基于HS-SPME-GC-MS對傳統剁椒發酵過程中揮發性成分和關鍵香氣物質分析

何旭峰,易良鍵,鄭容,王圣開,周祥德,熊雙,黃小蘭*,冉光榮

1(重慶市萬州食品藥品檢驗所,重慶,404100)2(重慶市萬州區伴神釀造有限公司,重慶,404130)

辣椒(CapsicumannuumL.)為一年生茄科草本植物,在我國四川、貴州、重慶、河南、湖南、寧夏、新疆等地均有大量種植,總面積超2 000萬畝,占全球的1/3,總產量4 000萬t,占世界辣椒總產量的一半以上[1]。辣椒含有豐富的營養物質,是維生素的主要來源,尤其是維生素C含量特別突出,具有開胃消食、驅寒除濕、抗氧化、降血壓等作用[2-3],辣椒加工品主要有干辣椒、辣椒粉、泡椒、剁椒、辣椒醬等[4]。其中剁椒是辣椒的加工制品之一,在嗜辣群體集中、調味品市場豐富的川渝地區,剁椒憑借其獨特的口感與風味及其潛在的消費市場,成為調味品市場中的后起之秀。傳統剁椒以辣椒為原料,經清洗、剁碎、腌制等前處理,再按比例加入蒜末、姜末、食鹽、白酒及白砂糖等輔料,攪拌混勻,入壇密封,由天然附著菌種自然發酵而成。可用于重慶小面、羊肉米粉、剁椒魚頭、萬州烤魚、涼粉等餐飲食品,也可直接拌飯食用,亦是萬州烤魚調料的重要原料,香氣突出,風味獨特,深受人們喜愛[5]。

剁椒風味是評價其質量優劣、影響消費者購買的重要指標[6],其形成過程受眾多因素的影響,如辣椒品種[7-9]、腌制鹽度[10-12]、發酵方式及菌種[4,13]等,是復雜而微妙的。同時剁椒作為微生物發酵產品,發酵環境、發酵時間也是影響風味的關鍵因素,羅鳳蓮[14]發現湖南剁椒自然發酵1～4周,其揮發性風味物質種類和含量差異顯著;崔桂娟[15]進一步研究發現發酵第18天時,剁椒揮發性組分多達148種,酯類物質種類最多,烯烴類含量最高;肖何等[6]揭示了湖南不同產地農家剁辣椒的品質和風味存在明顯差異性;這說明發酵環境和時間對自然發酵剁椒的風味影響較大。而川渝地區近年來受三峽庫區的影響,形成了高溫高濕的自然環境,自然發酵過程中傳統剁椒的風味變化未見相關文獻報道。

因此,本研究選取具有代表性的萬州傳統剁椒為研究對象,采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用技術(headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)[16-17],對不同發酵時間自然發酵剁椒的揮發性成分進行測定分析,篩選出關鍵性香氣物質,并進行相關性分析,旨在為萬州傳統剁椒的標準化生產提供依據,同時為川渝地區剁椒質量分析提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬州傳統剁椒,重慶市萬州區伴神釀造有限公司;色譜純仲辛醇,上海麥克林生化科技有限公司;其余試劑為分析純,成都市科隆化學品有限公司;水為實驗室自制純水。

1.2 儀器與設備

7000C型氣相色譜-質譜聯用儀,美國安捷倫公司;PAL3自動進樣平臺,CTC分析儀器股份公司;50 μm膜厚的Divinylbenzenne/Carboxen/PDMS頂空固相微萃取頭,美國Supelco公司;Milli-Q Advantage A10型超純水機,密理博中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統剁椒工藝流程

將辣椒洗凈、晾干,剁成2 mm×2 mm的顆粒,將二青條和小米辣以7∶3的質量比混合,再加入輔料(食鹽10%,大蒜10%,姜10%,白糖2.5%,質量分數)攪拌均勻,裝壇密封,發酵。

分別于密封發酵0、10、20、30、40、50和60 d后采集樣品,依次編號為F0、F10、F20、F30、F40、F50、F60,樣品經均質后置于-80 ℃保存備用。

