基于氣相色譜-離子遷移譜結合多元統(tǒng)計方法分析辣椒品種對辣椒油理化性質和風味物質的影響

楊芳,袁海彬,賈洪鋒,鄧鳳琳,王珍妮

(四川旅游學院 食品學院,四川 成都,610100)

氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)是一種近年來出現的新型氣相分離和檢測技術,具有分辨率高、靈敏度高等特點,特別適合于揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds, VOCs)的痕量檢測,在果蔬[1]、香辛料[2-3]、調味油[4]和菌類[5]等VOCs的檢測分析方面得到了廣泛的應用[6]。

辣椒(CapsicumannuumL.)屬茄科一年或多年生植物。辣椒中含有豐富的辣椒素、辣椒紅素、維生素C、多酚、類黃酮等物質[7-9],因而具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤等生物活性[8-12]。不同品種的辣椒在辣椒素含量、VOCs的種類及含量上有明顯差異[13-14]。辣椒油是用干辣椒和植物油制成的有獨特風味的調味油,具有香味濃郁、辣度適口的特點,在川菜的加工中具有舉足輕重的地位,深受人們的喜愛[15]。張洪新等[16]采用GC-MS對14種不同品種辣椒制成的辣椒油制品的揮發(fā)性香氣成分、辣椒素含量等進行了對比,結果發(fā)現樣品的香氣成分和辣椒素含量均存在差異。何小龍等[17]對4種辣椒和大豆油制備的辣椒油進行研究發(fā)現,辣椒品種對辣椒油中辣椒素和二氫辣椒素的含量影響顯著。石自彬等[18]對10種辣椒和花生油制備的辣椒油進行研究發(fā)現,辣椒油的揮發(fā)性風味成分中,酯類化合物含量最高;辣椒油的抗氧化效果隨貯藏時間延長而減弱,反復熬煮會使辣椒油的抗氧化效果減弱。然而,上述研究主要采用常規(guī)的GC-MS技術,對一些含量少但對風味至關重要的物質卻無法分析鑒定[4,19]。目前,采用GC-IMS分析辣椒品種對辣椒油中VOCs的影響的研究較少。

本研究通過HPLC和GC-IMS等檢測技術和方法,對5種辣椒(子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒)制備的辣椒油中辣椒素類物質含量、色差、過氧化值、VOCs進行檢測和分析,結合主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA)及熱圖聚類分析等多元統(tǒng)計方法,分析辣椒品種對辣椒油的理化性質和VOCs的影響,以對辣椒油的理化性質和風味品質進行更為科學、系統(tǒng)的評價,這將為不同品種辣椒制備辣椒油的品質評定和合理加工提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒品種:子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒;金龍魚玉米油,益海嘉里(重慶)糧油有限公司;精制食用鹽,四川省鹽業(yè)總公司。

冰乙酸、二氯甲烷、KI、Na2S2O3、可溶性淀粉、KIO3,均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Flavor Spec?型GC-IMS儀:含CTC自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件、GC×IMS Library Search軟件及軟件內置的NIST數據庫和IMS 數據庫對物質進行定性分析,德國G.A.S公司;戴安Ultimate 3000型HPLC儀,賽默飛世爾科技有限公司;IS128型萬分之一分析天平,上海西塘生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣椒油制備

參考文獻[17]的方法并稍作修改。

不同品種干紅辣椒→微波(功率1 000 W)加熱1 min→涼至室溫→粉碎→過篩(18目)→稱重(24 g)→加入食鹽(1 g)→混勻辣椒面,備用。玉米油(100 g)→熬制(180 ℃)→加入至辣椒面中→攪拌(約35 s)→自然降溫浸提(24 h)→編號(樣品編號PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ5,分別對應子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒5種辣椒制備的辣椒油樣品)→待測

自然浸提完成后,每個樣品取上層清油液,分別用于辣椒素類物質含量、色差值、過氧化值、VOCs的檢測,各平行測定3次。

1.3.2 辣椒素類物質含量的測定

參照GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質測定及辣度表示方法》[20],采用高效液相色譜法對辣椒油中辣椒素含量、二氫辣椒素含量、辣椒素類物質總量、斯科維爾指數和辣度進行測定,平行測定3次。

