)菌株耐受性[11]等。該技術(shù)也成功應(yīng)用到了酵母選育中,ZHENG等[12]對(duì)釀酒酵母308進(jìn)行了紫外誘變和兩輪原生質(zhì)體融合得到了重排菌株YZ2,該菌株在含0.5%乙酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠生產(chǎn)更多乙醇,產(chǎn)量比308提高了21.6%。YIN等[14]通過(guò)紫外線和NTG組合誘變獲得突變株,對(duì)突變株進(jìn)行了兩輪原生質(zhì)體融合,成功將釀酒酵母的谷胱甘肽產(chǎn)量提高到了原來(lái)的3.3倍。

本研究通過(guò)基因組重排技術(shù)結(jié)合表型篩選選育了一株發(fā)酵性能提升的拉格啤酒酵母,該方法為后續(xù)啤酒酵母選育工作提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

拉格啤酒酵母菌株(Saccharomycespastorianus)G03,由企業(yè)贈(zèng)送,為中國(guó)某啤酒廠使用的工業(yè)酵母。

1.1.2 主要試劑及儀器

葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、EDTA-2Na、CaCl2、蔗糖、PEG-6000、無(wú)水乙醇、NaCl,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蝸牛酶、β-巰基乙醇,索萊寶生物科技有限公司;麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品、麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱,上海博迅公司;無(wú)菌超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)安泰公司;ARTP誘變系統(tǒng),思清源生物科技有限公司;全自動(dòng)啤酒分析儀,安東帕(上海)商貿(mào)有限公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī),德國(guó)艾本德公司;高效液相色譜儀,日本日立公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及溶液配制

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母提取物10;固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉。

麥芽糖培養(yǎng)基(g/L):麥芽糖20,蛋白胨20,酵母提取物10;固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉。

再生培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母提取物10,蔗糖170,瓊脂粉20。

再生軟瓊脂培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母提取物10,蔗糖170,瓊脂粉7。

麥汁培養(yǎng)基:麥汁制備參考文獻(xiàn)[15],以1∶3(g∶mL)的料液比進(jìn)行糖化,制備24 °P麥汁,24 °P麥汁主要糖組分為138 g/L麥芽糖,32 g/L麥芽三糖,23 g/L葡萄糖;33 °P麥汁由24 °P麥汁添加麥芽糖糖漿制得;12 °P麥汁由24 °P麥汁加水稀釋制得,酵母活化及擴(kuò)大培養(yǎng)使用12 °P麥汁進(jìn)行。

0.2% β-巰基乙醇溶液:在PBS溶液中加入β-巰基乙醇,配制體積分?jǐn)?shù)0.2%的β-巰基乙醇溶液。

助融劑(g/L):PEG-6000 300,CaCl21.11。

高滲緩沖液(g/L):蔗糖205.38,用PBS溶解。

10 g/L蝸牛酶液:在高滲緩沖液中加入蝸牛酶配制10 g/L蝸牛酶液,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,4 ℃保存。

4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)溶液(g/L):pNPG 1.506,用PBS溶解。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組重排

1.2.1.1 常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)

將G03接種至YPD培養(yǎng)基活化,轉(zhuǎn)接至100 mL YPD培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)期的菌液進(jìn)行,涂布在麥芽糖平板上,具體操作流程參考張明芳等[16]的方法。

魚(yú)腥草中的揮發(fā)油成分能對(duì)動(dòng)物細(xì)胞中白細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)行強(qiáng)化，提升動(dòng)物血清解毒的作用，進(jìn)而增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，這在動(dòng)物肺炎、動(dòng)物器官性疾病防治中的應(yīng)用較多，效果也比較顯著。

1.2.1.2 突變株篩選

一級(jí)篩選:挑取突變株菌落及G03至YPD培養(yǎng)基,28 ℃搖床培養(yǎng)24 h。調(diào)整OD600為1.0,以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至帶有杜氏小管的20 g/L麥芽糖培養(yǎng)基中,28 ℃靜置培養(yǎng),記錄8 h后的產(chǎn)氣情況。

二級(jí)篩選:將初篩菌株及G03接種至YPD培養(yǎng)基,28 ℃搖床培養(yǎng)24 h。調(diào)整OD600為1.0,以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至96深孔板中,培養(yǎng)基為6%(體積分?jǐn)?shù))乙醇培養(yǎng)基和35%(體積分?jǐn)?shù))麥芽糖培養(yǎng)基,28 ℃搖床培養(yǎng)24 h,測(cè)定OD600。

三級(jí)篩選:將二級(jí)篩選得到的菌株進(jìn)行啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后的酒精度及真正發(fā)酵度。

