“金花菌”(Aspergillus chevalieri)發酵牡丹花瓣過程中揮發性物質及酚酸類物質變化

李學震,劉光鵬,馬艷蕊,姚旖旎,孟園,趙巖,和法濤

(中華全國供銷合作總社 濟南果品研究所,山東 濟南,250220)

牡丹花(PaeoniasuffruticosaAndr.)作為食用性花卉深受大眾的喜愛,尤其在女性群體中還可用作傳統中醫藥治療月經不調和腹痛[1]。現代研究表明,牡丹花瓣中富含多酚和黃酮類物質,這些物質與清除自由基[2]、抑制癌細胞[3]、消炎[4]和降低血糖[5]等活性密切相關。酚酸類物質在植物中的合成途徑主要包括磷酸戊糖途徑、莽草酸途徑和苯丙素途徑,它們通常帶有一個或多個芳香環,且至少有一個羥基基團[6]。黃酮類物質是通過至少2個碳原子連接多個酚羥基苯環結構,它們是牡丹花瓣中主要的天然色素,特別是花青素能應用到食品中[7]。牡丹花的香氣主要由醛類、醇類、酯類和烷烴類構成,還有少數酮類、酸類、烯烴類物質,這些香氣成分中醇類物質對牡丹香氣有較大貢獻[8-9]。

茯磚茶在我國有400多年的歷史,“金花菌”是從其中分離出來的一類有益菌,它也是茯磚茶漫長發酵過程中的優勢菌[10]。有研究表明,在茯磚茶發酵過程中“金花菌”能顯著降低碳水化合物、氨基酸、有機酸、核苷等化合物的含量,增加有機酸類化合物含量,同時提供木香、花香、冬青油香、蘑菇香和果香[11-12]。目前,“金花菌”的研究大多集中在茯磚茶發酵、菌株胞外活性物質鑒定和菌種分類學的研究上[13]。因此,“金花菌”在花茶發酵、酒類、醋類、調味品的釀造與功能食品的開發方面還有待進一步研究。在之前的研究中,我們在茯磚茶中分離出“金花菌”,該菌株能在牡丹花瓣上生長,并能提高牡丹花瓣多酚、黃酮的提取得率,并賦予花瓣“金花菌”的清香。因此,我們進一步研究該菌株發酵牡丹花瓣過程中酚類物質和香氣的變化規律,為牡丹花瓣的加工和品質控制提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

“金花菌”(Aspergilluschevalieri)分離自茯磚茶,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),保藏號:CGMCCNo.23051;牡丹花(干燥),山東省悅如農業發展有限公司;馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth,PDB)培養基,北京索萊寶生物科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;NaCl(分析純),天津大茂化學試劑廠;沒食子酸、兒茶素、阿魏酸等分析標準品,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPL-250型氣相離子遷移色譜儀,德國G.A.S.公司;Thermo Vanquish UHPLC型高效液相色譜儀、Q-Exactive HF型高分辨質譜,賽默飛世爾科技有限公司;ME-104型分析天平,梅特勒托利多儀器有限公司;BSC-150型恒溫培養箱、YXQ-LS-100A型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實業有限公司醫療設備廠;ZWYR-2112B型恒溫調速搖床柜,上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 “金花菌”種子液的制備

取保藏于-80 ℃冰箱的“金花菌”液體種子,接入PDB培養基中活化5～7 d,培養溫度28 ℃,搖床轉速180 r/min,待菌絲布滿搖瓶中,根據GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》,得到菌落數約為1.8×109CFU/mL的種子液。

1.3.2 “金花菌”發酵牡丹花瓣的制備

取20 g牡丹花瓣于三角瓶中,置于滅菌鍋中100 ℃滅菌10 min,加入16 mL“金花菌”種子液,發酵溫度28 ℃,分別設置A組(未發酵)、B組(發酵3 d)、C組(發酵5d)、D組(發酵7 d)、E組(發酵9 d)、F組(發酵11 d)(每組設置3個平行)。發酵好的牡丹花瓣放入50 ℃干燥箱內烘干,研磨過60目篩,置于干燥器內備用。

1.3.3 GC-IMS檢測揮發性成分

參考劉強等[14]的方法并稍作修改。分別稱取0.5 g各組別花瓣粉末于20 mL頂空進樣瓶中,加入1 mL飽和NaCl溶液,每組設置3個平行,以500 r/min的轉速,在60 ℃條件下孵育15 min后開始進樣。

GC-IMS條件:MXT-5氣相色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),IMS溫度45 ℃,色譜柱溫度60 ℃,進樣針溫度85 ℃,載氣/漂移氣N2(純度99.999%),分析時間20 min,進樣體積500 μL。