色譜柱Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)石英毛細管柱;流動相65%的甲醇水溶液;紫外光波長280 nm;流速1 mL/min;柱溫30 ℃。

1.3.3 色差的測定

利用色差儀測定不同樣品的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值,平行測定3次。

1.3.4 過氧化值的測定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中的滴定法[21],對辣椒油的過氧化值進行測定,平行測定3次。

1.3.5 VOCs的檢測

取1.5 g辣椒油樣品于20 mL頂空瓶中,80 ℃下孵化20 min后,頂空進樣,用GC-IMS儀進行測定;分析時間40 min;平行測定3 次,盲測1次。

自動進樣條件:孵化溫度80 ℃;孵化時間20 min;進樣方式頂空進樣;進樣體積500 μL;進樣針溫度85 ℃;振蕩方式加熱;孵化轉速500 r/min;不分流;清洗時間5 min。

GC條件:色譜柱WAX(30 m×0.53 mm×1 μm)石英毛細管柱;色譜柱溫度60 ℃;載氣N2(純度≥99.999%);IMS溫度45 ℃;載氣流速0～10 min,2 mL/min;10～20 min,10 mL/min;20～40 min,100 mL/min。

IMS條件:漂移管長度9.8 cm,漂移管溫度45 ℃,漂移氣為N2(純度≥99.999%),漂移氣流速150 mL/min。

1.3.6 數據處理

利用Flavor Spec?配備的 Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件及GC×IMS Library Search定性軟件對辣椒油樣品的VOCs進行采集和分析;利用軟件內置的 NIST數據庫和IMS數據庫對物質進行定性分析。

采用Excel和Origin進行數據的統(tǒng)計和繪圖;采用SPSS 26.0對樣品間差異采用ANOVA檢驗分析,利用Duncan方法進行顯著性差異分析,P<0.05,差異顯著;采用SIMCA 14.1進行PLS-DA;用R語言進行熱圖聚類分析;結果用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 辣椒品種對辣椒油中辣椒素類物質含量的影響

辣椒素類物質是辣椒堿類化合物的總稱,是辣椒油中的辛辣成分,屬于酰胺類化合物[22]。辣椒素具有調味、清除自由基、抗氧化、抗癌等活性[8-12],但大量攝入辣椒素會產生毒性,局部刺激導致呼吸道感染,并可能會增加某些癌癥的發(fā)生[12]。5種辣椒油的辣椒素類化合物含量如表1所示。

表1 辣椒油樣品的辣椒素類物質含量Table 1 Content of capsaicinoids in chili oil samples

由表1可知,5種辣椒油的辣椒素含量、二氫辣椒素含量、辣椒素類物質總量、斯科維爾指數、辣度順序均為PZ3>PZ4>PZ2>PZ5>PZ1;均為涮涮辣制備的辣椒油樣品(PZ3)顯著高于其余4種樣品(P<0.05)。PZ3辣椒素類物質總量高達(10.41±0.02) g/kg、辣度高達1 069.81±1.91,這與辣椒素等辣味物質的含量多少直接影響辣度[23]的結論一致。產生這些差異的原因,可能主要是辣椒品種的不同。因此,在選擇制作辣椒油的辣椒品種時,應根據產品對辣椒素類物質總量和辣度的不同需求來選擇。

2.2 辣椒品種對辣椒油色差的影響

由圖1可知,5種辣椒油的亮度(L*)依次為PZ3>PZ2>PZ5>PZ4>PZ1,PZ3最大,為45.57±1.49;PZ2次之,為45.11±0.01。PZ5紅度(a*)最高,PZ3黃度(b*)最高且與其余樣品間存在顯著性差異(P<0.05)。產生這些差異的原因,可能與不同品種辣椒自身所富集的辣椒紅素、β-胡蘿卜素等含量不同有關[7]。