1.2.1.3 原生質(zhì)體融合

參考文獻(xiàn)[17]和[18]中的方法,酵母菌株活化后,轉(zhuǎn)接到100 mL YPD培養(yǎng)基,培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期。調(diào)整OD600為1.0,吸取2 mL菌液,無(wú)菌水洗滌2次,分別加入1 mL EDTA溶液和1 mL β-巰基乙醇溶液,30 ℃水浴10 min,PBS溶液洗滌2次,加入2 mL蝸牛酶溶液,32 ℃水浴60 min,高滲緩沖液洗滌2次。

將各菌株的原生質(zhì)體懸液(108個(gè)/mL)等體積混合,分別進(jìn)行紫外滅活(超凈臺(tái)紫外燈15 cm處,照射5 min)和熱滅活(60 ℃水浴4 min),各取1 mL不同滅活方式的原生質(zhì)體懸液混合,重懸于2 mL助融劑,28 ℃水浴20 min,高滲緩沖液洗滌2次,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后接種至再生培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)2～4 d。

1.2.1.4 融合菌株篩選

參考1.2.1.2節(jié)中突變株的篩選方法。一級(jí)篩選中產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為高麥芽糖培養(yǎng)基,于11 ℃靜置培養(yǎng),記錄44 h時(shí)產(chǎn)氣情況;二級(jí)篩選中壓力培養(yǎng)基為7%(體積分?jǐn)?shù))乙醇培養(yǎng)基,28 ℃搖床培養(yǎng)48 h,測(cè)定OD600;三級(jí)篩選同突變株的三級(jí)篩選。

1.2.2 菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

將重排菌株活化后轉(zhuǎn)接至24 °P麥汁中,于11 ℃靜置培養(yǎng),記為1代,并在24 °P麥汁中傳代45次,保藏15、30、45代菌株,并進(jìn)行啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其發(fā)酵指標(biāo),分析菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3 啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將菌株接種至麥汁培養(yǎng)基活化,之后轉(zhuǎn)接至200 mL麥汁培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)2 d。收集酵母細(xì)胞,以106CFU/(mL·°P)的接種量接種至含有150 mL高濃麥汁的錐形瓶中,于11 ℃或18 ℃靜置發(fā)酵,每組3個(gè)平行。錐形瓶鏈接發(fā)酵栓,并用無(wú)菌水液封,模擬啤酒發(fā)酵過(guò)程。每24 h稱(chēng)取錐形瓶質(zhì)量,計(jì)算每日CO2失重,當(dāng)失重<0.1 g/100 mL時(shí),可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。

1.2.4 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

1.2.4.1 酒精度及發(fā)酵度測(cè)定

取50 mL發(fā)酵樣品,過(guò)濾除氣,使用啤酒分析儀Anton Pear 4500M檢測(cè)啤酒的酒精度及真正發(fā)酵度。

1.2.4.2 風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后將酒液過(guò)濾,以3-庚酮為內(nèi)標(biāo),利用氣相的方法測(cè)定啤酒中幾種主要風(fēng)味物質(zhì)的含量[19]。

1.2.4.3 主要糖含量的測(cè)定

利用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后的麥芽糖及麥芽三糖含量。發(fā)酵液離心取上清液,添加無(wú)水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為70%,8 000 r/min離心3 min,上清液用于高效液相色譜分析。流動(dòng)相為純水,流速0.3 mL/min,采用示差折光檢測(cè)器,進(jìn)樣量10 μL,色譜柱Wares Sugar-pak1TM6.5 mm(ID)×300 mm Column,柱溫85 ℃。

1.2.5 α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)活性的測(cè)定

α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)活性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[2]并稍作修改,反應(yīng)體系:36 μL菌液+144 μL 5 mmol/L pNPG溶液,30 ℃水浴反應(yīng)90 min。離心取120 μL上清液,加入80 μL 1 mol/L的Na2CO3測(cè)定OD400值。

1.2.6 基因表達(dá)量的測(cè)定

利用RT-qPCR測(cè)定α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)基因的相對(duì)表達(dá)量,具體操作參考文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本文庫(kù)的構(gòu)建

首先繪制ARTP處理時(shí)G03的致死率曲線(圖1),當(dāng)誘變時(shí)間為40 s時(shí),致死率為89.9%,40 s之后,菌株死亡率均接近100%。為了獲得較高突變率,選擇ARTP誘變時(shí)間為40 s。選擇生長(zhǎng)較好的99個(gè)突變菌在2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察菌株產(chǎn)氣情況。杜氏小管實(shí)驗(yàn)?zāi)芨鶕?jù)產(chǎn)氣情況判斷菌株的起酵速度及發(fā)酵能力,以G03為對(duì)照,篩選可以快速發(fā)酵麥芽糖的菌株。如表1所示,G03產(chǎn)氣量為“+++”,共有34株突變株產(chǎn)氣速度比G03快。