1.3.2 感官評價

選擇8位經過培訓的人員組成感官評價小組,分別對剁椒的色澤、脆度、香氣、滋味4個方面按照表1的評分標準進行打分,結果取平均值。

1.3.3 揮發性成分的測定

固相萃取條件:精密稱取剁椒樣品2 g(精確至0.000 1 g)置于20 mL頂空瓶中,加入3 mL飽和NaCl溶液,加入200 μg/mL仲辛醇內標溶液40 μL后密封,于保溫套中以50 ℃加熱平衡15 min。將已老化好的萃取頭插入頂空瓶中,頂空吸附20 min,保溫和吸附期間時時振搖,振搖速度為700 r/min。吸附完成后將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口,250 ℃解吸5 min。

氣相條件:色譜柱為安捷倫石英毛細管柱DB-heavyWAX(30 m×250 μm×0.32 μm);升溫程序:初始溫度40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升溫至120 ℃,120 ℃保持10 min,以2 ℃/min升溫至200 ℃,后以5 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min。載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);流速2.0 mL/min;進樣口溫度250 ℃。

質譜條件:離子源為電子轟擊源(electron ionization,EI),電子能量70 eV,離子源溫度300 ℃,傳輸線溫度250 ℃,質量掃描范圍為m/z40～500。

定性:利用安捷倫MassHunter Workststion Software對原始數據進行處理和分析,結合NIST20(National Institute of Standards and Technology 2020)數據庫對揮發性成分進行初步鑒定,再結合相關文獻進行圖譜解析完成揮發物的最終定性。

定量:以仲辛醇為內標,采用內標法按公式(1)計算每個組分的絕對含量:

(1)

式中:w,單一成分絕對含量,mg/kg;A1,單一成分峰面積;A2,內標峰面積;ρ2,內標質量濃度,μg/mL;V2,內標體積,μL;m,樣品質量,g。

1.3.4 揮發性成分香氣活度值(odor activity value, OAV)計算

待確定每個揮發性成分絕對含量后,通過化合物嗅覺閾值匯編[18]檢索每個揮發性成分的香氣閾值,按公式(2)計算揮發性成分的OAV:

OAVi=wi/Ti

(2)

式中:wi,某一化合物的含量,mg/kg;Ti,某一化合物氣味閾值,mg/kg。

1.4 數據處理

采用MassHunter Workststion Software Qualitative Analysis(B.07.00 SP 2,美國安捷倫),Microsoft Excel 2016和SPSSPro在線分析軟件(https://www.spsspro.com/)對測定數據進行處理和作圖。

2 結果與討論

2.1 傳統剁椒感官分析

在發酵過程中,剁椒感官特征發生了較為明顯的變化,由表2可知,發酵初期F0樣品綜合評分最低為58.6分,此時辣椒剛粉碎,水分含量高、色澤艷麗、口感清脆,但發酵尚未開始,剁椒中酸味物質含量低,姜蒜的呈味物質也未充分釋放,因此氣味單一,辛辣沖鼻,滋味不協調。F50樣品的感官評分最高為81.4分,香氣、滋味表現最好,發酵時長對剁椒香氣和滋味影響較大,隨著發酵的深入,辣椒、生姜和大蒜中的揮發性物質得到了充分釋放,剁椒發出豐富的果香、蒜香和乳酸發酵香氣;滋味咸度適中、酸甜協調,爽口宜人;色澤和脆度的下降,可能與辣椒細胞脫水、果膠含量下降有關[19]。

表2 傳統剁椒感官評分Table 2 Sensory evaluation of traditional chopped peppers

2.2 揮發性成分分析

傳統剁椒揮發性成分通過GC-MS分析,總離子流圖如圖1所示,物質出峰時間主要在1～110 min,部分鑒定結果見表3(完整數據見電子增強出版附表https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036204)。

圖1 傳統剁椒發酵60 d后揮發性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of traditional chopped pepper after 60 d of fermentation

在剁椒發酵期間共分離鑒定出106種揮發性成分,其中烯類38種、酯類22種、醇類10種、醛類7種、硫化物15種、其他類(包括醚類、酮類、酚類、酸類、烷烴類)14種。

烯類為揮發性成分中含量最高的物質,這與崔桂娟[15]對湖南剁椒的研究結果一致,主要來自辣椒和姜,隨著發酵時間的延長占比下降并穩定在61.3%左右。姜烯含量最高,約占烯類物質的23.2%,這與石華治等[20]的研究一致。姜烯是一種源自生姜的單環倍半萜烯,具有神經保護潛能、保護心臟和抗癌活性[21-22]。β-倍半水芹烯、α-姜黃烯、β-水芹烯在發酵完成后含量分別增加了27%、23%、33%,而檸檬烯則下降了95%,γ-萜品烯下降至未檢出。檸檬烯易發生氧化降解和微生物轉化,能轉化為香氣更濃郁的氧化單環單萜[23]。發酵過程中,烯類由32種增加到33種。