圖1 辣椒油樣品的色差值Fig.1 Chromatic aberration value of chili oil samples 注:小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.3 辣椒品種對辣椒油過氧化值的影響

油脂的過氧化值是評價油脂氧化程度的關鍵指標[24]。由圖2可知,5種辣椒油的過氧化值依次為:PZ3

圖2 辣椒油樣品的過氧化值Fig.2 Peroxide value of chili oil samples

2.4 辣椒品種對辣椒油VOCs的影響

2.4.1 辣椒油VOCs的定性分析

對照GC×IMS Library Search內置的NIST數據庫和IMS數據庫,根據辣椒油VOCs的保留指數、保留時間和遷移時間進行定性分析,結果如表2所示。部分VOCs出現了二聚體,它們具有相近的保留時間和不同的遷移時間,這是GC-MS所檢測不出的[26]。5種樣品中共檢測出73種VOCs,94個信號峰,分別為醇類12種(二聚體3種)、醛類19種(二聚體5種)、酮類12種(二聚體3種)、羧酸類4種(二聚體3種)、酯類18種(二聚體5種)、雜環(huán)類6種(二聚體2種)、硫醚類2種。其中醛類(二乙醇縮乙醛、己醛、3-甲基丁醛、丙烯醛等)種類最多且含量高,閾值低[27],對辣椒油風味貢獻大;其中,己醛主要來源于植物油的氧化[28],可為辣椒油提供青香和脂肪香;來源于異亮氨酸的Strecker降解[29]的3-甲基丁醛可為辣椒油提供果香。酯類物質主要來源于醇類和酸類化合物所發(fā)生的酯化反應[30],如乙酸乙酯、異戊酸己酯等酯類物質,可為辣椒油提供果香、青香。脂肪氧化的另一產物酮類[31]在辣椒油中含量也較高。此外,乙酸、丙酸等具有酸味的物質是辣椒油中的“異味”物質,降低“異味”物質的含量可使辣椒油風味得到提升[15]。

表2 辣椒油樣品已定性揮發(fā)性有機化合物Table 2 Identified VOCs in chili oil samples

2.4.2 辣椒油VOCs的GC-IMS二維差異圖

圖3是以PZ1為參照,其余譜圖扣除PZ1中的信號峰,得到的GC-IMS二維平面差異譜圖。

圖3 辣椒油樣品的GC-IMS二維差異圖Fig.3 GC-IMS two-dimensional qualitative topographic diffence plots

整個二維譜圖背景為藍色,橫坐標1.0處為反應離子(reactive ion peak,RIP)峰,RIP峰兩側的每一個點均代表一種VOC,白色表示VOC濃度較低,紅色表示濃度較高,顏色越深表示濃度越大。由圖3可知,矩形區(qū)域紅色VOCs的含量相對于PZ1高,橢圓形區(qū)域藍色VOCs的含量相對于PZ1低;PZ3、PZ4和PZ5的VOCs種類及含量與PZ1差異較大,PZ1和PZ2的VOCs種類和含量相近。

2.4.3 辣椒油VOCs的GC-IMS指紋圖譜

指紋圖譜(圖4)可以直觀地呈現5種辣椒油VOCs之間的差異,整個圖背景為藍色,Y軸為樣品編號(每1行為1個樣品的指紋圖譜),X軸為VOCs的名稱或編號,圖中點的顏色深淺和點的面積表示VOCs含量的高低,顏色越深面積越大則含量越高,即白色點表示VOCs含量低,紅色點表示含量高[1]。

圖4 辣椒油樣品的指紋譜圖Fig.4 Fingerprint spectra of chili oil samples注:21種未定性的VOCs以阿拉伯數字進行編號(下同)。