氣相色譜條件:0～2 min,漂移氣150 mL/min,載氣2 mL/min;2～10 min,漂移氣150 mL/min,載氣2～10 mL/min;10～20 min,漂移氣150 mL/min,載氣10～100 mL/min。

1.3.4 HPLC-MS酚類物質定性和定量檢測

參考GARCIA等[15]的方法并稍作修改。分別稱取0.1 g各組別花瓣粉末加入4 mL 70%(體積分數)甲醇溶液超聲波提取10 min,提取2次,1 mL上清液過0.22 μm濾膜裝入進樣瓶中,每組設置3個平行。色譜條件:色譜柱為Sigma HPLC Column色譜柱(500 mm×3.0 mm×2.7 μm),柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min,0.1%(體積分數)的甲醇水為流動相A,乙腈為流動相B,進樣量10 μL。

1.3.5 數據處理與分析

GC-IMS儀器中配備的Vocal軟件進行數據查看、定性和圖譜分析,使用軟件內置的IMS數據庫和Hanon數據庫進行物質定性分析;Gallery插件、Reporter插件和Dynamic PCA插件分別用于指紋圖譜的繪制、圖譜差異對比和主成分分析(principal component analysis,PCA)。SPSS 22.0軟件用于數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 牡丹花瓣發酵前后揮發性成分定性分析

圖1是不同發酵時間的牡丹花瓣GC-IMS二維圖譜,分離的每個點代表一種物質[16]。表1中顯示了通過GC-IMS技術在不同發酵時間的牡丹花瓣中共檢測出51種揮發性成分,定性檢出33種,其中包括醛類9種、醇類8種、萜烯類6種、酸類4種、酮類3種、吡嗪類2種、酯類1種。3-辛醇、2-呋喃甲醇、2-甲基-1-丁醇、順-3-己烯醇(葉醇)、己醛、α-蒎烯等物質在牡丹花香氣檢測的文章中鮮有報道[8-9]。

a-未發酵;b-發酵3 d;c-發酵5 d;d-發酵7 d;e-發酵9 d;f-發酵11 d

2.1.1 牡丹花發酵前后揮發性物質差異性分析

利用Vocal軟件內置的Reporter插件制作不同發酵時間牡丹花瓣樣品中揮發性物質差異圖譜(經過歸一化處理)。如圖2所示,選取未發酵的牡丹花瓣圖譜作為參比,若二者所含揮發性物質相似,扣除背景色后顯示為白色,若呈現藍色則代表該物質的濃度低于參比,若呈現紅色則代表該物質濃度高于參比[17]。圖2中可以看到發酵牡丹花瓣中出現了紅色斑點(圖2-a),隨著發酵時間的遷移,紅色斑點逐漸增多(圖2-c～圖2-f),這表明發酵過程中產生了揮發性物質并與發酵時間密切相關。

a-未發酵;b-發酵3 d;c-發酵5 d;d-發酵7 d;e-發酵9 d;f-發酵11 d

2.1.2 牡丹花發酵前后揮發性物質變化規律分析

為了更好地分析牡丹花瓣發酵過程中揮發性物質的變化規律,采用了指紋圖譜比較牡丹花發酵前后揮發性物質的差異,檢出但未能定性的揮發性物質用數字表示[18]。如圖3(a區域)所示,發酵前后牡丹花瓣含量相似的揮發性物質有2-己酮、2-呋喃甲醇、異戊醇、2-甲基丁酸甲酯、莰烯、丙醛、順式已烯-3-醇(葉醇)、2-庚酮、α-蒎烯、正壬醛等物質。圖3(b區域)顯示的是發酵后含量減少的物質,其中環己酮、2-甲基-1-丁醇和物質12是在發酵5 d開始減少,β-蒎烯、庚醛、戊烯酸、丁酸和物質4、13在發酵3 d開始減少,值得注意的是牡丹花瓣中的丁酸在發酵后(特別是5～11 d)完全消失,這表明牡丹花瓣的揮發性物質在發酵過程中可能發生了轉化。圖3(c區域)中2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和月桂烯等物質在發酵5 d后開始增加,2-乙基-1-己醇、2-甲基戊醇、2-糠醛和丙烯醛等物質在發酵3 d開始增加,然而3-辛醇只有在發酵11 d的牡丹花瓣中有明顯檢出。