酯類主要由發酵過程中的酸類與醇類脫水酯化和氨基酸降解而來[24],在發酵初期占總揮發性成分的3.8%,發酵結束后增加并穩定在7.3%左右。酯類以乙酯為主,其中反式-4-癸烯酸乙酯含量最高,約占22.1%,是具有白蘭地風味和梨香的天然香料。反式-4-癸烯酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和8-甲基壬酸乙酯的含量發酵完成后分別增加了120%、169%、117%和171%。發酵過程中,酯類由18種增加到21種。

硫化物類主要來自大蒜[25],發酵初期占比為19.8%,隨后增加并穩定在25.3%左右,其中二烯丙基二硫醚與烯丙基(E)-1-烯基二硫化物互為同分異構體,發酵結束時共占硫化物類的53%。二烯丙基二硫醚存在于洋蔥、大蒜等中,呈大蒜特殊氣味,可作為食品添加劑,具有抗腫瘤、抗菌作用[26]。發酵過程中烯丙基(E)-1-烯基二硫化物、二烯丙基三硫醚、1,2-二硫酚發酵完成后含量分別增加了20%、138%、56%。發酵過程中,硫化物類由11種增加到15種。

醛類在發酵初期占總揮發性成分的2.7%,隨后減少并穩定在1.5%左右。檸檬醛在醛類揮發成分中占比最高,隨著發酵時間的延長其占比由87.2%下降到了75.0%。檸檬醛存在于多種植物的葉和果實中[27],在酸性條件下易發生系列轉化,轉化為單萜醇和芳香化合物。發酵過程中除反式-2,4-癸二烯醛含量增加外,其他醛類成分含量呈下降趨勢,如2-己烯醛、香茅醛最終未檢出。反式-2,4-癸二烯醛主要來自姜,具有堅果和脂肪香氣,對食物的香氣起著重要的作用。發酵過程中,醛類由6種減少到5種。

醇類為含量較低的揮發性成分,主要由糖和氨基酸代謝而來[28],含量呈下降趨勢,發酵結束時占總揮發性成分的1.0%。醇類中左旋龍腦占比較大,約為36.8%,其發酵60 d時含量與發酵初期相比下降了37%。左旋龍腦主要來自姜,具有松香、樟腦樣氣味,具有抗細胞凋亡、抗氧化和神經保護作用。芳樟醇在辣椒、姜、蒜均含有,為重要的香料化合物,具有甜嫩新鮮的花香,為剁椒發酵初期的重要香氣成分,因芳樟醇易氧化,在發酵30 d后含量下降至未檢出。

其他類包括醚、酸、烷烴、酮、酚類,這類物質發酵結束時約占總揮發性成分的3.3%。發酵結束時2-甲基十三烷和二甲醚含量較高,約占其他類揮發成分的33%和30%。β-紫羅蘭酮為重要的天然香料,具有抗癌、抗炎、抗氧化等多種生物活性[29],它天然存在于辣椒和姜中,也可由檸檬醛轉化而來,雖然僅占其他類的5.4%,由于香氣閾值極低,使其成為剁椒中最為重要的香氣成分。

由圖2-a可知,揮發物總量呈先升高后下降的趨勢,在發酵50 d時揮發物總量最大為506.25 mg/kg,在整個發酵過程中烯類占比最高,硫化物、酯類次之。從圖2-b可知,烯類占比顯示出先下降再穩定的特點,在發酵第10天開始穩定在63%左右,硫化物類和酯類則呈現為先上升再穩定情況,硫化物類在發酵第10天開始穩定在25%,酯類在第20天時開始穩定在6.9%左右。醇類、醛類和其他類物質相對含量較低,在0.9%～3.6%。

a-各類揮發性成分的含量;b-各類揮發性成分的相對含量

2.3 不同發酵時間香氣物質的OAV分析

揮發性成分含量的多少并不能直接反映其對香氣貢獻的大小,一般通過計算該物質的OAV反映其對香氣的貢獻。通常認為OAV>1時,該化合物對總體香氣可能有貢獻價值,OAV越大,則對香氣的貢獻就越大[30]。部分物質香氣閾值和OAV見表4(詳細數據見電子增強出版附件),其中OAV>1的關鍵香氣物質有30種,包括酮、烯、硫化物、醇、酚、醛、酯、烷烴類物質。