表1 不同篩選階段的菌株的產(chǎn)氣量分布(菌株個(gè)數(shù))Table 1 Gas production distribution (number of strains) at different screening stages

圖1 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變G03致死曲線Fig.1 The ARTP fatality curve of G03

酵母的抗逆能力與高濃釀造時(shí)的發(fā)酵性能有很大聯(lián)系,耐乙醇能力強(qiáng)的菌株中細(xì)胞膜相關(guān)基因的數(shù)量更多,基因的表達(dá)也更強(qiáng),而且還和不飽和脂肪酸合成途徑及氨基酸代謝途徑有關(guān),從而改變了菌株的發(fā)酵性能[20]。將這些菌株分別接種至高麥芽糖培養(yǎng)基和乙醇培養(yǎng)基,進(jìn)行耐受性分析,結(jié)果如表2所示,選定麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%,乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%為篩選條件,此時(shí)G03生長(zhǎng)受到抑制。突變株在上述2種壓力培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖2所示。其中,33株突變株抗?jié)B透壓能力優(yōu)于G03,22株突變株抗酒精能力優(yōu)于G03,選擇OD600在高糖培養(yǎng)基中提高5%、在乙醇培養(yǎng)基中提高3%的14株突變株進(jìn)行24 °P麥汁發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

表2 G03在不同壓力下的生長(zhǎng)情況Table 2 The growth of G03 under different stresses

a-35%麥芽糖培養(yǎng)基;b-6%乙醇培養(yǎng)基

跟蹤發(fā)酵過(guò)程中的失重以及發(fā)酵結(jié)束后酒精度、發(fā)酵度結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn),有6株突變株發(fā)酵能力提高。G-40及G-41發(fā)酵結(jié)束用時(shí)11 d,比G03提前1 d結(jié)束發(fā)酵。其他菌株發(fā)酵周期與G03相同,但酒精度及發(fā)酵度均有所提高,其中G-33的酒精度和真正發(fā)酵度,分別比G03提高了2.9%和2.5%。經(jīng)過(guò)ARTP誘變,菌株的發(fā)酵能力提升很有限,因此需要通過(guò)后續(xù)的重排來(lái)進(jìn)一步提升菌株發(fā)酵性能。

表3 G03及突變株在24 °P麥汁發(fā)酵時(shí)的酒精度及真正發(fā)酵度Table 3 Alcohol content and real attenuation of G03 and mutant strains in 24 °P wort fermentation

2.2 第一輪重排

以上述6株發(fā)酵能力改善的突變株為第一輪重排的親本,共獲得了83個(gè)F1代菌株。前期研究中發(fā)現(xiàn),在麥芽糖培養(yǎng)基中產(chǎn)氣速度快的菌株在高麥芽糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況也較好,因此將重排后的菌株在24%的高麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察產(chǎn)氣情況,并在11 ℃下進(jìn)行模擬拉格啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

選擇真正發(fā)酵度及酒精度最高的G-33和發(fā)酵周期縮短1 d的G-40為對(duì)照菌株,對(duì)F1代菌株進(jìn)行篩選。2個(gè)對(duì)照菌株中,G-33和G-40的產(chǎn)氣量分別為“+++”、“++”,G-33產(chǎn)氣速度快,G-40的乙醇耐受性好。結(jié)果發(fā)現(xiàn),F1代菌株中有21個(gè)菌株產(chǎn)氣速度較G-33快(表1),對(duì)這21株菌進(jìn)行乙醇耐受性篩選,發(fā)現(xiàn)有10個(gè)菌株的乙醇耐受能力高于G-40(圖3)。進(jìn)一步將這10株菌進(jìn)行24 °P麥汁發(fā)酵,結(jié)果如表4所示,F1-9和F1-77的發(fā)酵能力較好,其中F1-9的酒精度比G-33提高了3.4%,真正發(fā)酵度提高了1.9%;與親本菌株G03相比,分別提高了5.9%和4.9%。

表4 第一輪融合菌株(F1)在24 °P麥汁發(fā)酵時(shí)的酒精度及真正發(fā)酵度Table 4 Alcohol content and real attenuation of the first generation fusants (F1) in 24 °P wort fermentation

圖3 第一輪融合菌株(F1)在7%乙醇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of the first generation fusants (F1) in 7% ethanol medium