2.1.3 牡丹花發酵前后主成分分析

PCA已經廣泛應用于食品品質控制中,它是通過將多個變量進行正交變換,將原有復雜信息簡化成少量綜合性指標的同時保證原信息損失少,進而在原始變量中闡明變量之間元素的突出關系[19]。如圖4所示,PC1和PC2貢獻值分別為65%和13%,解釋累積貢獻值為78%,能將未發酵、發酵3 d和發酵5～11 d的牡丹花瓣清晰區分,證明發酵前后的牡丹花瓣中揮發性物質有明顯區別,特別是發酵5～11 d。

a-沒食子酸的標準品色譜圖;b-兒茶素的標準品色譜圖;c-阿魏酸的標準品色譜圖;d-蘆丁的標準品色譜圖;e-沒食子酸的樣品色譜圖;f-兒茶素的樣品色譜圖;g-阿魏酸的樣品色譜圖;h-蘆丁的樣品色譜圖

2.2 牡丹花瓣發酵前后酚酸類物質變化

圖4是部分多酚物質標準品和樣品的液相色譜圖,所有樣品含量均在檢測范圍內。由表2可知,發酵前后的牡丹花瓣共有21種酚酸類物質檢出,不同組別的總酚酸物質呈現出先增加后緩慢降低的變化規律,發酵5 d時總酚酸含量最高為3 449.65 μg/g。其中沒食子酸,原兒茶酸,肉桂酸,異櫟素在發酵過程中一直呈現上升趨勢(P<0.05);兒茶素,原花青素B1、B2,丁香酸,綠原酸在添加“金花菌”種子液3 d后一直呈現下降趨勢(P<0.05),這表明通過“金花菌”發酵可以使牡丹花瓣中酚酸類物質發生轉化。然而,阿魏酸、蘆丁、咖啡酸、槲皮素、水楊酸、異鼠李素、山奈酚、對豆香酸和龍膽酸呈現先增加后減少的趨勢,其中,蘆丁在接種“金花菌”前后含量明顯升高(P<0.05),這有可能是“金花菌”自有的酚酸物質。值得注意的是,只有肉桂酸是通過“金花菌”發酵產生的;沒食子酸甲酯在發酵前后及發酵過程中沒有顯著性差異(P>0.05);表兒茶素和金絲桃苷發酵前后具有顯著性差異(P<0.05),但在發酵過程中無顯著動態變化(P>0.05)。

表2 發酵前后牡丹花瓣多酚種類及含量Table 2 Species and content of polyphenols in peony petals before and after fermentation

2.3 牡丹花發酵前后聚類分析

在面對較多數據指標時,單因素分析往往不能滿足綜合評價需求,這時就要考慮多因素分類分析[20]。聚類分析是將研究對象按照品質特性相似程度聚合在一起,并按照綜合性多品種聚合,最終完成分析過程[21]。采用TBTools[22]軟件對發酵前后牡丹花瓣酚酸類物質進行系統聚類分析,結果如圖6所示。發酵前后牡丹花瓣用21種酚酸含量作為聚類變量,樣品可分為3類,B、C、D即發酵3、5、7 d分為第一類,總酚含量較高,酚類物質較為豐富;E、F即發酵9、11 d為第二類,總酚含量略低,酚類物質主要由原兒茶酸、沒食子酸、金絲桃苷、肉桂酸和異櫟素提供;A即未發酵的牡丹花瓣為第三類,總酚含量最低,酚類物質主要有原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、丁香酸提供。PCA結果同樣能證明上述觀點,將牡丹花瓣發酵前后及發酵過程中多酚變化較好區分,PC1和PC2的累計貢獻率為78.5%。

a-聚類分析圖;b-PCA圖

3 結論

牡丹花作為藥食同源食材,其花瓣是揮發性物質和酚酸類物質的主要來源。利用GC-IMS技術和HPLC-MS技術可以對發酵前后的牡丹花瓣中揮發性成分進行檢測和分析。GC-IMS在6個樣品中共檢出51種揮發性成分,定性出33種,主要為醛類和醇類物質,其次為萜烯類和酸類物質。HPLC-MS技術在6個樣品中共檢出21種酚酸類物質,發酵5 d時總酚含量最高。利用PCA和聚類分析能將發酵前后和發酵不同階段的牡丹花瓣揮發性物質和酚酸類物質變化進行區分。綜上,發酵前后及發酵過程中的牡丹花揮發性物質和酚酸類物質含量有顯著性差異(P<0.05),并隨著發酵時間的遷移牡丹花瓣中揮發性物質和酚酸類物質發生動態變化。因此,采用聚類分析和PCA可以為發酵牡丹花瓣茶的加工利用和揮發性物質及酚酸類物質的動態變化研究提供可靠依據。