結合表2和圖4可知,5種樣品共有且含量較高的VOCs集中在A(A1～A4)區(qū)域,包括3-甲基丁醛、2-甲基丙醛、庚醛、2,3-戊二酮、環(huán)己酮、1-辛烯-3-酮、2,5-二甲基吡嗪、甲基吡嗪、(Z)-3-己烯醇、二氫-2(3H)-呋喃酮等,為辣椒油貢獻辛辣味、脂肪香、青香、果香、花香等總體風味特征。B(B1～B2)區(qū)域,包括異戊酸己酯、異丁酸己酯、己酸異戊酯、丁酸己酯、異戊酸異戊酯、2-甲基丁酸丁酯、異戊酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸葉醇酯、丙酸異戊酯、苯甲醛、丙烯醛、糠醛、壬醛、糠醇、1-己醇等,多數為酯類,在PZ3中含量高且與其余4種樣品間存在顯著性差異(P<0.05),所以PZ3果香味濃,風味最為特別。C區(qū)域的乙酸丁酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯在PZ4中含量高且與其余樣品間存在顯著性差異(P<0.05),可能為PZ4與其余樣品香氣的差異所在。D區(qū)域的(E)-2-戊烯醛、乙酸甲酯、丁酸乙酯、辛醛在PZ5中含量高,可能為PZ5的主要差異VOCs。PZ1和PZ2的VOCs接近。

2.4.4 辣椒油樣品VOCs的PCA

利用Flavor Spec?配備的LAV軟件對5種辣椒油樣品所有的VOCs進行PCA,結果如圖5所示。由圖5可知,第1主成分(58%)和第2主成分(19%)占方差的77%,能反映樣品的總體特征[32]。PZ3與其余樣品的距離非常遠,可以根據第1主成分進行區(qū)分;其次,PZ5、PZ4分別與PZ1和PZ2的距離較遠,可以根據第2主成分將PZ5、PZ4與PZ1和PZ2進行區(qū)分;PZ1和PZ2在第1與第2主成分上均接近,但各自成組;盲樣(圖中5個黑點)均準確地落在相應的組別中。因此,使用GC-IMS結合PCA,可將5種辣椒油樣品的VOCs進行較好地判別和區(qū)分。

圖5 辣椒油樣品的PCA結果Fig.5 PCA results of chili oil samples

2.4.5 辣椒油樣品VOCs的PLS-DA結果

PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸算法的有監(jiān)督的分析方法,可實現復雜數據的可視化、判別分析和預測[33]。在PLS-DA中使用7倍交叉驗證和200次隨機重分類對辣椒油VOCs進行建模、因子載荷分析和變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)計算。利用SIMCA 14.1軟件對5種辣椒油所有VOCs進行PLS-DA,結果如圖6所示。

a-PLS-DA置換圖;b-因子載荷圖

由圖6-a可知,RX2=0.977,RY2=0.992,Q2=0.972,說明該模型較可靠,能對5種辣椒油樣品的風味進行較好的預測。根據PLS-DA因子載荷圖對5種辣椒油重要的香氣成分進行分析,如圖6-b所示,PZ3的香氣物質主要為酯類,包括E10(異戊酸己酯-D)、E13(異丁酸己酯)、E7(己酸異戊酯)、E12(丁酸己酯-D)等,因此PZ3果香味濃郁。PZ4的主要香氣成分有E1(乙酸丁酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E21(丙酸乙酯)等;PZ5的主要香氣成分有B11[(E)-2-戊烯醛-M]、F6(2,5-二甲基吡嗪)、E5(乙酸甲酯)等;C11(1-戊烯-3-酮-D)、C7(2-庚酮)等是PZ1的主要香氣成分,PZ1和PZ2風味相似。