2.3 第二輪重排

在基因組重排過(guò)程中,為了提高遺傳多樣性,可以將之前輪次中表現(xiàn)優(yōu)異的菌株繼續(xù)用于后續(xù)重排[21],因此,誘變獲得的G-33、G-40與F1-9、F1-77共同參與第二輪原生質(zhì)體融合。融合后共獲得了126個(gè)F2代菌株,第二輪篩選進(jìn)一步將麥芽糖培養(yǎng)基濃度提高至26%。結(jié)果發(fā)現(xiàn),F1-9的產(chǎn)氣量為“+++”,共有21個(gè)F2代菌株產(chǎn)氣速度較F1-9快(表1)。進(jìn)一步進(jìn)行乙醇耐受性實(shí)驗(yàn),有8個(gè)F2代菌株的乙醇耐受能力比F1-9好(圖4)。24 °P麥汁發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,F2-123的發(fā)酵能力有較高的提升(表5),比F1-9提前1 d結(jié)束發(fā)酵,酒精度和真正發(fā)酵度比F1-9分別提高了2.2%和1.3%,比親本菌株G03提高了8.2%和6.4%?？梢钥吹?基因組重排過(guò)程中,菌株在每一次篩選后都有一定程度的改善,多親本多輪次的原生質(zhì)體融合實(shí)現(xiàn)了不同菌株中的有益遺傳特性的組合[11],因此F2-123相比G03發(fā)酵性能有了明顯提高。

表5 第二輪原生質(zhì)體融合菌株(F2)在24 °P麥汁發(fā)酵時(shí)的酒精度及真正發(fā)酵度

圖4 第二輪融合菌株(F2)在7%乙醇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of the second generation fusants (F2) in 7% ethanol medium

2.4 基因組重排菌株的發(fā)酵性能評(píng)價(jià)

2.4.1 24 °P麥汁啤酒發(fā)酵

分析了不同基因組重排階段的菌株在24 °P麥汁中的發(fā)酵情況(表6),與G03相比,F2-123、F1-9、F1-77和G-33的發(fā)酵液中殘余麥芽糖及麥芽三糖含量均不同程度降低,它們的酒精度及發(fā)酵度均有所提高。其中F2-123比G03提前1 d結(jié)束發(fā)酵,并且麥芽糖利用率從85.4%提高到92.2%,麥芽三糖利用率從72.8%提高到78.9%;酒精度提高了8.9%,真正發(fā)酵度提高了6.5%。賀秀麗等[22]將酵母在乙醇環(huán)境中馴化,得到的菌株在22 °P,14 ℃下發(fā)酵周期縮短了42 h,酒精度比原始菌株提高了2.0%。YU等[23]利用EMS誘變提高了酵母的發(fā)酵性能,雖然該菌株在24 °P,12 ℃中發(fā)酵周期縮短了6 d,但依然長(zhǎng)達(dá)22 d,酒精產(chǎn)量?jī)H提高了1.5%。HUUSKONEN等[7]獲得的菌株在24 °P發(fā)酵中酒精度比原始菌株提高了2.3%～6.1%。在一些研究中,高濃釀造菌株多被應(yīng)用到15 °P麥汁發(fā)酵[6,8,21]。本研究的菌株在較高濃度麥汁的低溫發(fā)酵中表現(xiàn)優(yōu)異,并且在發(fā)酵周期縮短1 d的情況下酒精度提高了8.9%,由此可見(jiàn),菌株得到了明顯改善。

表6 基因組重排菌株24 °P麥汁發(fā)酵情況Table 6 The fermentation performance of different strains obtained from genome shuffling in 24 °P wort

啤酒的風(fēng)味成分是啤酒的一個(gè)重要質(zhì)量指標(biāo),因此我們還比較了用不同菌株發(fā)酵的啤酒中幾種主要的醇酯含量(表6)。與G03相比,其他菌株的風(fēng)味物質(zhì)含量沒(méi)有大幅度的變化,基本保持了原有的醇酯比,這也表明基因組重排的育種方式在提高菌株發(fā)酵能力的情況下較好地保持了菌株原有的風(fēng)味特性。

2.4.2 33 °P啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)F2-123在更高濃度的麥汁中發(fā)酵的潛能,進(jìn)行了33 °P(18 ℃)超高濃麥汁發(fā)酵,發(fā)酵情況如表7所示。F2-123在33 °P麥汁中發(fā)酵周期為10 d,G03為11 d,且發(fā)酵結(jié)束時(shí)的酒精度及發(fā)酵度分別比G03提高了9.2%和8.9%,同樣,與24 °P發(fā)酵類(lèi)似,2株菌的風(fēng)味特性無(wú)明顯差異。由此可見(jiàn),F2-123在超高濃麥汁發(fā)酵時(shí)依然能夠縮短發(fā)酵周期,并且提高發(fā)酵度,具有一定的應(yīng)用潛力。