表4 傳統剁椒香氣成分的氣味描述、香氣閾值及OAV Table 4 Odor description, aroma threshold and OAV of aroma components of traditional chopped pepper

在初期的原料中,OAV>1關鍵香氣物質有23種,以β-紫羅蘭酮、反式-2,4-癸二烯醛、芳樟醇、2-己烯醛、月桂烯、檸檬烯等成分香氣貢獻較高,香氣特征主要以果香、花香為主;發酵20 d時,OAV>1的關鍵香氣物質有29種,與發酵初期比增加了二甲基三硫醚、丁香酚等成分,香氣特征以果香、花香為主,伴有辛辣香、蒜香;發酵40和60 d時,OAV>1的關鍵香氣物質有27種,芳樟醇和2-己烯醛含量下降至未檢出,香氣特征基本穩定,表現為以果香、花香為主,兼有辛辣香、蒜香和焦香。

2-己烯醛、檸檬烯具有濃郁的水果香氣和鮮橙子香氣,因其含量隨著發酵時間的延長快速下降,因此為發酵初期的主要香氣成分。月桂烯具有甜橘味和香脂氣,β-水芹烯具有焦香味,二甲基三硫醚呈強烈的薄荷氣味和濃烈辛辣香,二烯丙基二硫醚則具有大蒜特殊氣味,β-紫羅蘭酮和反式-2,4-癸二烯醛呈現濃郁的木香、水果香。綜上可知,成熟剁椒的關鍵香氣成分為β-紫羅蘭酮、反式-2,4-癸二烯醛、二甲基三硫醚、月桂烯、β-水芹烯、丁香酚、二烯丙基二硫醚,以上物質是剁椒具有濃郁果香、花香和辛辣香的關鍵。

2.4 不同發酵期關鍵香氣物質的相關性分析

將對香氣貢獻較大(OAV>100)的11種主要香氣成分進行Spearman相關性分析,結果見表5。從表中可知,2-己烯醛與檸檬烯呈極顯著正相關,與芳樟醇呈顯著正相關,且含量變化趨勢均為減小,這可能是由于這3種物質都主要來源于辣椒,辣椒含水量高、易粉碎,揮發成分較易析出,在發酵初期含量較高,隨著發酵的深入這些物質不斷揮發、氧化降解[31],含量逐漸下降,這一現象與發酵初期香氣特征以果香、木香為主的情況相符。β-水芹烯與二烯丙基二硫醚呈極顯著正相關,β-紫羅蘭酮與丁香酚呈顯著正相關,含量同步增加,推測原因是這些成分主要來自姜和蒜。姜蒜結構緊實、纖維豐富、含水量低,揮發成分需逐漸釋放,這也與發酵后期香氣特征以果香、辛香、蒜香為主的情況相符。β-紫羅蘭酮、丁香酚和檸檬醛都主要來自姜,但檸檬醛與β-紫羅蘭酮和丁香酚卻呈極顯著負相關,這主要是因為檸檬醛在酸性條件下穩定性差,易發生氧化降解,轉化為β-紫羅蘭酮等物質。

表5 主要香氣成分相關系數表Table 5 Correlation coefficient table of main aroma components

3 結論

本研究利用HS-SPME-GC-MS技術對不同發酵時間萬州傳統剁椒中揮發性成分進行了檢測,發現揮發性成分由烯類、硫化物類、酯類和少量的醛類、醇類物質組成,物質種類和含量在不同時間均有差異,在發酵初期最少,發酵50 d時揮發性成分種類和含量達到最大并趨于穩定。對結果分析可知,不同發酵時長的剁椒中香氣物質、香氣特征均存在一定差異。通過計算OAV,篩選出不同發酵時間剁椒的關鍵香氣物質,發現β-紫羅蘭酮、反式-2,4-癸二烯醛為各發酵階段共有的關鍵香氣物質,未發酵時關鍵香氣成分還有芳樟醇、2-己烯醛、月桂烯、檸檬烯,發酵60 d后關鍵香氣物質變為二甲基三硫醚、月桂烯、β-水芹烯、丁香酚,關鍵香氣物質的改變導致香氣特征由木香、柑橘香、花香轉變為以木香、果香為主伴有辛辣香、焦香和蒜香。發酵過程有利于剁椒中揮發性成分充分釋放,使剁椒的香氣更豐富。通過本研究,可為自然發酵下傳統剁椒的品質提高和標準化生產提供科學依據。