VIP可用于篩選對香氣輪廓有重要影響的關鍵差異標志物[33]。如圖7-a所示,26種VOCs的VIP>1.0(共32個峰),分別為E4(乙酸乙酯)、E10(異戊酸己酯)、B18(二乙醇縮乙醛)、D7(乙酸-D)、B14(己醛-D)、G2(二甲基硫醚)、B17(3-甲基丁醛)、E23(二氫-2(3H)-呋喃酮)、C2(1-羥基-2-丙酮)、C14(丙酮)、1、D2(丁酸-M)、B20(丙烯醛)、A4(3-甲基-1-丁醇)、D4(異丁酸-M)、E21(丙酸乙酯)、F1(糠醇-M)、B21(丙醛)、C11(1-戊烯-3-酮)、B19(丁醛)、A11(乙醇)、E7(己酸異戊酯-M)、C15(丁二酮)、E11(丁酸己酯-M)、B16(戊醛-D)、F4(糠醛-M),VIP值越大,則差異越顯著。由圖7-b可知,E9(異戊酸己酯-M)、E10(異戊酸己酯-D)、E11(丁酸己酯-M)、F1(糠醇-M)、E7(己酸異戊酯-M)、D7(乙酸-D)、B17(3-甲基丁醛)、B16(戊醛-D)等物質對第1主成分貢獻較大;E21(丙酸乙酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E4(乙酸乙酯)、B19(丁醛)、B18(二乙醇縮乙醛)對第2主成分貢獻較大。

a-VIP值圖;b-載荷圖;c-聚類熱圖

為了直觀區(qū)分特征差異標志物(VIP>1.0)在5種辣椒油中的變化,根據篩選出的26種特征差異標志物的峰強度繪制聚類熱圖(圖7-c)。由圖7-c可知,PZ3最先分組,風味最為特別,E10(異戊酸己酯)、E11(丁酸己酯-M)、E7(己酸異戊酯-M)、B20(丙烯醛)、B16(戊醛-D)等物質在PZ3中含量高;PZ5中 C11(1-戊烯-3-酮)、B21(丙醛)、C15(丁二酮)含量高而再分組;PZ4中E4(乙酸乙酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E21(丙酸乙酯)含量高;PZ1和PZ2聚類而風味相似。該結果與GC-IMS二維差異圖、指紋圖譜和PCA結果一致。

3 結論

本研究采用HPLC和GC-IMS等檢測技術,對5種辣椒(子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒)制備的辣椒油進行了辣椒素類物質含量、色差、過氧化值、VOCs的檢測和分析,辣椒的品種對制成的辣椒油中辣椒素類物質含量、色差、過氧化值、VOCs均有影響。結果表明,5種辣椒油辣度有顯著性差異(P<0.05),其中PZ3的辣椒素類物質總量、辣度顯著高于其他樣品,PZ4其次,PZ1最低;PZ3亮度L*和黃度b*最高;5種辣椒油的過氧化值呈現出隨著辣椒油中辣椒素類物質總量的增加而降低的趨勢,PZ3過氧化值最低,辣椒素類物質總量最高;經GC-IMS共分離鑒定出73種VOCs,包括醛類19種、酯類18種、酮類12種、醇類12種、雜環(huán)類6種、羧酸類4種和硫醚類2種;其中,GC-IMS二維差異圖和指紋圖譜顯示,PZ3樣品VOCs種類多含量高,風味最為獨特,PZ1和PZ2風味接近;通過PLS-DA進一步分析發(fā)現,PZ3與其余樣品的特征差異香氣物質主要為酯類,包括異戊酸己酯-D、異丁酸己酯、己酸異戊酯、丁酸己酯-D等;經變量重要性投影分析篩選出5種辣椒油的26種關鍵差異標志物(VIP>1.0),包括E4(乙酸乙酯)、E10(異戊酸己酯)、B18(二乙醇縮乙醛)、D7(乙酸-D)、B14(己醛-D)、G2(二甲基硫醚)、B17(3-甲基丁醛)等,其中E9(異戊酸己酯-M)、E10(異戊酸己酯-D)、E11(丁酸己酯-M)、F1(糠醇-M)、E7(己酸異戊酯-M)、D7(乙酸-D)、B17(3-甲基丁醛)、B16(戊醛-D)等物質,對第1主成分貢獻較大;E21(丙酸乙酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E4(乙酸乙酯)、B19(丁醛)、B18(二乙醇縮乙醛)對第2主成分貢獻較大。PCA結果、聚類熱圖分析結果與GC-IMS二維差異圖和指紋圖譜結果一致。研究結果將為合理選用辣椒品種,工業(yè)化制備辣椒油提供一定的理論支撐。