表7 F2-123和G03的33 °P麥汁發(fā)酵情況Table 7 The fermentation performance of F2-123 and G03 in 33 °P wort

2.5 基因組重排菌株的遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

本研究以ARTP誘變?yōu)榛A(chǔ)構(gòu)建突變子文庫(kù)進(jìn)行基因組重排,獲得了發(fā)酵能力提升的F2-123菌株,進(jìn)一步將該菌株在24 °P麥汁中傳代培養(yǎng),共轉(zhuǎn)接45次,并將第15代、30代和45代菌株用于24 °P麥汁發(fā)酵,結(jié)果如表8所示。F2-123在傳代過(guò)程中發(fā)酵性能較穩(wěn)定,和G03比,發(fā)酵周期縮短了1 d;F2-123發(fā)酵液酒精度穩(wěn)定在10.3%～10.4%,比G03提高了7.5%左右;真正發(fā)酵度穩(wěn)定在62%～63%,比G03提高了6.0%左右。同時(shí)測(cè)定了啤酒中主要的幾種風(fēng)味成分,不同代數(shù)之間,主要風(fēng)味物質(zhì)的含量無(wú)較大差異。由此可以說(shuō)明,F2-123在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中能夠穩(wěn)定地復(fù)制分裂,具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

表8 F2-123在24 °P麥汁中傳代發(fā)酵情況Table 8 Serial fermentation performance of F2-123 in 24 °P wort

2.6 基因組重排菌株的糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析

酵母利用麥芽糖和麥芽三糖的第一步是將糖分子轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi),該過(guò)程需借助α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,這也是酵母利用這2種糖的限速步驟[2]。菌株的α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)活性測(cè)定結(jié)果(圖5)表明,相比G03,F2-123在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均顯示更高的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,比G03提高了34.2%～194.5%。對(duì)應(yīng)的,F2-123的α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因MALx1、MTY1、SeAGT1的表達(dá)量均比G03高。一方面,高轉(zhuǎn)運(yùn)活性使酵母細(xì)胞更快地利用麥芽糖及麥芽三糖,同時(shí)緩解前期的滲透壓力,另一方面,菌株耐受能力的提高保證了細(xì)胞的活力,研究發(fā)現(xiàn)這有助于α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)[6],從而提高菌株發(fā)酵能力。

a-α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)活性;b-α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)基因相對(duì)表達(dá)量

3 結(jié)論

高濃釀造技術(shù)是啤酒工業(yè)中常用的釀造技術(shù)手段,除工藝調(diào)整外,發(fā)酵性能優(yōu)良的啤酒酵母對(duì)提高高濃釀造效率,提升啤酒品質(zhì)有重要的意義。在啤酒酵母選育工作中,許多研究通過(guò)提高酵母耐受性以獲得高濃釀造發(fā)酵能力提高的菌株,誘變及適應(yīng)性進(jìn)化是常用的育種手段。然而酵母的發(fā)酵性能受到多項(xiàng)因素的影響,僅通過(guò)一輪誘變很難達(dá)到育種目的,往往需要經(jīng)歷長(zhǎng)期的篩選,育種時(shí)間長(zhǎng)。正如本研究中,酵母經(jīng)過(guò)ARTP誘變后即使耐受酒精及高麥芽糖脅迫的能力增強(qiáng),但發(fā)酵性能提升并不明顯。然而在后續(xù)的2輪重排中將所有具有正向突變的菌株借助原生質(zhì)體融合進(jìn)行基因重組,經(jīng)過(guò)篩選獲得了較理想的菌株。這種方式擴(kuò)大了遺傳多樣性,加速了菌株進(jìn)化,育種效率大大提高。

最終,以拉格啤酒酵母G03為出發(fā)菌株,利用基因組重排技術(shù)成功選育了1株在高濃釀造(24 °P,11 ℃)下發(fā)酵速度及發(fā)酵度均提高的酵母F2-123。F2-123的發(fā)酵周期為11 d,比G03縮短了1 d,酒精度和真正發(fā)酵度分別比G03提高了8.9%和6.5%,且菌株的風(fēng)味特性沒(méi)有受到明顯影響。F2-123在24 °P麥汁中傳代發(fā)酵性能穩(wěn)定,具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力。